摘  要：本发明涉及生物脱胶技术领域，尤其涉及一种用于苎麻生物脱胶预处理的微生物复合菌剂及其制备方法。所述制备方法包括以下步骤：将双足囊菌、厚孢根霉、欧文氏菌、分散泛菌分别接种到培养基中进行培养，得到双足囊菌菌液、厚孢根霉菌液、欧文氏菌菌液和分散泛菌菌液，将这四种菌液混合，获得复合菌剂种子液；将所述复合菌剂种子液接种到复合菌剂培养基中进行混合发酵，得到微生物复合菌剂。本发明提供的制备方法简单、成本较低，能够有效地实现苎麻生物脱胶。

技术要点

1.一种用于苎麻生物脱胶预处理的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将双足囊菌、厚孢根霉、欧文氏菌、分散泛菌分别接种到培养基中进行培养，得到双足囊菌菌液、厚孢根霉菌液、欧文氏菌菌液和分散泛菌菌液，将这四种菌液混合，获得复合菌剂种子液；将所述复合菌剂种子液接种到复合菌剂培养基中进行混合发酵，得到微生物复合菌剂。

2.根据权利要求1所述的用于苎麻生物脱胶预处理的微生物复合菌剂的制备方法， 其特征在于，所述复合菌剂种子液中双足囊菌、厚孢根霉、欧文氏菌、分散泛菌的细胞数分别依次为复合菌剂种子液中细胞总数的30～40％、30～40％、10～15％、10～20％。

3.根据权利要求1所述的用于苎麻生物脱胶预处理的微生物复合菌剂的制备方法， 其特征在于，所述复合菌剂培养基的配制过程为：按重量份计，称取蛋白胨5～10份、酵母粉3～5份、氯化钠2～7份、(NH4)2SO4 0.5～2份、磷酸氢二钾0.5～1.5份、大米米粉5～10份、苎麻原麻5～10份和蒸馏水950～1050份混合，121℃灭菌20min，即得到复合菌剂培养基。

4.根据权利要求1所述的用于苎麻生物脱胶预处理的微生物复合菌剂的制备方法， 其特征在于，所述复合菌剂种子液混合发酵的温度为28～32℃，时间为72～128小时。

5.根据权利要求1所述的用于苎麻生物脱胶预处理的微生物复合菌剂的制备方法， 其特征在于，将双足囊菌和厚孢根霉分别接种到麦芽汁培养基中，在22～30℃的温度条件以及好氧条件下培养48～72小时，得到双足囊菌菌液和厚孢根霉菌液。

6.根据权利要求5所述的用于苎麻生物脱胶预处理的微生物复合菌剂的制备方法， 其特征在于，所述麦芽汁培养基的配制过程为：按重量份计，称取酵母粉2～4份、麦芽提取物2～4份、蛋白胨3～6份、葡萄糖7～15份和蒸馏水950～1050份混合，121℃灭菌20min，即得到麦芽汁培养基。

7.根据权利要求1所述的用于苎麻生物脱胶预处理的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，将欧文氏菌和分散泛菌分别接种到LB培养基中，在30～38℃的温度条件以及好氧条件下培养24～48小时，得到欧文氏菌菌液和分散泛菌菌液。

8.根据权利要求7所述的用于苎麻生物脱胶预处理的微生物复合菌剂的制备方法， 其特征在于，所述LB培养基的配制过程为：按重量份计，称取蛋白胨5～15份、酵母提取物3～10份、氯化钠5～10份和蒸馏水950～1050份混合，121℃灭菌20min，即得到LB培养基。

9.利用权利要求1至8任一项所述制备方法制得的用于苎麻生物脱胶预处理的微生物复合菌剂。

 

技术领域

本发明涉及生物脱胶技术领域，尤其涉及一种用于苎麻生物脱胶预处理的微生物复合菌剂及其制备方法。

 

背景技术

苎麻(学名：Boehmeria nivea(L .)Gaudich .)为荨麻科苎麻属亚灌木或灌木植物) ，其纤维具有高强度高模量的特征，广泛用于工业用复合材料。中国是苎麻产量最大的国家，约占全世界总产量的90％左右。苎麻的原麻中含有20-30％的胶质，胶质广义上泛指原麻中的非纤维素成分，包括半纤维素、果胶、木质素、水溶物、脂蜡质、灰分等，实际生产中的脱胶工艺主要是对半纤维素、果胶成分进行破坏以将纤维分离成单纤维状使其适用于纺织的过程。传统纺织工业中主要采用化学方法，通过酸、碱及氧化物的高温煮练，并通过水洗、打纤等物理机械手段实现胶质与纤维的分离。由于整个过程需要反复的水洗步骤以及酸、碱及氧化剂的大量使用，会造成对水资源的严重浪费和污染，这一问题严重制约着现代纺织工业的发展。

生物脱胶通过酶或微生物的作用，在温和的条件下实现对胶质成分的分解，耗水少、污染轻且不损伤纤维，因此生物脱胶技术的开发和产业化应用成为纺织行业发展的必然趋势。

目前的生物脱胶预处理过程通常使用单一微生物，由于胶质成分复杂，单一微生物分解速度缓慢，同时由于对无菌程度要求较高，环境中杂菌的污染会严重影响脱胶效果。而天然沤麻过程中，在天然的复合菌群的作用下脱胶效果好，然而天然菌群增殖速度缓慢，因此传统沤麻不适用于大规模工业生产。

 

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种能够大规模工业生产、对胶质成分具有良好分解效果的用于苎麻生物脱胶预处理的微生物复合菌剂，解决纺织工业传统化学脱胶工艺中水资源浪费以及污染环境的难题；本发明还提供了该微生物复合菌剂的制备方法，制备方法简单、成本较低，能够有效地实现苎麻生物脱胶。

本发明提供一种用于苎麻生物脱胶预处理的微生物复合菌剂的制备方法，步骤为：将双足囊菌(Dipodascus klebahnii)、厚孢根霉(Rhizopus chlamydosporus)、欧文氏菌(Erwinia amylovora)、分散泛菌(Pantoea dispersa)分别接种到各自特定培养基中进行培养，得到双足囊菌菌液、厚孢根霉菌液、欧文氏菌菌液和分散泛菌菌液，将这四种菌液混合，获得复合菌剂种子液；将复合菌剂种子液接种到复合菌剂培养基中进行混合发酵，得到微生物复合菌剂。

进一步地，所述复合菌剂种子液中双足囊菌、厚孢根霉、欧文氏菌、分散泛菌的细胞数分别依次为复合菌剂种子液中细胞总数的30～40％、30～40％、10～15％、10～20％。

进一步地，所述复合菌剂培养基的配制过程为：按重量份计，称取蛋白胨5～10份、酵母粉3～5份、氯化钠2～7份、(NH4)2SO4 0.5～2份、磷酸氢二钾0.5～1.5份、大米米粉5～10份、苎麻原麻5～10份和蒸馏水950～1050份混合，121℃灭菌20min，即得到复合菌剂培养基。

进一步地，所述复合菌剂培养基的pH值为7.0～7.2。

进一步地，所述复合菌剂种子液混合发酵的温度为28～32℃，时间为72～128小时。

进一步地，将双足囊菌接种到麦芽汁培养基中，在22～30℃的温度条件以及好氧条件下培养48～72小时，得到双足囊菌菌液。

进一步地，将厚孢根霉接种到麦芽汁培养基中，在22～30℃的温度条件以及好氧条件下培养48～72小时，得到厚孢根霉菌液。

进一步地，所述麦芽汁培养基的配制过程为：按重量份计，称取酵母粉2～4份、麦芽提取物2～4份、蛋白胨3～6份、葡萄糖7～15份和蒸馏水950～1050份混合，121℃灭菌20min，即得到麦芽汁培养基。

进一步地，所述麦芽汁培养基的pH值为7.0～7.2。

进一步地，将欧文氏菌接种到LB培养基中，在30～38℃的温度条件以及好氧条件下培养24～48小时，得到欧文氏菌菌液。

进一步地，将分散泛菌接种到LB培养基中，在30～38℃的温度条件以及好氧条件下培养24～48小时，得到分散泛菌菌液。

进一步地，所述LB培养基的配制过程为：按重量份计，称取蛋白胨5～15份、酵母提取物3～10份、氯化钠5～10份和蒸馏水950～1050份混合，121℃灭菌20min，即得到LB培养基。

进一步地，所述LB培养基的pH值为7.0～7.2。

本发明还提供了利用上述制备方法制得的用于苎麻生物脱胶预处理的微生物复合菌剂。

本发明通过将双足囊菌、厚孢根霉、欧文氏菌、分散泛菌分别进行培养，使双足囊菌、厚孢根霉、欧文氏菌、分散泛菌进行大量的繁殖，在其达到较高的活性和生长状态后，得到双足囊菌菌液、厚孢根霉菌液、欧文氏菌菌液、分散泛菌菌液；然后将菌液按照特定比例混合，进一步在复合菌剂培养基中混合发酵，获得微生物复合菌剂，微生物复合菌剂中的各种菌协同作用，能够实现对苎麻中胶质成分的高效分解。

本发明提供的技术方案带来的有益效果是：利用本发明提供的微生物复合菌剂进行苎麻生物脱胶预处理时，耗能耗水少，解决了纺织工业传统化学脱胶工艺中水资源浪费以及污染环境的难题；本发明提供的微生物复合菌剂中的多种微生物协同作用，能够实现苎麻中胶质成分的有效分解，提高了生物脱胶速度，脱胶效果好不伤麻纤维，同时通过菌剂的应用解决了天然菌群增殖速度慢的问题。

 

附图说明

图1是本发明一种用于苎麻生物脱胶预处理的微生物复合菌剂的制备方法的流程示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例和附图对本发明实施方式作进一步地描述。

以下实施例中，使用的双足囊菌、厚孢根霉、欧文氏菌、分散泛菌均购自明舟生物。优选地，双足囊菌的商品货号为ATCC42397，厚孢根霉的商品货号为ACCC30302，欧文氏菌的商品货号为ATCC 51855，分散泛菌的商品货号为BMZ068228。

实施例1：

本发明的实施例1提供了一种用于苎麻生物脱胶预处理的微生物复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)、配制pH值为7.0的麦芽汁培养基：称取酵母粉30g、麦芽提取物30g、蛋白胨45g、葡萄糖115g和蒸馏水10L混合，121℃灭菌20min；

(2)、配制pH值为7.0的LB培养基：称取蛋白胨100g、酵母提取物80g、氯化钠75g和蒸馏水10L混合，121℃灭菌20min；

(3)、配制pH值为7.0的复合菌剂培养基：称取蛋白胨80g、酵母粉40g、氯化钠55g、(NH4)2SO4 15g、磷酸氢二钾10g、大米米粉70g、苎麻原麻80g和蒸馏水10L混合，121℃灭菌 20min；

(4)、制备微生物复合菌剂：将双足囊菌和厚孢根霉分别接种到麦芽汁培养基中， 在25℃的温度条件以及好氧条件下培养60小时，得到双足囊菌菌液和厚孢根霉菌液；将欧文氏菌和分散泛菌分别接种到LB培养基中，在35℃的温度条件以及好氧条件下培养36小时，得到欧文氏菌菌液和分散泛菌菌液；将双足囊菌菌液、厚孢根霉菌液、欧文氏菌菌液和分散泛菌菌液混合，获得复合菌剂种子液；将复合菌剂种子液接种到复合菌剂培养基中在30℃的温度条件及好氧条件下培养96小时，得到微生物复合菌剂。

复合菌剂种子液中双足囊菌、厚孢根霉、欧文氏菌、分散泛菌的细胞数分别依次为复合菌剂种子液中细胞总数35％、35％、12％、18％。

实施例1中每10g为一份。实施例1的制备过程见图1。

实施例1采用对照实验对微生物脱胶过程进行分析，具体设置实验组一和对照组一至六，实验组一为将苎麻加入到上述配制的复合菌剂培养基，接种实施例1制备的微生物复合菌剂；对照组一为将苎麻加入到上述配制的复合菌剂培养基，接种双足囊菌和厚孢根霉；对照组二为将苎麻加入到上述配制的复合菌剂培养基，接种欧文氏菌和分散泛菌；对照组三为将苎麻加入到上述配制的复合菌剂培养基，接种双足囊菌、欧文氏菌和分散泛菌；对照组四为将苎麻加入到上述配制的复合菌剂培养基，接种厚孢根霉、欧文氏菌和分散泛菌；对照组五为将苎麻加入到上述配制的复合菌剂培养基，接种双足囊菌、厚孢根霉和欧文氏菌；对照组六为将苎麻加入到上述配制的复合菌剂培养基，接种双足囊菌、厚孢根霉和分散泛菌。

上述实验一和对照组一至六中，苎麻的添加比例为1-5g苎麻/100ml培养基，菌剂

的接种量为1％-5％。

将实验组一、对照组一至六在30℃温度条件以及好氧条件下培养72h，取出后80℃烘干至恒重对苎麻成分(脂蜡质含量、水溶物含量、果胶物含量、半纤维素含量、纤维素含量)进行测定，苎麻成分分析方法参照国标参照GB5889—1986《苎麻化学成分定量分析方法》进行测定。胶质降解率＝(原麻残胶率-72h样品残胶率)/原麻残胶率×100，测定结果见表1。

表1：苎麻成分测定

 

取上述72h培养液10000rpm离心5min收集上清液，分别测甘露糖酶酶活、木聚糖酶酶活(均参照GB/T 23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定，分别以甘露聚糖和木聚糖为底物，通过DNS法测底物水解产生的还原糖的含量)、果胶酶酶活(QB/T 4482-2013碱性果胶酶制剂) ，测定结果见表2。

表2：酶活测定结果

 

从表1和表2可以看出，在各种菌的协同作用下，实验组一的微生物复合菌剂具有最高的果胶酶、甘露糖酶、木聚糖酶酶活，对苎麻中的果胶、水溶物、半纤维素具有最佳的分解效果，胶质降解率最高达62.52％，实现了对苎麻的有效脱胶；同时在脱去胶质成分的同时，很好的保留了苎麻中的纤维素成分，在脱胶预处理后纤维素含量提升至87 .82％。

实施例2：

本发明的实施例2提供了一种用于苎麻生物脱胶预处理的微生物复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)、配制pH值为7.2的麦芽汁培养基：称取酵母粉25g、麦芽提取物25g、蛋白胨55g、葡萄糖85g和蒸馏水10L混合，121℃灭菌20min；

(2)、配制pH值为7.2的LB培养基：称取蛋白胨120g、酵母提取物60g、氯化钠65g和蒸馏水10L混合，121℃灭菌20min；

(3)、配制pH值为7.2的复合菌剂培养基：称取蛋白胨65g、酵母粉35g、氯化钠45g、(NH4)2SO4  18g、磷酸氢二钾8g、大米米粉60g、苎麻原麻70g和蒸馏水10L混合，121℃灭菌20min；

(4)、制备微生物复合菌剂：将双足囊菌和厚孢根霉分别接种到麦芽汁培养基中， 在28℃的温度条件以及好氧条件下培养60小时，得到双足囊菌菌液和厚孢根霉菌液；将欧文氏菌和分散泛菌分别接种到LB培养基中，在37℃的温度条件以及好氧条件下培养36小时，得到欧文氏菌菌液和分散泛菌菌液；将双足囊菌菌液、厚孢根霉菌液、欧文氏菌菌液和分散泛菌菌液混合，获得复合菌剂种子液；将复合菌剂种子液接种到复合菌剂培养基中在30℃的温度条件及好氧条件下培养84小时，得到微生物复合菌剂。复合菌剂种子液中双足囊菌、厚孢根霉、欧文氏菌、分散泛菌的细胞数分别依次为复合菌剂种子液中细胞总数32％、38％、14％、16％。

实施例2中每10g为一份。

将苎麻加入到上述配制的复合菌剂培养基(苎麻的添加比例为1-5g苎麻/100ml培养基) ，按接种量1％-5％接种实施例2制备的微生物复合菌剂，在30℃温度条件以及好氧条件下培养72h，取出后80℃烘干至恒重对苎麻成分(脂蜡质含量、水溶物含量、果胶物含量、半纤维素含量、纤维素含量)进行测定，测定结果见表3。

取上述72h培养液10000rpm离心5min收集上清液，分别测甘露糖酶酶活、木聚糖酶酶活(均参照GB/T 23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定，分别以甘露聚糖和木聚糖为底物，通过DNS法测底物水解产生的还原糖的含量)、果胶酶酶活(QB/T 4482-2013碱性果胶酶制剂) ，测定结果见表3。

表3：制备的微生物复合菌剂的测试结果

 

实施例3：

本发明的实施例3提供了一种用于苎麻生物脱胶预处理的微生物复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)、配制pH值为7.0的麦芽汁培养基：称取酵母粉35g、麦芽提取物35g、蛋白胨55g、葡萄糖75g和蒸馏水10L混合，121℃灭菌20min；

(2)、配制pH值为7.0的LB培养基：称取蛋白胨135g、酵母提取物90g、氯化钠95g和蒸馏水10L混合，121℃灭菌20min；

(3)、配制pH值为7.0的复合菌剂培养基：称取蛋白胨95g、酵母粉45g、氯化钠65g、(NH4)2SO4 18g、磷酸氢二钾12g、大米米粉85g、苎麻原麻85g和蒸馏水10L混合，121℃灭菌 20min；

(4)、制备微生物复合菌剂：将双足囊菌和厚孢根霉分别接种到麦芽汁培养基中， 在25℃的温度条件以及好氧条件下培养66小时，得到双足囊菌菌液和厚孢根霉菌液；将欧文氏菌和分散泛菌分别接种到LB培养基中，在35℃的温度条件以及好氧条件下培养48小时，得到欧文氏菌菌液和分散泛菌菌液；将双足囊菌菌液、厚孢根霉菌液、欧文氏菌菌液和分散泛菌菌液混合，获得复合菌剂种子液；将复合菌剂种子液接种到复合菌剂培养基中在30℃的温度条件及好氧条件下培养120小时，得到微生物复合菌剂。复合菌剂种子液中双足囊菌、厚孢根霉、欧文氏菌、分散泛菌的细胞数分别依次为复合菌剂种子液中细胞总数32％、36％、14％、18％。实施例3中每10g为一份。

将苎麻加入到上述配制的复合菌剂培养基(苎麻的添加比例为1-5g苎麻/100ml培养基) ，按接种量1％-5％接种实施例3制备的微生物复合菌剂，在30℃温度条件以及好氧条件下培养72h，取出后80℃烘干至恒重对苎麻成分(脂蜡质含量、水溶物含量、果胶物含量、半纤维素含量、纤维素含量)进行测定，测定结果见表4。

取上述72h培养液10000rpm离心5min收集上清液，分别测甘露糖酶酶活、木聚糖酶酶活(均参照GB/T 23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定，分别以甘露聚糖和木聚糖为底物，通过DNS法测底物水解产生的还原糖的含量)、果胶酶酶活(QB/T 4482-2013碱性果胶酶制剂) ，测定结果见表4。

表4：制备的微生物复合菌剂的测试结果

 

在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

 

摘自国家发明专利，发明人：王轶，郭鹏，申请号202010600961 .1，申请日2020 .06 .29