摘 要：公安机关办理大麻植物类案件时需要一定的数据支撑，但当前已有研究缺少系统分析大麻植物中主要有效成分的相关实验数据。以甲醇萃取大麻植物中的主要成分，应用气相色谱/质谱/选择离子监测法(GC/MS/SIM)进行检测分析，四氢大麻酚和大麻酚在100、50、25、10、5μg/mL浓度范围呈线性，大麻二酚在50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL浓度范围呈线性，线性关系良好，最低检出限为0.001μg/mL。通过GC/MS/SIM对大麻植物不同部位中主要成分进行定量检测，标准偏差小于0.18%，测量结果不确定度较小，四氢大麻酚的含量比较：树冠>大麻籽>茎皮>杆，而树冠中四氢大麻酚的含量都超过已有文献报道的工业大麻中四氢大麻酚含量，均大于0.3%。该检测方法可为涉毒原植物类犯罪行为认定、定罪量刑提供法庭科学依据。
关键词：法医毒物分析；GC/MS/SIM；大麻植物；四氢大麻酚
1引言
大麻是世界三大毒品原植物之一，全世界范围内均有广泛种植，因其价格相较其他毒品较为低廉，也常被称为“穷人的毒品”。不同国家对大麻的管制不同，甚至同一个国家的不同地区的管制措施也有所不同，如加拿大颁布法案宣布大麻“合法化”、美国多数州宣布娱乐和医用大麻“合法化”，致使近些年大麻毒品从北美洲走私入境中国的案件增多。据《2018年中国毒品形势报告》显示，随着近年来有些国家大麻“合法化”，加剧了大麻在全球的蔓延，对现有国际禁毒政策产生冲击，加大了全球毒品治理的复杂程度[1]。
大麻在中国非法种植的活动逐年增多，涉及到我国绝大部分省份。大麻植物在中国栽培的历史悠久，在诸多领域有着广泛的用途[2,3,4]。大麻植物中含有500多种化合物[5]，其中四氢大麻酚(Δ9-Tetrahydrocannabinol，THC)是起主要药效作用的精神活性物质，其次是大麻酚(cannabinol，CBN)和大麻二酚(cannabidiol，CBD)。不同品种、不同产地的大麻植物，受日照、天气、水分等因素影响，其四氢大麻酚的含量不尽相同[6]，甚至同一品种的大麻植物中四氢大麻酚的含量也不同。通常大麻类毒品有3种形态：大麻植物干品、大麻树脂、大麻油，其中大麻植物干品由大麻植株的花、叶晒干后制成，四氢大麻酚的含量达0.5%～5%。欧美国家按照THC的含量将大麻分为药用型(四氢大麻酚>0.3%)、中间型(0.3%<四氢大麻酚<0.5%)和纤维型(四氢大麻酚<0.3%)，其中中间型大麻主要用于医疗，纤维型大麻也称为工业大麻[7]，加拿大规定工业大麻指THC<0.3%的大麻植物。我国于2003年首次提出工业大麻的概念，《云南省工业用大麻管理暂行规定》中规定THC<0.3%的大麻为允许种植范围。2017年、2018年《黑龙江省禁毒条例》和《云南省禁毒条例》对工业大麻的种植和加工等内容作了明确规定，目前我国工业大麻的概念以欧盟、加拿大、云南、黑龙江等采用的标准作为参照[8,9,10]。
我国人工种植的大麻品种繁多，西北地区还分布有一定量的野生大麻[11]。大麻植物属于甘肃省一种重要的经济作物，在甘肃多地均有种植，具有重要的农业、工业与药用价值。但随着全球对大麻管制的变化，我国吸食大麻问题有蔓延扩大趋势。近年来已发现的多起涉大麻植物的案件表明，在甘肃省内已产生了工业大麻流失的风险[12]。目前，新疆已在全区禁止种植大麻，因此犯罪分子利用地域优势选择在甘肃省非法种植大麻原植物，并制作转运大麻毒品至新疆牟取暴利。由于国内外毒品分析的重点集中在对海洛因、冰毒、新精神活性物质及其代谢物的研究[13,14,15,16,17,18,19]，而对某一地域的大麻植物尚未进行系统的研究，且甘肃省具有东西狭长、横跨多个自然带这种独特的地理特点，因此，对甘肃省内大麻植物的系统研究将具有较好的代表性与指导性。
本实验采用气相色谱/质谱/选择离子监测(GC/MS/SIM)方法对甘肃省一玉米地中套种的经济作物工业大麻4株(均处于成熟阶段)进行系统分析检测，分析大麻植物样本的不同部位所含四氢大麻酚、大麻酚和大麻二酚的含量，据此建立有效的检测实验方法。
2实验部分
2.1仪器与试剂
安捷伦7890B气相色谱仪、5977B MSD四级杆质谱仪、GC/7693 Autosampler气相色谱质谱联用仪，配有Analyst和Mass Hunter Workstation Software B.07.01(美国安捷伦Agilent公司，帕罗阿托)；梅德勒电子天平(梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司，苏黎世)；AnKe TDL-60B型离心机(上海安亭科学仪器厂，上海)；5510E-MT超声波清洗器；IKA®YUBE-MILL 100研磨机(德国IKA公司，施陶芬)；涡旋振荡器(德国IKA公司，施陶芬)。
甲醇，分析纯(成都市科隆化学品有限公司，成都)；三苄胺，纯度98%(源叶生物，上海)；1mg /mL四氢大麻酚标准溶液、0.1mg/mL大麻酚标准溶液、1mg/mL大麻二酚标准溶液(公安部第三研究所，上海)。
实验样本包括大麻植物样本和空白对照样本。大麻植物样本为甘肃定西某玉米地中采集的套种大麻植物整株4份，均从同一块地中取样。空白对照样本为非大麻植物样本(大麻类毒品的滥用方式大多是掺杂在烟草中，而大麻属桑科草本植物，因此，空白植物的筛选要考虑外观上与大麻植物相似、在植物学分类上接近的植物)，本实验空白对照样本植物为萱麻草。
2.2溶液配制
2.2.1内标溶液的配制
准确称取三苄胺标准物质10mg，用甲醇溶解并定容至10mL，配制成浓度为1mg/mL的标准储备溶液。取三苄胺标准储备溶液，配制成浓度为40μg/mL的内标溶液，4℃保存。
2.2.2标准溶液的配制
取1mg/mL四氢大麻酚标准储备溶液，用甲醇稀释成200μg/mL的标准储备溶液，4℃保存。使用时添加40μg/mL内标三苄胺溶液，并用甲醇逐级稀释成四氢大麻酚浓度为100、50、25、10、5μg/mL，内标三苄胺溶液浓度为20μg/mL的标准工作溶液，现用现配。
取1mg/mL大麻二酚标准储备溶液，用甲醇稀释成200μg/mL的标准储备溶液，4℃保存。使用时添加40μg/mL内标三苄胺溶液，并用甲醇逐级稀释成大麻二酚浓度为100、50、25、10、5μg/mL的标准工作溶液，内标三苄胺溶液浓度为20μg/mL的标准工作溶液，现用现配。
取0.1mg/mL大麻酚标准储备溶液，添加40μg/mL内标三苄胺溶液，并用甲醇逐级稀释成大麻酚浓度为50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL的标准工作溶液，内标三苄胺溶液浓度为20μg/mL的标准工作溶液，现用现配。(本实验仅保存储备液，由于大麻酚储备液本身浓度很小，用甲醇稀释的一系列工作液在做完校准曲线后不再保存。)
2.2.3样品处理
大麻植物样本于自然条件下置于通风橱中风干15d，分别采取植物植株叶(树冠20cm以上部位)、籽、茎皮、杆等部位，干燥后采用研磨机研磨均匀。根据预实验结果显示，大麻植物叶中四氢大麻酚含量最高。因此，本实验不同部位称取的样品重量不同，含量较低的样本适当增加样品重量。平行称取3份不同部位(树冠、茎皮、大麻籽、杆)研磨均匀的大麻植物样品，置于15mL具塞离心管中，加入2mL的甲醇，密封，涡旋振荡3min，超声20min，浸泡24h，以5000r/min的速度离心10min，移取上清液100μL于上样瓶中，再加入40μg/mL三苄胺标准内标溶液100μL，取1μL进气相色谱/质谱分析，每个样品连续进样3针。
空白对照植物样本的处理方法同上，风干后取样，研磨机研磨均匀后，置于15mL具塞离心管中，加入2mL的甲醇，密封，涡旋振荡3min，超声20min，浸泡24h，以5000r/min的速度离心10min，取出上清液用于制备空白添加溶液。
分别取四氢大麻酚、大麻二酚和大麻酚的标准储备溶液0.02mL、0.02mL和0.2mL，加入到0.76mL上述空白对照植物提取液中，制备成四氢大麻酚、大麻酚和大麻二酚浓度分别为20、20、20μg/mL的混合标准添加溶液。
2.3仪器条件
2.3.1气相色谱条件
色谱柱：安捷伦 Hp-5ms Ultra 1nert(30m×250μm×0.25μm)毛细管柱；进样口温度：280℃；程序升温：初始温度100℃，以15℃/min的速度升温至280℃，保持15min；载气为氦气，流速1mL/min，分流比为20∶1；进样量1μL。
2.3.2质谱条件
离子源温度230℃，四级杆温度150℃，采用选择离子监测(SIM)方式扫描，每种化合物监测两个碎片离子。
2.4数据处理
色谱峰处理采用MassHunter软件(美国Agilent公司，帕罗阿托)导入碎片离子峰，同时适当调整积分参数，以完成色谱峰的识别与匹配，采用自动积分方式得到化合物的峰面积值。4个不同样品中主要成分的含量比较采用Origin2019软件进行分析。
3结果与讨论
3.1提取方法的优化
本实验分别采用乙醚、石油醚、乙酸乙酯、己烷-乙酸乙酯、甲醇溶液对2.2.2中大麻植物的叶一定量涡旋振荡，超声，浸泡，以5000r/min的速度离心10min，取上清液GC/MS检测。测定不同溶剂对大麻中3种主要成分的提取回收率，平行操作3次，仪器连续检测3次，求出其平均回收率，如图1所示。可见，使用甲醇溶液对四氢大麻酚、大麻酚和大麻二酚3种物质的提取回收率最高。因此，本实验选择使用甲醇作为提取溶剂。
表1大麻植物中3种主要成分和内标物三苄胺的气相色谱/质谱分析参数
3.3不同大麻植株主要成分含量结果比较
本实验于2019年9月下旬采集了甘肃定西某玉米地中套种的大麻植株4份(均处于成熟阶段)，分别编号为1、2、3、4；选择大麻植株的树冠(距离顶端10cm位置)、茎皮、大麻籽、杆(编号分别为A、B、C、D)进行分析检测。实验结果如表2和图2所示，所收集的大麻植株中不同部位均检测出四氢大麻酚、大麻酚和大麻二酚。四氢大麻酚的含量依次为A>C>B>D，大麻植株的树冠中四氢大麻酚含量最高，其次为大麻籽，杆中四氢大麻酚的含量最少。本实验所取大麻植物样本中树冠部位的四氢大麻酚含量分别为：0.3910%、0.3143%、0.6252%、0.8041%，均大于0.3%，标准偏差<0.18%。按照欧盟农业委员会的标准和《云南省工业用大麻管理暂行规定》中提出的四氢大麻酚>0.3%属于药用大麻(毒品大麻)，本实验所收集的大麻植物样本均是甘肃省重要的经济作物，即目前被作为经济作物种植的大麻植物很有可能存在被滥用的现象。
表2 GC-SIM检测套种大麻植物中主要成分含量表
3.4方法学验证
图2大麻植物中不同部位3种主要成分含量
A：四氢大麻酚；B：大麻酚；C：大麻二酚
图2大麻植物中不同部位3种主要成分含量
A：四氢大麻酚；B：大麻酚；C：大麻二酚
3.4.1仪器条件的选择
首先采用气相色谱/质谱/全扫描方式(GC/MS/SCAN)检测大麻植物中的主要成分，3种主要化合物和内标三苄胺的色谱峰型较好，可以得到四氢大麻酚、大麻酚、大麻二酚、三苄胺的碎片离子，但定量实验峰面积标准偏差较大。然后采用气相色谱/质谱/选择离子监测(GC/MS/SIM)进行分析，且空白植物无干扰。监测的选择离子分别是：THC特征离子299、314；CBN特征离子295、310；CBD特征离子231、246；三苄胺特征离子91、210.1。THC、CBN、CBD和三苄胺保留时间分别为12.387、12.815、11.849、11.267min，如图3～4所示。
3.4.2 工作曲线
图3大麻植物中主要成分GC/MS/SIM色谱图
图4大麻植物中主要成分的质谱图
图5氢大麻酚、大麻酚和大麻二酚工作曲线图
使用2.2.2中配制的四氢大麻酚、大麻酚和大麻二酚标准工作溶液，添加至空白植物中用GC/MS/SIM法检测分析，所得数据采用Agilent公司MassHunter GC/MS Acquisition分析软件(版本B.07.00)进行统计分析。3种化合物的工作曲线制作方法如下：连续3日重复制备，以5个浓度水平(四氢大麻酚和大麻二酚浓度分别为100、50、25、10、5μg/mL的标准工作溶液，大麻酚浓度为50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL，内标三苄胺溶液浓度为20μg/mL的标准工作溶液)进样分析，现用现配。分别以四氢大麻酚、大麻酚和大麻二酚的进样浓度为横坐标，以四氢大麻酚、大麻酚、大麻二酚的峰面积与内标物三苄胺的峰面积的相对响应为纵坐标，绘制工作曲线(Agilent气相色谱/质谱MassHunter软件自动计算生成)，四氢大麻酚、大麻酚和大麻二酚的线性回归方程分别为Y=0.014189X2+0.129783X-0.014200、Y=0.134428X2+0.787079X-0.019579、Y=0.060216X2+0.370018X-0.038486，四氢大麻酚、大麻酚和大麻二酚的工作曲线分别采用了具有 1/x、1/x2和1/x 加权因子的线性最小二乘回归，相关系数分别为0.99826206、0.99872395、0.99346520。根据信号/噪音=3计算，该方法的最低检出限为0.001μg/mL，如图5所示。
3.4.3不确定度检验
本实验采用A-3大麻植物样本评估了实验检验方法的精密度和不确定度，重复测定6次计算GC/MS的重复性，A-3大麻植物中样本中四氢大麻酚平均含量为0.3921%，标准偏差0.008%，A类标准不确定度0.005889827；B类标准不确定度评定主要考察了1mg/mL四氢大麻酚标准液的浓度(相对标准不确定度=0.0018%)、大麻样本称量重量(相对标准不确定度=0.000926441%)、样本溶液定容体积(相对标准不确定度=0.0130%)、容量瓶(相对标准不确定度=0.002%)等分量，由此计算出合成标准不确定度为0.014525438%，一般情况下包含因子取2，A-3大麻植物样本中四氢大麻酚测定的扩展不确定度为0.0114%，因此，A-3大麻植物样本中四氢大麻酚测定的含量为0.3921±0.0114%，如表3所示。
表3本次大麻植物定量分析不确定度评定表
3.5法医学意义
随着近年来涉大麻类毒品的违法犯罪活动日益增多，大麻植物与吸食大麻问题已经成为法医毒物分析中的重要内容之一。大麻植物中所含有的精神活性物质四氢大麻酚成瘾性较强，我国将其归为毒品进行严格管制，我国刑法第357条明确规定大麻是毒品，但并未明确大麻植物究竟属于毒品大麻还是工业大麻的标准，可见，当前相关法律法规对工业大麻的立法还不规范。根据欧盟委员会标准和《云南省工业用大麻管理暂行规定》中四氢大麻酚含量<0.3%为工业大麻，但我国目前没有工业大麻的统一标准。与此同时，公安部现行的毒品检验鉴定标准明确了大麻样本的定性定量方法，但是对于在办案过程中缴获的可疑样本进行检验时并没有明确取样部位，检测出四氢大麻酚的含量应达到的标准也没有明确的规定。因此，系统研究大麻植物的特点、有效分布等特征至关重要，尤其是在如甘肃省等全国毒品问题较为严重的区域，为更有效地开展禁毒工作，必须加强大麻植物的地域特征研究，建立规范的检测方法。因此，本实验所得数据可以为法医毒物分析、医学、药学、植物学等领域提供一定的参考依据。
4结论
本实验主要采用GC/MS/SIM分析检测甘肃省玉米地中套种的经济作物大麻植物中3种主要成分的含量，检测的仪器条件、工作曲线、最低检出限符合定量分析要求。实验结果显示：四氢大麻酚在100、50、25、10、5μg/mL浓度范围呈线性，采用1/x加权因子，相关系数0.99826206；大麻二酚在100、50、25、10、5μg/mL浓度范围呈线性，采用1/x2加权因子，相关系数0.99872395；大麻酚在50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL浓度范围呈线性，采用1/x加权因子，相关系数0.99346520。最低检出限为0.001μg/mL。使用甲醇提取大麻植物样本中的主要成分，回收率高。GC/MS/SIM定量检测标准偏差小于0.18%，测量结果不确定度较小，所检测的大麻植物中主要成分四氢大麻酚的含量依次为：树冠>大麻籽>茎皮>杆，而树冠中四氢大麻酚的含量超过了文献报道的工业大麻中四氢大麻酚的含量，均大于0.3%。本实验所得到的数据结果可助力打击毒品犯罪整体工作效能的提升，为涉及毒品原植物类案件侦破提供线索，为涉及毒品原植物类犯罪的行为认定、定罪量刑提供法庭科学依据。
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文章摘自：闫志伟,关江玲,丁斌.GC/MS/SIM定量检测套种大麻植物的主要成分[J].中国刑警学院学报,2021(05):115-121.DOI:10.14060/j.issn.2095-7939.2021.05.013.
