摘  要：采用DTT还原结合SephadexLH-20葡聚糖凝胶层析的方法分离测定了汉麻球蛋白3种酶解产物中巯基肽的含量，测定结果显示：碱性蛋白酶>胃蛋白酶>木瓜蛋白酶。采用LC-MS-MS检测并鉴定出3种蛋白酶酶解物中巯基肽的分布和序列，结果显示：碱性蛋白酶酶解物中巯基肽数量为41个，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解物中都是31个，来源均是Edestin2、Edestin3、清蛋白和非特征蛋白。3种酶酶解获得的麻仁球蛋白（Edestin）巯基肽大部分为亲水性的，分子质量主要分布于1000～2000u，其中10个是3种酶解产物共有的，碱性蛋白酶和胃蛋白酶酶解物中有4个相同的来源于Edestin3的麻仁球蛋白巯基肽。胃蛋白酶酶解得到了一个独有的源于Edestin2的麻仁球蛋白巯基肽。碱性蛋白酶酶解得到了4个独有的源于Edestin3的麻仁球蛋白巯基肽。研究结论：3种蛋白酶由于作用位点和效力不同得到的麻仁球蛋白巯基肽数量和分布均有不同，但是碱性蛋白酶酶解汉麻球蛋白可以获得更多的麻仁球蛋白巯基肽，推测碱性蛋白酶可以更好地打开汉麻球蛋白中的二级及以上结构，使二硫键更多的暴露出来。

关键词：汉麻球蛋白；酶解；麻仁球蛋白；巯基肽；

 

汉麻(Cannabis Sativa L)是大麻科(Cannabaceae)大麻属(Cannabis)的一年生草本植物，是我国麻类产业研发的主导作物，除其韧皮纤维可以作为纺织原料加以利用外，其种仁也是很好的食品原料^[1]。汉麻仁蛋白营养结构合理，易被消化吸收，是运动员及术后患者首选的蛋白来源^[2,3]。已有的研究表明麻仁球蛋白是汉麻仁蛋白中的主要成分^[4]，占汉麻仁总蛋白的65%左右，具有优异的氨基酸组成特性，但水溶性较差^[5]。为改善蛋白的加工特性和生理功能，酶水解是有效的常用手段，酶解可以更大地释放蛋白质序列中的生物活性肽段^[6]，使蛋白质具有一定的生理调节作用^[7-9]，其中含有巯基的蛋白肽有着更高的利用价值^[10]。巯基又称氢硫基，以硫醇（SH）形式存在，在碱性条件下以巯基的质子化形式存在^[11]，具有很强的反应活性，可以作为还原剂清除人体内自由基、与体内重金属等有毒物质反应^[12.13]，从而促进其代谢。目前研究最多的是从大豆蛋白中酶解获得巯基肽，丁秀臻^[14]采用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶对还原大豆11S酶解制备出了巯基肽，并验证其具有一定的重金属离子结合能力，王金艳等^[15]采用不同蛋白酶酶解大豆11S蛋白制备巯基肽发现低温与低pH对于巯基肽的制备具有重要意义。李瑞等^[16]酶解亚麻籽粕后采用Thiopropyl Crystarose6 Fast Flow凝胶成功富集制备了亚麻籽巯基肽。而本研究将以麻仁球蛋白为底物，研究了3种蛋白酶水解产物中巯基肽的分子质量和亲疏水性分布，为探究麻仁球蛋白的三维结构和研究麻仁球蛋白中功能基团的构效关系提供参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

汉麻球蛋白、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、二硫苏糖醇（DTT）、BB-4724Ellman试剂盒、SephadexLH20葡聚糖凝胶、YM-A3508G琼脂糖凝胶CL-6B；盐酸，氢氧化钠，三羧甲基氨基甲烷（Tris），氯化钠，乙醇，三氯乙酸，丙酮，甘油，甲醛，SDS：分析纯。

1.2仪器与设备

VFD-6000型真空冷冻干燥机，Epoch酶标仪，UV759S型紫外-可见光分光光度计，QExactive质谱仪，EASY-n1000型高效液相色谱仪。

1.3方法

1.3.1巯基肽的还原、分离与含量测定

汉麻球蛋白质量浓度为50g/L，加入碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的质量为汉麻球蛋白质量的质量分数分别5%、2.4%、10%，酶解pH分别为8.0、5.5～6、1.0，水解温度分别为50、70、37℃，磁力搅拌时间分别为6、2、3h。酶解结束后4000r/min离心半小时，取上清液冻干得到3种汉麻球蛋白酶解物。酶解物按50g/L溶解在含20mmol/LDTT的pH8.0的10mmol/L的Tris-HCl缓冲液中，水浴锅50℃还原30min，结束后使用2mol/L的HCl调至pH3.0，10000×g离心15min，过0.22um滤膜。采用SephadexLH-20（40cm×2cm）进行凝胶层析，分离巯基肽与DTT，上样量为10mL，流动相为1mmol/L的HCl溶液。接收流动相50mL后，使用1.5mL离心管接收分离产物，采用ELLMAN试剂盒进行巯基含量的测定^[14]。

1.3.2 3种蛋白酶解物中巯基肽的分布及含量分析

3种蛋白酶解物进行了LC-MS-MS质谱鉴定。鉴定条件如下：

1.3.2.1色谱分离

液相所用的A液为0.1%甲酸水溶液，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈为84%）。

液相色谱柱(0.15mm×150mm，RP-C18)以95%的A液进行平衡，样品由自动进样器上样到Zorbax300SB-C18肽阱，再经过液相色谱柱分离，相关液相梯度设置如下：

0～50min，B液线性梯度从4%到50%；

50～54min，B液线性梯度从50%到100%；

54～60min，B液维持在100%。

1.3.3.2质谱鉴定

酶解产物经毛细管高效液相色谱分离后用QExactive质谱仪进行质谱分析，分析时长：60min。检测方式：正离子。多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(fullscan)后采集10个碎片图谱(MS2scan)。

1.3.3.3数据分析

质谱测试原始文件(RawFile)用软件MaxQuant1.5.5.1检索相应的数据库，最后得到蛋白质鉴定及定量分析结果，查库所用相关参数和说明见表1。

表1 MaxQuant查库所用参数

  

  

根据Gravy值（在http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/网站上完成）来预测亲疏水性，Gravy值的范围在2与-2之间，正值表明此蛋白为疏水性蛋白，负值表明为亲水蛋白^[18]。

2结果与分析

2.1汉麻球蛋白酶解物中巯基肽的分离与含量测定

多肽中含有巯基是多肽高抗氧化性的原因之一^[15]。由图1可见，3种蛋白酶水解的汉麻球蛋白还原酶解物经过SephadexLH-20葡聚糖凝胶层析都可以很好的分成两个部分，其中第一个峰为汉麻球蛋白酶解物中的巯基肽，第二个峰为DTT，说明使用DTT还原后结合SephadexLH-20葡聚糖凝胶层析分离是测定汉麻球蛋白酶解物中游离巯基的有效方法。以碱性蛋白酶酶解的汉麻球蛋白为例，经过还原之后，酶解物中的游离巯基从0.0048mmol/L提高到了1.907mmol/L，提高了397倍。采用同样的方法，丁秀臻等^[19]测定的还原大豆球蛋白中的巯基含量约为1.4mmol/L。3种蛋白酶解物中巯基的含量分别为：碱性蛋白酶1.907mmol/L，木瓜蛋白酶0.791mmol/L，胃蛋白酶0.866mmol/L。还原的碱性蛋白酶汉麻球蛋白酶解物的中的巯基含量较其它两种酶解产物中的高2倍还多，说明碱性蛋白酶可以更好地打开汉麻球蛋白中的二级及以上结构，使二硫键更多的暴露出来。

  

图1 3种蛋白酶酶解物中巯基肽的分离及含量

2.2 3种蛋白酶解物中巯基肽的分布及含量分析

分别采用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶对分级的汉麻球蛋白进行酶解，酶解产物进行了LC-MS-MS检测，发现在3种处理中，碱性蛋白酶酶解获得的汉麻球蛋白巯基肽数量最多，为41个，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解物中巯基肽均为31个。

  

  

麻仁球蛋白（Edestin）分子是由酸性亚基和碱性亚基通过二硫键连接组成的六聚体，Svedberg等^[20]通过超速离心法测得汉麻籽蛋白分子质量为300ku，其中酸性亚基分子质量为33.0ku，碱性亚基分子质量为20.0ku。通过对黑龙江省科学院大庆分院自主选育的汉麻品种——火麻一号种子蛋白进行组学鉴定与定量分析后发现^[21]，麻仁球蛋白包括由ede1A、CsEde1A、CsEde1B、ede1C基因编辑的Edestin1，ede2B基因编辑的Edestin2，以及CsEde3A和CsEde3B基因编辑的Edestin3。对3种汉麻球蛋白酶解物的质谱分析结果中发现在Osborne分离过程中，汉麻仁球蛋白中包含了除了麻仁球蛋白以外的清蛋白及非特征蛋白。因此有必要对麻仁球蛋白中的巯基来源和含量分布进行分析：其中碱性蛋白酶酶解获得的麻仁球蛋白巯基数量是最多的，为18个。木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解获得的的汉麻球蛋白巯基肽虽然数量相同，但胃蛋白酶酶解获得的麻仁球蛋白巯基肽数量更多一些。3种酶解物中巯基肽来源比较的结果说明，碱性蛋白酶对水解麻仁球蛋白获得巯基肽的效力更高，其次是胃蛋白酶，最次是木瓜蛋白酶。

2.3 3种蛋白酶解物中麻仁球蛋白巯基肽的分子质量和亲疏水性分布

采用碱性蛋白酶进行酶解得到的麻仁球蛋白巯基肽一共有18个，其中12个巯基肽的分子质量分布于1000～2000u，5个巯基肽的分子质量分布于2000～3000u，仅有1个大于3000u的巯基肽。肽的亲疏水性与其氨基酸组成、比例及结构相关，亲疏水性的计算结果表明，采用碱性蛋白酶进行酶解得到的麻仁球蛋白巯基肽有13个都是亲水性的，仅有5个有疏水倾向，说明巯基结构的存在可能对巯基肽的亲水性有贡献。

采用木瓜蛋白酶进行酶解得到的麻仁球蛋白巯基肽一共有10个，其中7个巯基肽的分子质量分布于1000～2000u，2个巯基肽的分子质量分布于2000～3000u，仅有1个大于3000u的巯基肽。亲疏水性的计算结果与碱性蛋白酶的结果相似，采用木瓜蛋白酶进行酶解得到的麻仁球蛋白巯基肽8个都是亲水性的，同样可以说明巯基结构的存在可能对巯基肽的亲水性有贡献。

采用胃蛋白酶进行酶解得到的麻仁球蛋白巯基肽一共有15个，其中10个巯基肽的分子质量分布于1000～2000u，4个巯基肽的分子质量分布于2000～3000u，仅有1个大于3000u的巯基肽。亲疏水性的计算结果与碱性蛋白酶的结果相似，有11个是亲水性的。

  

图2 不同蛋白酶解物中麻仁球蛋白巯基肽的分子质量和亲疏水性分布

2.4 不同蛋白酶酶解后获得的麻仁球蛋白巯基肽比较分析

从图2可见，3种蛋白酶酶解后获得麻仁球蛋白巯基肽有相同的部分，也有不同的部分。但是大部分麻仁巯基肽均为亲水性的肽，且分子质量分布于1000～2500u。表3中列出了分别在3种酶解物中均检出的10个麻仁球蛋白巯基肽，由表可见，3种酶获得的麻仁球蛋白巯基肽相同的部分有4个均来源于Edestin2，6个来源于Edestin3，没有来源于Edestin1的巯基肽。

表3 3种蛋白酶解物中相同的麻仁球蛋白巯基肽

  

表4是碱性蛋白酶和胃蛋白酶酶解物中检出的相同的麻仁球蛋白巯基肽（除3种酶解产物中相同巯基肽以外），共4个，均来源于Edestin3，由此推断，在水解麻仁球蛋白Edestin3时，碱性蛋白酶与胃蛋白酶有相似的位点和效力。但是胃蛋白酶在水解麻仁球蛋白时得到了一个独有的源于Edestin2的麻仁球蛋白巯基肽，其序列为LHCAGVETARHTIQRRGLL，分子质量约为2131.472，这体现了胃蛋白酶特有的水解位点。

表4 碱性蛋白酶和胃蛋白酶解物中相同的麻仁球蛋白巯基肽

  

碱性蛋白酶中检测到4个源于Edestin3的独有的麻仁球蛋白巯基肽（表5），说明在酶解麻仁球蛋白获得巯基肽时，碱性蛋白酶相较于木瓜蛋白酶和胃蛋白酶有着更多的作用位点和效价。

表5 碱性蛋白酶酶解物中特有的麻仁球蛋白巯基肽

  

3结论

3种蛋白酶酶解物中的巯基肽含量测定结果显示：碱性蛋白酶>胃蛋白酶>木瓜蛋白酶，巯基肽主要来源于蛋白质中含硫氨基酸为肽末端的分解，含硫氨基酸主要包括蛋氨酸和半胱氨酸^[22]，从课题组之前对汉麻蛋白分级产物的研究中可见汉麻球蛋白中蛋氨酸和半胱氨酸之和是大豆分离蛋白的4.5倍，推测这也是汉麻球蛋白测得巯基含量高于大豆球蛋白的原因之一，这意味着汉麻球蛋白在清除自由基、结合重金属方面比大豆球蛋白有着更好的效果。LC-MS-MS鉴定结果显示，碱性蛋白酶酶解的汉麻球蛋白巯基肽数量最多（41个，其中麻仁球蛋白巯基肽18个），木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解物均为31个（其中麻仁球蛋白巯基肽分别为10个和15个），说明在酶解麻仁球蛋白获得巯基肽时，碱性蛋白酶相较于木瓜蛋白酶和胃蛋白酶有着更多的作用位点和效价。3种酶解产物中巯基肽的来源均是Edestin2、Edestin3、清蛋白和非特征蛋白，没有来源于Edestin1的巯基肽，可能是由于Osborne分级时损失了Edestin1，也有可能是Edestin1酶解后含硫氨基酸位于N端或C端，从而未被检出。部分来源于清蛋白和非特征蛋白的巯基肽被检测出来，可能是源于Osborne分离时的残留。3种酶酶解得到的大部分麻仁球蛋白巯基肽均为亲水性肽，说明巯基结构的存在可能对巯基肽的亲水性有贡献。3种酶酶解获得的麻仁球蛋白巯基肽分子质量主要分布于1000～2000u，仅有少量的巯基肽分子质量分布于2000～3000u，有1个共有的巯基肽分子质量大于3000u。

 

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文章摘自：石杰,魏连会,张正海,宋淑敏,杨庆丽,董艳.汉麻球蛋白酶解产物中巯基肽的含量及分布研究[J/OL].中国粮油学报:1-9[2022-06-29].