摘 要：该文以苎麻 Boehmeria nivea（L.）Gaudich 为实验材料，研究内生细菌在镉胁迫下对苎麻幼苗叶绿素、可溶性糖、蛋白质、脯氨酸和谷胱甘肽等生理生化指标的影响。研究表明，重金属镉毒害降低苎麻幼苗叶绿素、可溶性糖和谷胱甘肽等含量；而蛋白质和脯氨酸的含量在低镉浓度时上升，但随着镉浓度的增加也呈现下降趋势；加入内生细菌处理后，苎麻各生理生化指标相比对照都有上升。结果表明内生细菌在一定程度上通过改善苎麻的生理生化特性来缓解镉对苎麻幼苗造成的胁迫。
关键词：内生细菌；镉胁迫；苎麻；生理生化；重金属污染
镉（Cd）是一种生物毒性非常强的重金属。土壤受到镉污染后，会使农作物的生长发育受到阻碍，产量下降[1]。植物体内吸收的过量的重金属易通过干扰植物细胞正常代谢，影响光合系统，对植物产生毒害作用，导致植物生长发育受阻，所以在重金属高度污染的地区很难有植物能生长存活[2-3]。因此，了解重金属胁迫对植物生长发育的影响对于寻找提高植物抗逆性方法具有重要意义。重金属治理修复最常见的技术大致可分为物理修复、化学修复及生物修复[4]。植物-微生物联合修复是一种效率高、低成本、低污染的极具潜力的方案[5]。
至今为至，已有500多种重金属超富集植物，其中用于Cd污染的富集植物较少，主要有宝山堇菜（Viola baoshanensis）、大花金鸡菊（Coreopsis grandiflora Hogg）、忍冬（Lonicera japonica Thunb）和苎麻[6]。苎麻荨麻科，多年生草本宿生植物，原产于东亚，高可达0.5~1.5m，是世界上最古老的纤维作物之一[7]。我国是苎麻的原产地，拥有约2 000份苎麻种质资源，其遍布我国21个省（区）。此外，苎麻生物量较大，一年可收割3次，根系深度可达60cm[8]。康万利等[9]研究表明，苎麻根系入土深、主根发达、根系分布广、固土能力强及叶面积指数大等，是一种优良的水土保持和环境治理植物，在湖南境内大部分地区都有分布。
目前，重金属想要彻底治理又不造成二次污染的方法还未见报道，只能将重金属转移或迁移，不能被降解。研究证明，植物与内生细菌联合修复是一种绿色的修复技术，不会造成二次污染[10]。植物修复因其生长周期长，与物理、化学修复等相比缺点显而易见，因此，利用微生物结合植物修复显得尤为重要。
内生细菌在植物修复研究中受到广泛关注[11]。植物相关细菌在宿主适应不断变化的环境中起着关键作用。研究表明，超富集植物的内生细菌可能是重金属生物吸附的高效生物吸附剂的潜在资源[12]。内生细菌特别受关注，因其具有相对免受土壤竞争性高应力环境影响的优势[13]。
此外，微生物还能促进植物的旺盛生长，增大其生物量。由于内生细菌存在于植物体内，不易受外界环境的影响，可长期持续作用，具有良好开发利用前景[14]。本研究将内生细菌运用接种到处于不同程度镉胁迫下的苎麻上，从生长情况、叶绿素相对含量、叶绿素荧光参数及丙二醛含量等生理方面研究该内生细菌对镉胁迫下苎麻生长的影响，以期为重金属抗性微生物在镉污染领域缓解植物生长毒害作用的应用提供理论支撑，发现良好的重金属抗性内生细菌应用于辅助苎麻修复重金属镉污染环境的修复中。
1 材料与方法
1.1 实验材料
苎麻种子于湖南人文科技学院校园内采集。所用菌株是本实验室从娄底市冷水江锡矿石重金属污染区的作物中分离筛选出来的对镉有抗性的植物内生细菌xks-03。
1.2 实验方法
选取均匀饱满的苎麻种子分成2组分别在清水和稀释100倍的菌液中浸种24h，再分别分成3组摆放于培养皿中即6个处理组，清水浸种的3组分别用含Cd2+浓度为0mg/L、50mg/L、100mg/L的溶液和蒸馏水进行浇灌，菌液浸种的3组则用含Cd2+浓度为0mg/L、50mg/L、100mg/L的溶液和菌液进行浇灌，每次各加入10mL，一起放入恒温培养箱中（25℃）进行培养，待发芽后移植到土壤栽培，继续浇灌。约半个月后，随机从每组抽取一植株测定总糖含量（蒽酮比色法）、蛋白质含量（考马斯亮蓝染料结合法）、叶绿素含量（丙酮法）与谷胱甘肽（DTNB法）和脯氨酸（磺基水杨酸法）等指标。
1.2.1 叶绿素的测定
称取0.1g鲜叶，用丙酮和95%乙醇混合液提取，然后在663、645nm波长下测定吸光度，计算叶绿素含量。
1.2.2 可溶性糖的测定
称取新鲜叶片0.25g，研磨匀浆，加入5mL蒸馏水，100℃沸水煮40min，快速冷却后过滤，定容至25mL按蒽酮比色法测定可溶性糖的含量。
1.2.3 可溶性蛋白的测定
称取苎麻幼苗倒数第三叶0.23g，用5mL生理盐水研磨成匀浆，通过考马斯亮蓝染料结合法测定苎麻幼苗中可溶性蛋白。
1.2.4 脯氨酸的测定
剪取苎麻上部分0.2g新鲜叶片，用3%的磺基水杨酸溶液研磨成匀浆，通过酸性茚三酮显色法测定游离脯氨酸的含量用。
1.2.5 谷胱甘肽的测定
称取0.1g新鲜叶片，加入5%三氯乙酸（TCA）溶液后进行研磨，定容。13000rpm，-4℃离心10min，取上清液定容至1.5mL。取0.5mL上清液，加入0.5mL蒸馏水，测定谷胱甘肽的含量。
苎麻所测各种生理生化指标的含量或变化均以鲜重（FW）为单位计算，每个处理组重复3次测定，实验结果以平均值±标准偏差（SD）来表示。首先用Excel 2020软件完成基本的数据录入与计算，用SPSS.20软件进行差异性分析。
2 结果与分析
2.1 内生细菌在不同镉浓度下苎麻幼苗叶绿素的变化
不同浓度的镉胁迫对苎麻叶片叶绿素含量的影响不同。图1中，在不加镉溶液时，空白处理组中叶绿素含量比加内生细菌处理组的含量高，两组无显著性差异（P<0.05）；50mg/L镉溶液时，空白处理组叶绿素含量比加内生细菌处理组的含量低，加内生细菌处理显著高于空白处理（P<0.05）；100mg/L镉溶液时，空白处理组叶绿素含量比加内生细菌处理组的含量低，两组无显著性差异（P<0.05）。
2.2 内生细菌在镉胁迫下苎麻幼苗可溶性总糖的变化
可溶性糖的含量是衡量植株生理活性的一个指标，镉毒害使可溶性糖含量降低。图2中，在无镉胁迫时，空白处理组中可溶性糖含量比加内生细菌处理组的含量低，加内生细菌处理显著高于空白处理（P<0.05），且具有极显著性差异（P<0.01）；在50mg/L镉溶液时，空白处理组中可溶性糖含量比加内生细菌处理组的含量低，加内生细菌处理显著高于空白处理（P<0.05）；在100mg/L镉溶液时，空白处理组中可溶性糖含量比加内生细菌处理组的含量低，两组无显著性差异（P<0.05）。
2.3 内生细菌在镉胁迫下苎麻幼苗蛋白质的变化
内生细菌在镉胁迫下苎麻幼苗蛋白质的变化见图3。图3中，在无镉胁迫时，空白处理组中蛋白质含量低于加内生细菌处理组的含量，加内生细菌处理组显著高于空白处理组（P<0.05）；在50mg/L镉溶液时，空白处理组中蛋白质含量低于加内生细菌处理组的含量，但无显著性差异（P<0.05）；在100mg/L镉溶液时，空白处理组中蛋白质含量低于加内生细菌处理组的含量，加内生细菌处理组高于空白处理组（P<0.05）达到显著水平。
2.4 内生细菌在镉胁迫下苎麻幼苗脯氨酸的变化
内生细菌在镉胁迫下苎麻幼苗脯氨酸的变化见图4。由图4可以看出，随镉浓度的增加，苎麻的脯氨酸含量呈先上升后降低趋势。在无镉胁迫时，空白处理组中脯氨酸含量比加内生细菌处理组的含量低，两者无显著性差异（P<0.05）；在50mg/L镉溶液时，空白处理组中脯氨酸含量明显低于加内生细菌处理组的含量，但两者无显著性差异（P<0.05）；在100mg/L镉溶液时，空白处理组中脯氨酸含量比加内生细菌处理组的含量低，两组无显著性差异（P<0.05）。
2.5 内生细菌在镉胁迫下苎麻幼苗谷胱甘肽的变化
从图5中可以看出，在3个镉溶液处理中，加入菌液处理中的谷胱甘肽含量都比不加菌液处理的高。在无镉胁迫时，空白处理组中谷胱甘肽含量低于加内生细菌处理组的含量，但两组无显著性差异（P<0.05）；在50mg/L镉溶液时，空白处理组中谷胱甘肽含量明显比加内生细菌处理组的含量低，加内生细菌处理组显著高于空白处理组（P<0.05）；在100mg/L镉溶液时，空白处理组中谷胱甘肽含量明显低于加内生细菌处理组的含量，加内生细菌处理组显著高于空白处理组（P<0.05）。随着镉浓度的增加，内生细菌对苎麻谷胱甘肽含量的合成效果越显著。
3 结论
本实验主要研究在重金属镉污染土壤上苎麻利用内生细菌进行处理后，重金属镉对苎麻幼苗的胁迫影响及内生细菌对苎麻受重金属镉污染的缓解作用。
叶绿素是植物中的绿色物质，是一种复杂的有机酸，与作物叶片叶绿素含量具有显著水平的相关性，而叶绿素含量是反映叶片光合能力的重要指标，与光合作用的性能密切相关[15]。耐锑促生菌能通过显著提高植物中的叶绿素含量来促进光合作用。苎麻幼苗在镉胁迫下，叶绿素含量在内生细菌处理组均显著高于空白组。而且随着镉浓度增加，叶绿素含量呈下降趋势，说明了镉胁迫会破坏苎麻叶绿素的合成，但通过添加内生细菌，能够缓和重金属镉对苎麻的毒害。
植物体内可溶性糖含量代表其体内碳水化合物的合成、转化与输出代谢情况。本研究发现，可溶性糖含量是随着镉浓度的增加而显著下降的，这表明镉对苎麻幼苗产生可溶性糖的胁迫较强。但可以明显看出，加入内生细菌后，可溶性糖含量有所提高。
可溶性蛋白的变化是衡量重金属污染的重要指标。研究表明，一定范围的镉浓度处理能够促进苎麻的可溶性蛋白含量的合成，随着镉浓度的增加苎麻的可溶性蛋白含量也随之增加[16]。同时也表明，随着镉处理浓度增加，蛋白质含量上升。这可能是由于镉作为一种逆境因子，激活了苎麻幼苗一些抗性蛋白质的产生，但是高浓度镉使可溶性蛋白含量明显减少。但添加内生细菌，对苎麻的可溶性蛋白合成明显高与未加菌组，说明内生细菌能够促进植物的可溶性蛋白的合成。
脯氨酸是植物体内水溶性最大的氨基酸，具有较强的水合能力，是理想的渗透调节物质。在镉浓度低时，脯氨酸含量上升；镉浓度高时，脯氨酸含量下降，这说明镉胁迫导致苎麻叶片中游离脯氨酸大量积累，脯氨酸的累积可能是苎麻对镉毒害的一种保护性适应。但高浓度镉则对植物造成迫害，导致脯氨酸不能合成。从研究结果中看出，加入内生细菌处理后，脯氨酸含量明显提高。说明内生细菌能够有效修复植物合成脯氨酸。
植物内的谷胱甘肽含量能有效衡量植株对镉富集和耐受能力的大小。本研究结果发现，随着镉浓度的增加，谷胱甘肽的含量极具减少，发现表明镉处理浓度的增加加强对苎麻幼苗的胁迫作用。加入内生细菌处理后与同浓度镉相比，谷胱甘肽含量比显著提高，表明内生细菌在一定程度上缓解了镉对苎麻幼苗的抑制。
本实验结果说明，在重金属镉污染下苎麻幼苗生长受到明显抑制，苎麻幼苗的生长和各生理指标都受到影响，表现为重金属镉毒害使苎麻幼苗叶绿素、可溶性糖和谷胱甘肽等含量呈现下降趋势；而蛋白质和脯氨酸的含量在镉浓度低时上升，并随着镉浓度的增加而下降。加入内生细菌与镉处理后，内生细菌具有缓解或抑制镉毒害的作用。
参考文献
[1] 唐秋香，缪新.土壤镉污染的现状及修复研究进展[J].环境工程，2013，31（S1）：747-750.
[2] 王维薇，林清.国内外土壤镉污染及其修复技术的现状与展望[J].绿色科技，2017（4）：90-93，102.
[3] 韩润平，陆雍森.用植物清除土壤中的重金属[J].江苏环境科技，2000（1）：28-29.
[4] 刘劲松，张健君，杨淑芳，等.内生菌参与植物/微生物联合修复重金属污染土壤的研究进展[J].中国植保导刊，2014，34（2）： 27-30.
[5] 岳红，孙吉凤，麻莹.镉对植物种子萌发影响研究[J].江西农业，2016（17）：91，96.
[6] 张腾，卢倩云，陈友明，等.3种镉超富集植物毛状根体系对镉胁迫响应的比较[J].生态毒理学报，2017，12（4）：367-376.
[7] 孙士涛，郭兵，余永廷，等.外源物质在苎麻修复镉污染土壤中的应用研究进展[J].中国麻业科学，2018，40（5）：239-243.
[8] 罗亚男，余跃生，陶晨，等.环境镉污染的生物危害效应及机制研究进展[J].黔南民医专学报，2011，12，24（4）：306-308.
[9] 康万利，揭雨成，邢虎成.南方坡耕地种植苎麻水土保持效果和经济效益研究[J].水土保持研究，2012，19（3）：86-89.
[10] BAI H J，ZHANG Z M，YANG G E，et al. Bioremediation of cadmium by growing Rhodobacte sphaeroides： kinetic characteristic and mechanism studies [J].Bioresource Technology，2008，99（16）：7716-7722.
[11] STURZ A V，NOWAK J. Endophytic communities of rhizobacteria and the strategies required to create yield enhancing associations with crops[J].Applied soil ecology，2000，15（2）：183-190.
[12] AZEVEDO J L，MACCHERONI J R W，PEREIRA J O，et al. Endophytic microorganisms：a review on insect control and recent advances on tropical plants [J].Electronic Journal of Biotechnology，2000，3（1）：15-16.
[13] 荆涛.不同表面活性剂强化苎麻修复Cd、As污染土壤的研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2021.
[14] 刘冲，赵玲，李秀华，等.苎麻对农田土壤中汞、镉的吸收累积特征研究[J].农业环境科学学报，2020，39（5）1034-1042.
[15] 童淑媛，宋凤斌，徐洪文.玉米不同叶位叶片SPAD值的变化 及其与生物量的相关性[J].核农学报，2008，22（6）：869-874.
[16] 纪秀娥，王红星，李迟园.水杨酸对Cd2+胁迫下玉米种子萌发及幼苗生长发育的影响[J].河南农业科学，2009（10）：48-50.
文献摘自：向书琴，胡春玉，黄宝兰，高佳琳，杨泽良.内生细菌在镉胁迫下对苎麻幼苗生理生化特性的影响[J].智慧农业导刊，2023，3(06)：22-25.DOI：10.20028/j.zhnydk.2023.06.006.
