摘 要：本发明涉及生物蛋白分子技术领域，特别是指一种红麻线粒体蛋白COX3抗原多肽及制备多克隆抗体的方法和应用。所述抗原多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。将抗原多肽与载体蛋白KLH偶联，得到多肽‐KLH偶联复合蛋白；与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀乳化后，免疫动物；采集动物的血清，当效价达到1:20000以上采用颈动脉放血方式收集动物血液，制备抗体血清；通过亲和层析纯化抗体血清，得到红麻线粒体蛋白COX3多克隆抗体。本发明通过合成红麻COX3多克隆抗体，检测红麻COX3蛋白在红麻不同细胞质中表达差异，以明确COX3对红麻花药发育的重要影响。
技术要点
1 .利用抗原多肽制备红麻线粒体蛋白COX3多克隆抗体的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将抗原多肽与载体蛋白KLH偶联，得到多肽‐KLH偶联复合蛋白；
（2）将 多 肽‐KLH偶联复合蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀乳化后，免疫动物；
（3）采集经步骤（2）处理的动物的血清，当效价达到1:20000以上采用颈动脉放血方式收集动物血液，制备抗体血清；
（4）通过亲和层析纯化步骤（3）得到的抗体血清，完成红麻线粒体蛋白COX3多克隆抗体的制备；
所述抗原多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2 .根据权利要求1所述的抗原多肽制备红麻线粒体蛋白COX3多克隆抗体的方法，其特
征在于：所述步骤（1）中偶联采用的偶联剂为MBS。
3 .利用权利要求1或2所述方法制备红麻线粒体蛋白COX3多克隆抗体的应用，其特征在于：所述红麻线粒体蛋白COX3多克隆抗体作为COX3蛋白功能研究和检测红麻线粒体蛋白COX3在红麻不同胞质类型表达差异的应用。
技术领域
本发明涉及生物蛋白分子技术领域，特别是指一种红麻线粒体蛋白COX3抗原多肽制备多克隆抗体的方法和应用。
背景技术
完整的线粒体基因转录本是研究植物线粒体基因表达的重要基础。CR-RT-PCR是研究基因转录起始位点和终止位点以及线粒体基因转录本5’和3’转录剪切方式的重要方法(Kuhn and Binder,2002;张丹丹,2016)。5’端存在多个转录起始位点是植物线粒体基因的普遍特征。Kuhn等在12个拟南芥线粒体基因中共发现30个转录起始位点，其中9个线粒体基因含多个转录起始位点，但3’末端只有一个终止位点(Kuhn et al ., 2005;Forneret al ., 2007)；水稻HL-CMS的atp6-orfH79的5’端有2个转录起始位点，同时水稻线粒体基因atp1，atp6和atp9转录本的5’也存在多个转录位点，而3’端只有一个终止位点(Wang et al ., 2013; Kazama et al.,2013)，红麻线粒体基因atp1、atp4和cox3转录本的3’也只有一个转录终止位点，但转录本的5’端存在多个转录起始位点，说明植物mRNA 5’端的不一致性与线粒体基因的翻译有关，并受到核基因的调控(Kazama et al ., 2008; Koizuka etal ., 2003)。RNA加工因子RPF2具有三角五肽状重复序列特征是高等植物线粒体5’mRNA所必需的，RPF2参与线粒体基因nad9 和cox3 mRNA 5’端的形成(Jonietz et al ., 2010)。atp9 转录本5’转录起始位点在两种胞质中一致，而不育系3’转录终止位点比保持系短126bp，这与甜菜不育胞质和可育胞质rps3转录本5’转录起始位点相同，但不育胞质的3’转录终止末端比可育胞质缺少460bp的研究结果一致(Matsunaga et al ., 2011)，表明线粒体基因的转录调控存在多样性。
高等植物线粒体细胞色素c基因主要包含cox1 ，cox2和cox3 ，这些基因的正常发挥
对植物花粉育性具有重要作用(Liu et al ., 2011)。甜菜CMS-G中COX1蛋白表达量低于保
持系，同时cox2突变后C端产生的一个短截分子降低了细胞色素c氧化酶的活性(Meyer et
al ., 2018)。短截的线粒体基因atp4f ，cox1f 和rps3f转化烟草导致烟草雄性不育，使线粒体呼吸活性改变会导致花粉败育。线粒体复合体酶呼吸活力检测和蛋白图谱表明在atp4f ,cox1f 和rps3f转基因植株中复合体I发生改变(Shaya et al ., 2012)。甜菜CMS-G两个突变基因：nad9亚基C-端延伸，而cox2亚基C-末端短截，导致了细胞色素c氧化酶活性降低50%，表明甜菜CMS与呼吸链酶活性的改变密切相关(Ducos et al ., 2001)。但是红麻细胞色素氧化酶相关基因是否与红麻CMS存在必然关系相关，本发明基于前期cox3 转录本在不育系和保持存在差异的研究基础，用Western blot技术检测COX3在红麻UG93A、UG93B和F1（UG93A/UG93R）表达差异，探究COX3是否与参与红麻CMS核质互作调控。
发明内容
本发明提出一种红麻线粒体蛋白COX3抗原多肽及制备多克隆抗体的方法和应用，解决了研究线粒体COX3基因在红麻不同细胞质质中的表达差异中的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种红麻COX3蛋白抗体抗原多肽，所述抗原多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
利用抗原多肽制备红麻线粒体蛋白COX3多克隆抗体的方法，步骤如下：
（1）将抗原多肽与载体蛋白KLH偶联，得到多肽‐KLH偶联复合蛋白；
（2）将 多 肽‐KLH偶联复合蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀乳化后，免疫动物；
（3）采集经步骤（2）处理的动物的血清，当效价达到1:20000以上采用颈动脉放血方式收集动物血液，制备抗体血清；
（4）通过亲和层析纯化步骤（3）得到的抗体血清，完成红麻线粒体蛋白COX3多克隆抗体的制备。
所述步骤（1）中偶联采用的偶联剂为MBS。
制备的红麻线粒体蛋白COX3多克隆抗体的应用，所述红麻线粒体蛋白COX3多克隆抗体作为COX3蛋白功能研究和检测红麻线粒体蛋白COX3在红麻不同材料中的表达差异的应用。
本发明的有益效果在于：
（1）红麻细胞质雄性不育（Cytoplasmic Male Sterility, CMS）与能量代谢缺陷密切相关，ATP是能量代谢最密切的化合物。COX3做为线粒体电子传递链复合体V亚基蛋白，在ATP合成过程中发挥重要作用，因此COX3蛋白功能是否正常发挥，对红麻线粒体能量代谢和花粉发育具有重要影响。COX3是一个含6次跨膜结构域的疏水蛋白，导致其蛋白锚定在线粒体膜上，这一结构特征对研究红麻线粒体COX3蛋白功能产生很大难题。
（2）本发明根据COX3蛋白N端有一段非跨膜结构域，利用多肽‐KLH偶联方法制备COX3蛋白抗体，该抗体能够准确检测红麻内源COX3蛋白表达，而且灵敏度高，特异性强，所杂交蛋白产物无任何背景和杂带，说明该抗体能够稳定用于红麻COX3蛋白功能研究。
（3）本申请发明人在检测COX3蛋白抗体特异性时，以植物β-Actin蛋白为内参，采用红麻不育系UG93A、保持系UG93B和杂交种F1（UG93A/UG93R）为材料检测COX3在不同胞质的表达差异。发现内参蛋白β-Actin在三种不同胞质中稳定表达，而COX3蛋白在不育系UG93A的表达量低于保持系UG93B和杂交种F1。暗示着COX3可能通过蛋白互作方式参与红麻花药发育的能量代谢调控，并与红麻CMS密切相关。本发明为阐明红麻CMS分子机理提供技术方法和理论基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为COX3蛋白跨膜结构的分析图。
图2为红麻不同胞质COX3抗体的免疫检测对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
红麻COX3蛋白抗体制备的流程主要包括以下几个方面：
(一)红麻COX3蛋白序列分析和多肽设计与合成根据GenBank（登录号：MF163174中红麻cox3的gDNA序列设计特异引物扩增cox3的CDS区序列，经ORFfinder 分析得出COX3蛋白序列含280个氨基酸残基，通过ExPASY在线软件（https://web .expasy .org/protparam/）得知其是分子量大小为31.60kDa，等电点为6.72的中性蛋白。用TMHMM Server v. 2 .0（http://www .cbs .dtu .dk/services/TMHMM-2.0/#opennewwindow）分析COX3的二级结构，表明COX3是一个含6次跨膜结构的疏水性蛋白（图1）。进一步分析该蛋白氨基酸序列的抗原性、亲水性、表面亲和性等特征，本发明从COX3的N端筛选了一段多肽序列如SEQ ID NO:1所示适合用作抗原（16aa-29aa）合成COX3的蛋白抗体。为了便于与载体蛋白共轭交联，增加多肽的免疫原性，在上述多肽的C端增加一个半胱氨酸C，因此最终待合成的序列如SEQ ID NO:2所示，用多肽自动仪合成多肽序列。合成的多肽用高相液相色谱仪（HPLC）检测纯度，以及MS质谱仪检测该多肽的分子量为1.71kDa .
（二）多肽与载体蛋白KLH偶联
用MBS（Methyl methacrylate-Butadiene-Styrene，甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯）三元聚合物做偶联剂将多肽与载体蛋白KLH（Keyhole Limpet Hemocyanin，血蓝蛋白）偶联，具体操作流程如下：
①用交联缓冲液溶解载体蛋白KLH至浓度为10mg /mL；
②室温透析2小时或4℃过夜；
③用DMF（Dimethyl Formamide，二甲基甲酰胺）溶解MBS至浓度为10mg/mL；
④将KLH溶液与MBS溶液按10:1(W/W)的比例混合；
⑤室温下孵育30分钟，培养过程中摇动瓶子，使KLH活化；
⑥用Sephadex G‐25树脂清洗活化的KLH溶液，除去多余MBS和反应副产物；
⑦收集活化的KLH溶液，与多肽溶液按1:1(W/W)的比例混合；
⑧室温下孵育3小时，产生多肽‐KLH偶联复合蛋白；
⑨将上述多肽‐KLH偶联复合蛋白在PBS缓冲液中4℃透析过夜；
⑩将得到多肽-KLH偶联复合蛋白分装，‐20℃储存备用。
（三）动物免疫
选取适龄的新西兰雄兔做为免疫动物，免疫前耳部静脉采血2-3mL，用于后续ELISA检测的阴性对照，动物免疫操作流程如下。
①将0.5mg多肽-KLH复合蛋白溶于0.5mL的PBS溶液中，与等体积的弗氏完②全佐剂充分混匀乳化，兔子皮下多点注射；
③2周后，进行首次加强免疫，操作同步骤①；
④此后每隔3周进行同样操作的加强免疫，前后共3次；
⑤每次加强免疫1周后，从兔子耳部静脉采微量血液；
⑥用间接ELISA检测免疫血清效价，当效价达到1:20000以上采用颈动脉放血方式收集兔子血液，制备血清。
（四）COX3多肽亲和层析纯化抗体
本发明中COX3多肽亲和层析纯化抗体的主要流程如下：
①悬浮抗体亲和树脂，转移到干净的纯化柱中，沉淀树脂，使缓冲液从柱中流出；
②加入10体积的PBS缓冲液，平衡树脂；
③将含抗体的血清样本转移到纯化柱上，用核酸蛋白质检测器检测流出液体在A280处的吸收值；
④继续加入PBS洗涤树脂，直到A280吸光度稳定；
⑤使PBS流出层析柱，加入洗脱缓冲液洗脱与树脂结合的抗体；
⑥收集抗体洗脱液，立即用中和缓冲液中和pH；
⑦将抗体洗脱液转移到透析袋中，在PBS缓冲液中4℃透析过夜，得到纯化抗体；
⑧向终浓度为0 .02%的抗体溶液中加入叠氮化钠缓冲液，4℃保存备用。
（五）抗体效价检测
用间接ELISA法检测红麻COX3抗体效价，操作流程如下：
①用包被缓冲液稀释COX3-KLH偶联复合物到浓度为1μg/mL；
②用稀释的复合物包被ELISA板，37℃孵育2小时或4℃过夜；
③去除抗原包被溶液，用洗涤缓冲液清洗三次；
④用5%的脱脂奶粉37℃孵育2小时或4℃过夜；
⑤去除封闭液，用洗涤缓冲液清洗三次；
⑥用封闭缓冲液将COX3抗体进行不同倍数稀释，1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000，1:128000，1:256000，1:512000，在37℃孵育1小时；
⑦除抗体溶液，洗涤缓冲液清洗三次；
⑧用封闭缓冲液稀释HRP-耦合的二抗，37℃下孵育30分钟；
⑨去除二抗溶液，用洗涤缓冲液清洗三次；
⑩加入TMB试剂，15分钟后加入硫酸阻断反应。
?当与阴性血清的比值大于2 .1时，计算抗体效价。经检测本发明中的COX3抗体效价达到1:512000（表1）。
表1 免疫前血清和纯化抗体的ELISA检测结果
注：当信号/空白(signal/blank)>=2 .1时，抗体效价最高；NC 为负对照 (免疫前血清)。
（六）Western Blot检测COX3抗体的特异性
①用TCA/丙酮法提取红麻花药总蛋白 ，采用Bradford蛋白质定量试剂盒（天根）测定红麻花药总蛋白浓度；
②按照标准方法配制12 .5%的SDS-PAGE胶；
③每个材料各取20 μg红麻蛋白样品加入垂直电泳槽中；
④恒压电泳60 V电泳，待样品跑过浓缩胶时，电压调到80 V至溴酚兰刚跑出即可终止电泳；
⑤采用半干转方法转膜，设置胶面积1 .5倍的恒定电流40分钟，将蛋白转到PVDF膜上（使用前PVDF膜必须先在甲醇中浸泡10-15秒）。
⑥用含5%脱脂牛奶的TBST缓冲液室温封闭2小时或4℃过夜；
⑦用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液按照1:500的比例稀释COX3抗体，室温孵育2小时或4℃过夜；
⑧用TBST缓冲液振荡洗涤3次，每次10分钟；
⑨用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液按1:1000的比例稀释HRP-二抗，室温孵育1小时；
⑩用TBST缓冲液振荡洗涤3次，每次10分钟；
?加入ECL底物：室温孵育2-5分钟，用Syngene凝胶成像系统曝光成像；
?植物内参β-actin抗体（购自Abclonal（中国，武汉）生物科技有限公司）的免疫印迹参照COX3抗体的免疫印迹进行，得到免疫印迹结果，见图2。
结果表明：
以植物β-Actin蛋白为内参，用COX3抗体检测目的蛋白在不育系UG93A、保持系UG93B和杂交种F1（UG93A/UG93R）花药的表达，结果显示：COX3抗体能准确检测目的蛋白的表达差异，而且目的条带单一且清晰，没有任何背景和杂带，说明该抗体能够广泛应用于红麻COX3蛋白功能研究；同时，Western Blot结果显示内参蛋白β-Actin在三种不同胞质类型材料中稳定表达，而COX3蛋白在UG93A的表达量明显低于UG93B和F1。暗示着COX3可能通过蛋白互作方式参与红麻花药发育的能量代谢调控过程，进一步推测该蛋白与可能与红麻CMS密切相关。该发明为揭示红麻CMS分子机理提供技术方法和理论基础。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广西大学
<120> 一种红麻线粒体蛋白COX3抗原多肽及制备多克隆抗体的方法和应用
<160> 2
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（1 4）
<400> 1
Met Ile Glu Ser Gln Arg His Ser Tyr His Leu Val Asp Pro
1 10 14
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（1 5）
<400> 2
Met Ile Glu Ser Gln Arg His Ser Tyr His Leu Val Asp Pro Cys
1 10 15
图1
图2
摘自国家发明专利，发明人：廖小芳，赵艳红，孔祥军，周瑞阳，周步进，侯文焕，唐兴富，申请号：201910170567.6，申请日2019.05.24
