摘 要：本发明公开了一种罗布麻提取物的制备方法，包括：步骤一、将罗布麻叶预处理后经粉末化过20～40目筛，得罗布麻粉末备用；步骤二、用体积浓度50～70％的酸性乙醇溶液在常温下回流提取步骤一所得罗布麻粉末2～3次，离心得滤液和滤渣；步骤三、向步骤二所得滤渣中加入果胶酶、纤维素酶和没过滤渣的蒸馏水在50～70℃酶解2～3h得酶解质，其中果胶酶和纤维素酶的总量为罗布麻粉末质量的1～4％，果胶酶和纤维素酶的质量比为1：3～6；步骤四、将步骤三酶解质用体积浓度为70～90％的碱性乙醇溶液在50～60℃下回流提取2～3次，离心取上层清液，即为罗布麻粗提物。本发明总黄酮收率最高可达4.31％，其中槲皮素含量占罗布麻粗提物71.32％。
权利要求书
1.罗布麻提取物的制备方法，其特征在于，包括：
步骤一、将罗布麻叶预处理后经粉末化过20～40目筛，得罗布麻粉末备用；
步骤二、用体积浓度50～70％的酸性乙醇溶液在常温下回流提取步骤一所得罗布麻粉末2～3次，离心得滤液和滤渣；
步骤三、向步骤二所得滤渣中加入果胶酶、纤维素酶和没过滤渣的蒸馏水在50～70℃酶解2～3h得酶解质，其中果胶酶和纤维素酶的总量为罗布麻粉末质量的1～4％，果胶酶和纤维素酶的质量比为1：3～6；
步骤四、将步骤三酶解质用体积浓度为70～90％的碱性乙醇溶液在50～60℃下回流提取2～3次，离心取上层清液，即为罗布麻粗提物。
2.如权利要求1所述的罗布麻提取物的制备方法，其特征在于，步骤一中所述预处理具体为：
第一步、将罗布麻叶低温冷冻至脆化；
第二步、将脆化后的罗布麻叶干燥至含水率不超过15～25％；
第三步、将干燥过的罗布麻叶在0.01～0.1MPa的压力条件下超低压爆破，其中低温冷冻的温度范围为 40℃～ 20℃。
3.如权利要求2所述的罗布麻提取物的制备方法，其特征在于，步骤一中罗布麻叶经粉末化后先用石油醚浸泡12～24h，干燥后过20～40目筛。
4.如权利要求3所述的罗布麻提取物的制备方法，其特征在于，还包括对步骤四所得罗布麻粗提物精制得罗布麻提取物的步骤，具体为：将步骤四所得罗布麻粗提物减压浓缩至原体积的15～25％，再将浓缩液上大孔树脂柱用水洗脱至洗脱液澄清，最后收集洗脱液，回收乙醇后干燥得罗布麻提取物。
5.如权利要求所述4的罗布麻提取物的制备方法，其特征在于，所述酸性乙醇溶液和碱性乙醇溶液中还加有氢键给体。
6.如权利要求5所述的罗布麻提取物的制备方法，其特征在于，所述氢键给体为甘油。
7.如权利要求6所述的罗布麻提取物的制备方法，其特征在于，步骤二所述酸性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加稀盐酸至pH为5～6的溶液。
8.如权利要求7所述的罗布麻提取物的制备方法，其特征在于，步骤四中碱性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加尼泊金酯钠至pH为8～10的溶液。
9.如权利要求8所述的罗布麻提取物的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂的型号为D101、D130、AB8和NKA中的一种。
10.如权利要求1所述的罗布麻提取物的制备方法，其特征在于，步骤二中罗布麻粉末和酸性乙醇溶液的料液比(w/v)为1：20～25；步骤四中碱性乙醇溶液的体积是步骤二中酸性乙醇溶液体积的2～3倍。
技术领域
本发明涉及天然植物提取物的制备领域。更具体地说，本发明涉及一种罗布麻提取物的制备方法。
背景技术
罗布麻，别称红麻、茶叶花、红柳子等，为夹竹桃科罗布麻属直立半灌木，其生长环境主要是盐碱荒地、沙漠边缘及河流两岸、冲积平原、湖泊周围、戈壁荒滩上，在我国主要分布于华北、西北及吉林、辽宁、山东、江苏、安徽、河南等地。罗布麻除了其茎杆中的纤维可用作高档纺织原料外，其叶中富含黄酮，黄酮能清除心血管中垃圾和自由基，去除细菌、寄生虫，修复呼吸道组织和皮肤受损组织，诱导肿瘤细胞凋亡，修复机体组织，促进新陈代谢，平衡机体内营养、快速降低血糖，而槲皮素是黄酮类化学物家族中具有重要价值的一种成分，其在罗布麻叶中含量尤其丰富，且槲皮素具有特殊的抗氧化、抗发炎、抗过敏、抗病毒、清除自由基和调节免疫活性的功效。现有提取技术对罗布麻叶中总黄酮以及槲皮素的提取率低，存在很大的改进空间。
申请号为201911283088.1、名称为一种基于罗布麻组合药物成分的提取方法的发明专利中，其黄酮总提取率最高为2.75％；申请号为200510123187.5、名称为罗布麻属植物罗布麻叶总黄酮提取物、其制备及应用的发明专利中，其一个实施例中罗布麻叶总黄酮提取物A收得率为1.2％，其中槲皮素含量为2.07％，罗布麻叶总黄酮提取物B收得率为0.6％，其中槲皮素2.95％；另一实施例中罗布麻叶总黄酮提取物A收得率为1.7％，其中槲皮素含量为0.87％，罗布麻叶总黄酮提取物B收得率为0.4％，其中槲皮素1.5％；第三实施例中罗布麻叶总黄酮提取物A收得率为1.4％，其中槲皮素含量为2.6％，罗布麻叶总黄酮提取物B收得率为0.65％，其中槲皮素2.1％。相对于罗布麻叶中总黄酮含量和槲皮素含量，现有提取方法的收率低。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种罗布麻提取物的制备方法，其总黄酮收率最高可达4.31％，其中槲皮素含量占罗布麻粗提物71.32％。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种罗布麻提取物的制备方法，包括：
步骤一、将罗布麻叶预处理后经粉末化过20～40目筛，得罗布麻粉末备用；
步骤二、用体积浓度50～70％的酸性乙醇溶液在常温下回流提取步骤一所得罗布麻粉末2～3次，离心得滤液和滤渣；
步骤三、向步骤二所得滤渣中加入果胶酶、纤维素酶和没过滤渣的蒸馏水在50～70℃酶解2～3h得酶解质，其中果胶酶和纤维素酶的总量为罗布麻粉末质量的1～4％，果胶酶和纤维素酶的质量比为1：3～6；
步骤四、将步骤三酶解质用体积浓度为70～90％的碱性乙醇溶液在50～60℃下回流提取2～3次，离心取上层清液，即为罗布麻粗提物。
优选的是，步骤一中所述预处理具体为：
第一步、将罗布麻叶低温冷冻至脆化；
第二步、将脆化后的罗布麻叶干燥至含水率不超过15～25％；
第三步、将干燥过的罗布麻叶在0.01～0.1MPa的压力条件下超低压爆破，其中低温冷冻的温度范围为 40℃～ 20℃。
优选的是，步骤一中罗布麻叶经粉末化后先用石油醚浸泡12～24h，干燥后过20～40目筛。
优选的是，所述罗布麻提取物的制备方法还包括对步骤四所得罗布麻粗提物精制得罗布麻提取物的步骤，具体为：将步骤四所得罗布麻粗提物减压浓缩至原体积的15～25％，再将浓缩液上大孔树脂柱用水洗脱至洗脱液澄清，最后收集洗脱液，回收乙醇后干燥得罗布麻提取物。
优选的是，所述酸性乙醇溶液和碱性乙醇溶液中还加有氢键给体。
优选的是，所述氢键给体为甘油。
优选的是，步骤二所述酸性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加稀盐酸至pH为5～6的溶液。
优选的是，步骤四中碱性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加尼泊金酯钠至pH为8～10的溶液。
优选的是，所述大孔树脂的型号为D101、D130、AB8和NKA中的一种。
优选的是，步骤二中罗布麻粉末和酸性乙醇溶液的料液比(w/v)为1：20～25；步骤四中碱性乙醇溶液的体积是步骤二中酸性乙醇溶液体积的2～3倍。
本发明至少包括以下有益效果：
其一、本发明提供的罗布麻提取物的制备方法所得总黄酮收率最高可达4.31％，其中槲皮素含量占罗布麻粗提物71.32％；
其二、本发明提供的罗布麻提取物的制备方法中首次提出酸性乙醇和碱性乙醇梯度提取法，极大地提高了罗布麻叶中总黄酮和槲皮素的提取率；
其三、本发明提供的罗布麻提取物的制备方法中提出利用生物酶将芦丁转化成槲皮素，进而提高罗布麻叶提取物中槲皮素的含量；
其四、本发明提供的罗布麻提取物的制备方法中通过添加可食用尼泊金酯钠既可以达到提高提取率的作用，又可以灭掉在先步骤中添加的酶的活性，还可以延长罗布麻提取物的贮藏效期。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。本发明的常温为《中华人民共和国药典》规定的10～30℃。
实施例1
罗布麻提取物的制备方法如下：
步骤一、将罗布麻叶预处理后经粉末化过40目筛，得罗布麻粉末备用；
步骤二、用体积浓度70％的酸性乙醇溶液在常温下回流提取步骤一所得罗布麻粉末2次，离心得滤液和滤渣；其中酸性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加稀盐酸至pH为6的溶液；
步骤三、向步骤二所得滤渣中加入果胶酶、纤维素酶和没过滤渣的蒸馏水在50℃酶解2h得酶解质，其中果胶酶和纤维素酶的总量为罗布麻粉末质量的1％，果胶酶和纤维素酶的质量比为1：3；
步骤四、将步骤三酶解质用体积浓度为70％的碱性乙醇溶液在60℃下回流提取2次，离心取上层清液，即为罗布麻粗提物；其中碱性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加尼泊金酯钠至pH为8的溶液；
步骤五、对步骤四所得罗布麻粗提物精制得罗布麻提取物的步骤，具体为：将步骤四所得罗布麻粗提物减压浓缩至原体积的15％，再将浓缩液上大孔树脂柱用水洗脱至洗脱液澄清，最后收集洗脱液，回收乙醇后干燥得罗布麻提取物。
实施例2
罗布麻提取物的制备方法如下：
步骤一、将罗布麻叶预处理后经粉末化过40目筛，得罗布麻粉末备用；其中，所述预处理步骤为：
第一步、将罗布麻叶低温冷冻至脆化；
第二步、将脆化后的罗布麻叶干燥至含水率不超过15％；
第三步、将干燥过的罗布麻叶在0.01MPa的压力条件下超低压爆破，其中低温冷冻的温度范围为 40℃；
步骤二、用体积浓度70％的酸性乙醇溶液在常温下回流提取步骤一所得罗布麻粉末2次，离心得滤液和滤渣；其中酸性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加稀盐酸至pH为6的溶液；
步骤三、向步骤二所得滤渣中加入果胶酶、纤维素酶和没过滤渣的蒸馏水在50℃酶解2h得酶解质，其中果胶酶和纤维素酶的总量为罗布麻粉末质量的1％，果胶酶和纤维素酶的质量比为1：3；
步骤四、将步骤三酶解质用体积浓度为70％的碱性乙醇溶液在60℃下回流提取2次，离心取上层清液，即为罗布麻粗提物；其中碱性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加尼泊金酯钠至pH为8的溶液；
步骤五、对步骤四所得罗布麻粗提物精制得罗布麻提取物的步骤，具体为：将步骤四所得罗布麻粗提物减压浓缩至原体积的15％，再将浓缩液上大孔树脂柱用水洗脱至洗脱液澄清，最后收集洗脱液，回收乙醇后干燥得罗布麻提取物。
实施例3
罗布麻提取物的制备方法如下：
步骤一、将罗布麻叶预处理后经粉末化后，用石油醚浸泡12h，干燥后过40目筛，得罗布麻粉末备用；其中，所述预处理步骤为：
第一步、将罗布麻叶低温冷冻至脆化；
第二步、将脆化后的罗布麻叶干燥至含水率不超过15％；
第三步、将干燥过的罗布麻叶在0.01MPa的压力条件下超低压爆破，其中低温冷冻的温度范围为 40℃；
步骤二、用体积浓度70％的酸性乙醇溶液在常温下回流提取步骤一所得罗布麻粉末2次，离心得滤液和滤渣；其中酸性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加稀盐酸至pH为6的溶液；
步骤三、向步骤二所得滤渣中加入果胶酶、纤维素酶和没过滤渣的蒸馏水在50℃酶解2h得酶解质，其中果胶酶和纤维素酶的总量为罗布麻粉末质量的1％，果胶酶和纤维素酶的质量比为1：3；
步骤四、将步骤三酶解质用体积浓度为70％的碱性乙醇溶液在60℃下回流提取2次，离心取上层清液，即为罗布麻粗提物；其中碱性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加尼泊金酯钠至pH为8的溶液；
步骤五、对步骤四所得罗布麻粗提物精制得罗布麻提取物的步骤，具体为：将步骤四所得罗布麻粗提物减压浓缩至原体积的15％，再将浓缩液上大孔树脂柱用水洗脱至洗脱液澄清，最后收集洗脱液，回收乙醇后干燥得罗布麻提取物。
实施例4
罗布麻提取物的制备方法如下：
步骤一、将罗布麻叶预处理后经粉末化后，用石油醚浸泡12h，干燥后过40目筛，得罗布麻粉末备用；其中，所述预处理步骤为：
第一步、将罗布麻叶低温冷冻至脆化；
第二步、将脆化后的罗布麻叶干燥至含水率不超过15％；
第三步、将干燥过的罗布麻叶在0.01MPa的压力条件下超低压爆破，其中低温冷冻的温度范围为 40℃；
步骤二、用体积浓度70％的酸性乙醇溶液在常温下回流提取步骤一所得罗布麻粉末2次，离心得滤液和滤渣；其中酸性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加稀盐酸至pH为6的溶液，且酸性乙醇溶液和还加有氢键给体甘油；
步骤三、向步骤二所得滤渣中加入果胶酶、纤维素酶和没过滤渣的蒸馏水在50℃酶解2h得酶解质，其中果胶酶和纤维素酶的总量为罗布麻粉末质量的1％，果胶酶和纤维素酶的质量比为1：3；
步骤四、将步骤三酶解质用体积浓度为70％的碱性乙醇溶液在60℃下回流提取2次，离心取上层清液，即为罗布麻粗提物；其中碱性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加尼泊金酯钠至pH为8的溶液，且碱性乙醇溶液和还加有氢键给体甘油；
步骤五、对步骤四所得罗布麻粗提物精制得罗布麻提取物的步骤，具体为：将步骤四所得罗布麻粗提物减压浓缩至原体积的15％，再将浓缩液上大孔树脂柱用水洗脱至洗脱液澄清，最后收集洗脱液，回收乙醇后干燥得罗布麻提取物。
实施例5
罗布麻提取物的制备方法如下：
步骤一、将罗布麻叶预处理后经粉末化后，用石油醚浸泡24h，干燥后过20目筛，得罗布麻粉末备用；其中，所述预处理步骤为：
第一步、将罗布麻叶低温冷冻至脆化；
第二步、将脆化后的罗布麻叶干燥至含水率不超过25％；
第三步、将干燥过的罗布麻叶在0.1MPa的压力条件下超低压爆破，其中低温冷冻的温度范围为 20℃；
步骤二、用体积浓度50％的酸性乙醇溶液在常温下回流提取步骤一所得罗布麻粉末3次，离心得滤液和滤渣；其中酸性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加稀盐酸至pH为5的溶液，且酸性乙醇溶液和还加有氢键给体甘油；
步骤三、向步骤二所得滤渣中加入果胶酶、纤维素酶和没过滤渣的蒸馏水在70℃酶解3h得酶解质，其中果胶酶和纤维素酶的总量为罗布麻粉末质量的4％，果胶酶和纤维素酶的质量比为1：6；
步骤四、将步骤三酶解质用体积浓度为90％的碱性乙醇溶液在50℃下回流提取3次，离心取上层清液，即为罗布麻粗提物；其中碱性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加尼泊金酯钠至pH为10的溶液，且碱性乙醇溶液和还加有氢键给体甘油；
步骤五、对步骤四所得罗布麻粗提物精制得罗布麻提取物的步骤，具体为：将步骤四所得罗布麻粗提物减压浓缩至原体积的25％，再将浓缩液上大孔树脂柱用水洗脱至洗脱液澄清，最后收集洗脱液，回收乙醇后干燥得罗布麻提取物。
对比例1
罗布麻提取物的制备方法如下：
步骤一、将罗布麻叶预处理后经粉末化过40目筛，得罗布麻粉末备用；
步骤二、用体积浓度70％的乙醇溶液在常温下回流提取步骤一所得罗布麻粉末4次，离心得滤液和滤渣；取滤液即为罗布麻粗提物；
步骤三、对步骤二所得罗布麻粗提物精制得罗布麻提取物的步骤，具体为：将步骤四所得罗布麻粗提物减压浓缩至原体积的15％，再将浓缩液上大孔树脂柱用水洗脱至洗脱液澄清，最后收集洗脱液，回收乙醇后干燥得罗布麻提取物。
对比例2
罗布麻提取物的制备方法如下：
步骤一、将罗布麻叶预处理后经粉末化过40目筛，得罗布麻粉末备用；
步骤二、用体积浓度70％的酸性乙醇溶液在常温下回流提取步骤一所得罗布麻粉末2次，离心得滤液和滤渣；其中酸性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加稀盐酸至pH为6的溶液；
步骤三、将步骤二所得滤渣用体积浓度为70％的碱性乙醇溶液在60℃下回流提取2次，离心取上层清液，即为罗布麻粗提物；其中碱性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加尼泊金酯钠至pH为8的溶液；
步骤四、对步骤三所得罗布麻粗提物精制得罗布麻提取物的步骤，具体为：将步骤四所得罗布麻粗提物减压浓缩至原体积的15％，再将浓缩液上大孔树脂柱用水洗脱至洗脱液澄清，最后收集洗脱液，回收乙醇后干燥得罗布麻提取物。
对比例3
罗布麻提取物的制备方法如下：
步骤一、将罗布麻叶预处理后经粉末化过40目筛，得罗布麻粉末备用；
步骤二、用体积浓度70％乙醇溶液在常温下回流提取步骤一所得罗布麻粉末2次，离心得滤液和滤渣；
步骤三、向步骤二所得滤渣中加入果胶酶、纤维素酶和没过滤渣的蒸馏水在50℃酶解2h得酶解质，其中果胶酶和纤维素酶的总量为罗布麻粉末质量的1％，果胶酶和纤维素酶的质量比为1：3；
步骤四、将步骤三酶解质用体积浓度为70％的乙醇溶液在60℃下回流提取2次，离心取上层清液，即为罗布麻粗提物；
步骤五、对步骤四所得罗布麻粗提物精制得罗布麻提取物的步骤，具体为：将步骤四所得罗布麻粗提物减压浓缩至原体积的15％，再将浓缩液上大孔树脂柱用水洗脱至洗脱液澄清，最后收集洗脱液，回收乙醇后干燥得罗布麻提取物。
对比例4
罗布麻提取物的制备方法如下：
步骤一、将罗布麻叶预处理后经粉末化过40目筛，得罗布麻粉末备用；
步骤二、用体积浓度70％的酸性乙醇溶液在常温下回流提取步骤一所得罗布麻粉末2次，离心得滤液和滤渣；其中酸性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加稀盐酸至pH为6的溶液；
步骤三、将步骤二所得滤渣采用体积浓度为70％的碱性乙醇溶液在60℃下回流提取2次，离心取上层清液并合并；其中碱性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加尼泊金酯钠至pH为8的溶液；
步骤四、向步骤三所得滤渣中加入果胶酶、纤维素酶和没过滤渣的蒸馏水在50℃酶解2h得酶解质，其中果胶酶和纤维素酶的总量为罗布麻粉末质量的1％，果胶酶和纤维素酶的质量比为1：3；
将步骤三酶解质用体积浓度为70％的碱性乙醇溶液在60℃下回流提取2次，离心取上层清液，即为罗布麻粗提物；其中碱性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加尼泊金酯钠至pH为8的溶液；
步骤五、对对步骤三所得合并液和步骤四所得酶解液精制得罗布麻提取物的步骤，具体为：将对步骤三所得合并液和步骤四所得酶解液减压浓缩至原体积的15％，再将浓缩液上大孔树脂柱用水洗脱至洗脱液澄清，最后收集洗脱液，回收乙醇后干燥得罗布麻提取物。
对比例5
罗布麻提取物的制备方法如下：
步骤一、将罗布麻叶预处理后经粉末化过40目筛，得罗布麻粉末备用；
步骤二、用体积浓度70％的碱性乙醇溶液在常温下回流提取步骤一所得罗布麻粉末2次，离心得滤液和滤渣；其中碱性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加尼泊金酯钠至pH为8的溶液；
步骤三、向步骤二所得滤渣中加入果胶酶、纤维素酶和没过滤渣的蒸馏水在50℃酶解2h得酶解质，其中果胶酶和纤维素酶的总量为罗布麻粉末质量的1％，果胶酶和纤维素酶的质量比为1：3；
步骤四、将步骤三酶解质用体积浓度为70％的酸性乙醇溶液在60℃下回流提取2次，离心取上层清液，即为罗布麻粗提物；其中酸性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加稀盐酸至pH为6的溶液；
步骤五、对步骤四所得罗布麻粗提物精制得罗布麻提取物的步骤，具体为：将步骤四所得罗布麻粗提物减压浓缩至原体积的15％，再将浓缩液上大孔树脂柱用水洗脱至洗脱液澄清，最后收集洗脱液，回收乙醇后干燥得罗布麻提取物。
对比例6
罗布麻提取物的制备方法如下：
步骤一、将罗布麻叶预处理后经粉末化过40目筛，得罗布麻粉末备用；
步骤二、向罗布麻粉末中加入果胶酶、纤维素酶和没过罗布麻粉末的蒸馏水在50℃酶解2h得酶解质，其中果胶酶和纤维素酶的总量为罗布麻粉末质量的1％，果胶酶和纤维素酶的质量比为1：3；
步骤三、用体积浓度70％的酸性乙醇溶液在常温下回流提取步骤二所得酶解质2次，离心得滤液和滤渣；其中酸性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加稀盐酸至pH为6的溶液；
步骤四、将步骤三所得滤渣用体积浓度为70％的碱性乙醇溶液在60℃下回流提取2次，离心取上层清液，即为罗布麻粗提物；其中碱性乙醇溶液是通过向乙醇溶液中加尼泊金酯钠至pH为8的溶液；
步骤五、对步骤四所得罗布麻粗提物精制得罗布麻提取物的步骤，具体为：将步骤四所得罗布麻粗提物减压浓缩至原体积的15％，再将浓缩液上大孔树脂柱用水洗脱至洗脱液澄清，最后收集洗脱液，回收乙醇后干燥得罗布麻提取物。
计算实施例1～5和对比例1～3中总黄酮的收率和罗布麻提取物中槲皮素含量。其中槲皮素含量的测定方法如下：供试品溶液的制备：精确称取实施例1～5和对比例1～3所得罗布麻提取物10mg于50mL量瓶中，加入80％的甲醇溶解定容，取10mL溶解液加入1mL盐酸回流水解1h后，定容至20mL得供试液，备用。
色谱条件：固定相ODS柱(4.6mmI.D.╳150mm，5μm)；流动相：甲醇：0.4％磷酸(50：50)；流速：1mL/min；检测波长360nm；进样量：10～20μl，所得HPLC图谱中保留时间(min)为10的为槲皮素。
总黄酮收率的测定方法如下：对照样品溶液制备：精确称取金丝桃苷对照品(120℃下减压干燥至恒重)适量，用甲醇配置成1mL含0.06mg的溶液。
供试品溶液的制备：精确称取实施例1～5和对比例1～3所得罗布麻提取物10mg于50mL量瓶中，加入80％的甲醇溶解定容，备用。
测定方法：取对照样品溶液和供试品溶液，置于10mL容量瓶中，用甲醇加至5mL，经AlCl3和乙酸钠显色后，按分光光度法，在400nm处测定吸光度，利用对照样品绘制线性回归曲线，从而计算供试品中溶液中总黄酮的含量，再进一步计算总黄酮的收率。所得结果如表1所示。
表1总黄酮的收率及槲皮素含量数据
相对于实施例1的制备方法，实施例2的制备方法中增加了冷冻和低压爆破的预处理步骤，实施例3的制备方法相对与实施例2的制备方法又增加了对罗布麻粉末用石油醚浸泡的步骤，实施例4的制备方法相对于实施例3的制备方法又增加了在酸性乙醇溶液和碱性乙醇溶液中增加氢键给体甘油的步骤。对比例1的制备方法采用普通乙醇提取代替酸性乙醇和碱性乙醇梯度变化提取，同时缺少酶提取的步骤；对比例2缺少酶提取的步骤，对比例3采用普通乙醇提取代替酸性乙醇和碱性乙醇梯度变化提取。
如表1结果可以看出，总黄酮收率结果为实施例5的收率与实施例4的收率相当，并远远大于实施例1～3，而实施例3的收率〉实施例2的收率〉实施例1的收率〉对比例2的收率〉对比例3的收率〉对比例1的收率。由此可以得出如下结论：
1、实施例1所得总黄酮收率远远大于与对比例3所得总黄酮收率，这是因为酸性乙醇和碱性乙醇梯度提取方法有利于黄酮类化合物的分离渗出，酸性乙醇和碱性乙醇使得溶剂的性质产生了梯度的变化，使得黄酮类化合物在溶剂中的扩散度增加，从而使其分离渗出量更大；并且酸性乙醇和碱性乙醇对黄酮类化合物具有助溶作用，有利于黄酮类化合物的渗出。
2、实施例1所得总黄酮收率远远大于对比例2所得总黄酮收率，这是因为，一方面酶将罗布麻叶中不易分离的芦丁转换成了槲皮素，从而增加了总黄酮的得率，另一方面酶对罗布麻细胞内的大分子的水解作用促进了有效成分的释放。
3、实施例1所得总黄酮收率远远大于对比例1所得总黄酮收率，对比例1采用常规乙醇提取，黄酮类化合物的溶解度和扩散度低，不能有效分离渗出。
4、实施例2所得总黄酮收率大于实施例1所得总黄酮收率，这是因为实施例2增加了冷冻和低压爆破的预处理步骤，使得植物的细胞膜预先被破坏，从而有利于有效成分的析出。
5、实施例3所得总黄酮收率大于实施例1所得总黄酮收率，这是因为实施例3预先去除了罗布麻中的脂肪成分，增加了罗布麻与溶剂之间的摩擦。
6、实施例4和实施例5所得总黄酮收率大于实施例1所得总黄酮收率，是因为氢键给体可以与罗布麻这两个电负性大且半径小的核形成氢键，通过氢键的作用使得有效成分以团状被释放。
如表1结果可以看出，实施例1～5槲皮素的含量有微小差别，但实施例1～5相对于对比例1～3而言，其槲皮素的含量有明显优势。这证明酸碱梯度乙醇溶液结合酶有利于更多的槲皮素释放。为验证酸碱梯度乙醇溶液提取法和酶制剂提取法的顺序对槲皮素含量的影响，本申请进一步考察了酸碱梯度乙醇溶液提取法和酶制剂提取法不同提取顺序所得总黄酮收率和槲皮素含量，计算实施例1和对比例4～6中所得罗布麻提取物中总黄酮的收率和槲皮素含量，所得结果如表2所示。
表2总黄酮的收率及槲皮素含量数据
由表2可知，实施例1所得总黄酮收率和槲皮素含量均高于对比例4～6，由此可见，酸碱梯度乙醇溶液提取法和酶制剂提取法的顺序对总黄酮收率和槲皮素含量均有影响，其优先顺序为本申请所公开的酸性乙醇回流提取 酶制剂提取 碱性乙醇回流提取。首先通过酸性乙醇的穿透能力强，率先将大部分的亲水性黄酮类化合物释放出来，再通过酶制剂将部分芦丁转换成槲皮素，获得更多的槲皮素，最后通过碱性乙醇先灭酶，同时碱性乙醇具有更强的分散性，有利于黄酮类化合物的进一步扩散而释放。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明罗布麻提取物制备方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
如上所述，根据本发明，本发明至少包括以下有益效果：
其一、本发明提供的罗布麻提取物的制备方法所得总黄酮收率最高可达4.31％，其中槲皮素含量71.32％；
其二、本发明提供的罗布麻提取物的制备方法中首次提出酸性乙醇和碱性乙醇梯度提取法，极大地提高了罗布麻叶中总黄酮和槲皮素的提取率；
其三、本发明提供的罗布麻提取物的制备方法中提出利用生物酶将芦丁转化成槲皮素，进而提高罗布麻叶提取物中槲皮素的含量；
其四、本发明提供的罗布麻提取物的制备方法中通过添加可食用尼泊金酯钠既可以达到提高提取率的作用，又可以灭掉在先步骤中添加的酶的活性，还可以延长罗布麻提取物的贮藏效期。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的具体实施例。
摘自国家发明专利，发明人：张春颖，许波，杨旭锦，申请号：202310050031.7，申请日：2023.02.01
