摘 要：本发明公开了一种可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素及其制备方法和应用，以新鲜的具抗炎作用的黄麻叶为原料，依次经过石油醚脱脂、85％乙醇除杂糖、多酶解、灭酶、干燥、酸碱除杂和超声破碎获得成分相对单一的黄麻纳米纤维素。与其他方法相比，本发明工艺操作简单，原理切实可行，过程绿色环保，仅需要短时间超声破碎处理就可以完成最后纳米纤维素的生产，大大降低了设备耗能。本发明制备的黄麻纳米纤维素还可以用于调节肠道微生物，尤其是显著增加受抗生素胁迫后肠道核心细菌的丰度和显著减少肠道病原真菌丰度。
技术要点
1.一种可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)脱脂除杂：将新鲜黄麻叶搅碎烘干得到黄麻叶渣粉，然后经石油醚脱脂，脱脂后用85％的乙醇除杂糖处理，之后再经干燥，得到黄麻叶粉末；
(2)酶解：取所述的黄麻叶粉末加入0.1M磷酸缓冲液，制备成溶液；使用淀粉葡萄糖苷酶对所述溶液进行第一次酶解，第一次酶解后进行第一次灭酶失活；第一次灭酶失活后冷却到室温使用α-淀粉酶进行第二次酶解，第二次酶解后冷却到室温进行第二次灭酶失活；第二次灭酶失活后冷却到室温使用中性蛋白酶进行第三次酶解，第三次酶解后进行第三次灭酶失活，得混合液，冷却到室温后继续抽滤混合液收集滤渣并烘干，得到不可溶纤维素；
(3)除杂：对所述不可溶纤维素依次用氢氧化钠溶液和硝酸溶液处理得到成分相对单一的纤维素；
(4)纤维素纳米化：在所述的成分相对单一的纤维素加入蒸馏水，继续超声破碎后即可得纳米纤维素。
2.根据权利要求1所述可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的黄麻叶渣粉与石油醚的料液比为1g：5mL-10mL；
所述的黄麻叶渣粉与85％的乙醇的料液比为1g：5mL-10mL。
3.根据权利要求1所述可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的黄麻叶粉末与磷酸缓冲液的料液比比为1g：10mL-20mL。
4.根据权利要求1所述可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，采用淀粉葡萄糖苷酶进行第一次酶解反应的条件为：反应温度为45-55℃，pH值为5.5-6.5，反应时间为60-90min，酶解反应时以40-60rpm/min的转速匀速搅拌；
第一次灭酶失活的条件为：加热至95-100℃，反应时间为10-15min，并以40-60rpm/min的转速匀速搅拌。
5.根据权利要求1所述可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述α-淀粉酶进行第二次酶解的反应条件：温度为45-55℃，pH为6.5-7.5，时间为60-90min，酶解反应时以40-60rpm/min的转速匀速搅拌；
第二次灭酶失活条件为：加热至95-100℃，反应时间为10-15min，并以40-60rpm/min的转速匀速搅拌。
6.根据权利要求1所述可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的中性蛋白酶进行第三次酶解反应的条件为温度为45-55℃，pH为6.5-7.5，时间为60-90min，酶解反应时以40-60rpm/min的转速匀速搅拌。
第三次灭酶失活条件：加热至95-100℃，反应时间为10-15min，并以40-60rpm/min的转速匀速搅拌。
7.根据权利要求1所述可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，用氢氧化钠溶液处理的具体步骤为：在90-100℃下用pH为11.5-12.5的氢氧化钠溶液处理所述的不可溶纤维素60-90min，处理后离心，将离心后的沉淀物用蒸馏水洗涤多次至中性取沉淀物；其中，不可溶纤维素与氢氧化钠溶液的料液比为1g：5mL-10mL；
用硝酸溶液处理的具体步骤为：将上述得到的中性沉淀物在90-100℃下用pH为1.5-2.5的硝酸溶液处理60-90min，之后进行离心，将离心后的沉淀物用蒸馏水洗涤多次至中性取沉淀物，将洗涤后的沉淀物烘干粉碎得到成分相对单一的纤维素；其中，不可溶纤维素与硝酸溶液的料液比为1g：5mL-10mL。
8.根据权利要求1所述可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素的制备方法，其特征在于，步骤(5)超声破碎的条件为：变幅杆为6号，55％功率，为避免超声过程中溶液过热，在4℃下进行超声1s停1s，总超声时间为20-25min。
9.一种可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素，其特征在于，根据权利要求1-8中任一项所述的制备方法制得。
10.一种可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素在调节肠道菌群中的应用，其特征在于，使用权利要1-8任一项所述的制备方法制备的可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素和权利要求9所述的可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素调节受抗生素胁迫后肠道核心细菌的丰度和肠道病原真菌丰度。
技术领域
本发明涉及纳米纤维素制备技术领域，尤其涉及一种可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素及其制备方法和应用。
背景技术
膳食纤维在人体消化系统中具有多种功能特性，可调节肠道微生物；促进肠蠕动、防治便秘；减少摄入热量，利于减肥等。而最近一项研究表明，降低胆固醇效应是由非精制植物食物中的纤维组合中的个别成分所驱动的，且高剂量摄入高纤维食物时还会导致一种称之为丙氨酸氨基转移酶的肝脏酶类和机体炎性水平的增加，表明过多的纤维摄入或许是有害的。膳食纤维又称食物纤维，它并非单一物质而是许多复杂有机物质的混合物。从化学角度来看，纤维在长度、分支、溶解性、电荷以及其它特性上是多种多样的，其通能被作为植物源性的复杂化合物来进行研究，因此非常有必要确定单一纤维对机体微生物组的纯粹影响效应。
而成分相对单一的纳米纤维素与纤维素纤维相比具有许多优异的性能，被广泛应用于食品和医药等领域。事实上，纳米纤维素材料不仅具有可食用、可降解、可再生等优良特性，还具有纳米颗粒的高亲水性、高分散性、高纯度和超精细结构等特性，是一种环境友好型天然食品材料。关于纳米纤维素的功能研究主要集中在递送材料方面，而普遍对其调控肠道菌群和提高宿主免疫的研究很少。目前几乎没有关于可调控肠道菌群的纳米纤维素的制备方法。
多项临床试验也表明黄麻叶多糖具有抗炎、提高免疫、抗肿瘤等中扮演着重要的角色，且无毒副作用，可能是潜在的疾病治疗药物。因此，从黄麻叶中提取膳食纤维并制成纳米纤维素，对实现纳米纤维素的多功能作用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素及其制备方法和应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述问题，本发明提供了一种可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素的制备方法，包括如下步骤：
(1)脱脂除杂：将新鲜黄麻叶搅碎烘干得到黄麻叶渣粉，然后经石油醚脱脂，脱脂后用85％的乙醇除杂糖处理，干燥，得到黄麻叶粉末；
(2)酶解：取所述的黄麻叶粉末加入0.1M磷酸缓冲液，制备成溶液；使用淀粉葡萄糖苷酶对所述溶液进行第一次酶解，第一次酶解后进行第一次灭酶失活；第一次灭酶失活后使用α-淀粉酶进行第二次酶解，第二次酶解后进行第二次灭酶失活；第二次灭酶失活后使用中性蛋白酶进行第三次酶解，第三次酶解后进行第三次灭酶失活，得混合液，之后抽滤混合液收集滤渣并烘干，得到不可溶纤维素；
(3)除杂：对所述不可溶纤维素依次用氢氧化钠溶液和硝酸溶液处理得到成分相对单一的纤维素；
(4)纤维素纳米化：在所述的成分相对单一的纤维素加入蒸馏水，继续超声破碎后即可得纳米纤维素。
优选地，步骤(1)中，所述的黄麻叶渣粉与石油醚的料液比为1g：5mL-10mL；
所述的黄麻叶渣粉与85％的乙醇的料液比为1g：5mL-10mL。
优选地，步骤(2)中，所述的黄麻叶粉末与磷酸缓冲液的料液比比为1g：10mL-20mL；
优选地，采用淀粉葡萄糖苷酶进行第一次酶解反应的条件为：反应温度为45-55℃，pH值为5.5-6.5，反应时间为60-90min，酶解反应时40-60rpm/min的转速匀速搅拌；
第一次灭酶失活的条件为：加热到95-100℃，反应时间为10-15min，并以40-60rpm/min的转速匀速搅拌。
优选地，步骤(2)中，所述α-淀粉酶进行第二次酶解的反应条件：反应温度为65-75℃，pH为5.5-6.5，反应时间为45-90min，酶解反应时以40-60rpm/min的转速匀速搅拌；
第二次灭酶失活的条件为：加热到95-100℃，反应时间为10-15min，并以40-60rpm/min的转速匀速搅拌。
优选地，步骤(2)中，所述的中性蛋白酶进行酶解反应的条件为温度为45-55℃，pH为6.5-7.5，时间为60-90min，酶解反应时以40-60rpm/min的转速匀速搅拌；
第三次灭酶失活条件：在95-100℃条件下保持加热10-15min，使酶灭活。
优选地，步骤(3)中，用氢氧化钠溶液处理的具体步骤为：在90-100℃下用pH为11.5-12.5的氢氧化钠溶液处理所述的不可溶纤维素60-90min，处理后离心，将离心后的沉淀物用蒸馏水洗涤多次至中性取沉淀物；其中，不可溶纤维素与氢氧化钠溶液的料液比为1g：5mL-10mL；
用硝酸溶液处理的具体步骤为：将上述得到的中性沉淀物在90-100℃下用pH为1.5-2.5的硝酸溶液处理60-90min，之后进行离心，将离心后的沉淀物用蒸馏水洗涤多次至中性取沉淀物，将洗涤后的沉淀物烘干粉碎得到成分相对单一的纤维素；其中，不可溶纤维素与硝酸溶液的料液比为1g：5mL-10mL。
优选地，步骤(5)超声破碎的条件为：变幅杆为6号，55％功率，为避免超声过程中溶液过热，在4℃下进行超声1s停1s，总超声时间为20-25min。
本发明还提出一种可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素，根据本发明所述的制备方法制得。
本发明还提出一种可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素在调节肠道菌群中的应用，使用本发明所述的制备方法制备的可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素和本发明所述的可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素调节受抗生素胁迫后肠道核心细菌的丰度和肠道病原真菌丰度。
本发明的一种可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素及其制备方法和应用与已有技术相比具有以下优点：
本发明主要通过利用多酶法获取纤维素，之后通过超声破碎制备了微纳米纤维素，可以实现无废生物精炼，其工艺操作简单，原理切实可行，过程绿色环保，且同时实现了微纳米纤维素纤维的制备和黄麻叶的高值化利用，符合“生物质资源化利用”的理念。
本发明制备的黄麻纳米纤维素可以用于调节肠道微生物，尤其显著增加受抗生素胁迫后肠道细菌的丰度和显著减少肠道病原真菌丰度。
附图说明
图1为实施例1制备得到的黄麻纳米纤维素的扫描电镜图；
图2为实施例2模式昆虫蜜蜂受抗生素胁迫后肠道细菌绝对丰度图。
图3为实施例2模式昆虫蜜蜂受抗生素胁迫后肠道真菌相对丰度图。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
本发明中可先将新鲜黄麻叶和水按照质量比为1：5混合，然后用浆渣分离磨浆机磨浆，之后抽滤烘干粉碎即得黄麻叶渣粉。
本发明的可调节肠道菌群的黄麻纳米纤维素的制备方法包括如下步骤：
1)在黄麻叶渣粉中加入石油醚等烷烃有机溶剂浸泡3小时进行脱脂，并放在磁力搅拌器上进行搅拌，脱脂完成后进行抽滤；在获得的滤渣中加入85％的乙醇浸泡3小时进行除杂糖，放在磁力搅拌器上进行搅拌，除杂糖处理完成后进行抽滤；将除杂糖后的滤渣放在60℃烘箱中进行干燥，并用75％的乙醇清洗3次后再干燥，之后用粉碎机进行粉碎；
(2)在上述粉碎后的粉末中加入0.1M磷酸缓冲液，并调节pH到5.5-6.5，继续加入淀粉葡萄糖苷酶后设置40～60rpm/min匀速搅拌，在45-55℃进行第一次酶解60-90min，酶解结束之后在95℃-100℃加热10-15min进行第一次灭酶失活；
第一次灭酶失活后使用α-淀粉酶进行第二次酶解，第二次酶解后进行第二次灭酶失活；步骤(2)中，所述α-淀粉酶进行第二次酶解的反应条件：反应温度为65-75℃，pH为5.5-6.5，反应时间为45-90min，酶解反应时以40-60rpm/min的转速匀速搅拌。
第二次灭酶失活条件为：加热到95-100℃，反应时间为10-15min，并以40-60rpm/min的转速匀速搅拌。
第二次灭酶失活后，在pH为6.5-7.5的条件下，继续加入中性蛋白酶，以40-60rpm/min的转速匀速搅拌，在45-55℃进行第三次酶解60-90min；第三次酶解后在95-100℃条件下保持加热10-15min进行第三次灭酶失活，得混合液；继续抽滤混合液收集滤渣并烘干，得到不可溶纤维素。
每次灭酶失活后均需要降温到室温。
(3)除杂：用氢氧化钠溶液处理的具体步骤为：
在90-100℃下用pH为11.5-12.5的氢氧化钠溶液处理所述的不可溶纤维素60-90min，处理后离心，将离心后的沉淀物用蒸馏水洗涤多次至中性取沉淀物；其中，不可溶纤维素与氢氧化钠溶液的料液比为1g：5mL-10mL；
将上述得到的中性沉淀物在90-100℃下用pH为1.5-2.5的硝酸溶液处理60-90min，之后进行离心，将离心后的沉淀物用蒸馏水洗涤多次至中性取沉淀物，将洗涤后的沉淀物烘干粉碎得到成分相对单一的纤维素；其中，不可溶纤维素与硝酸溶液的料液比为1g：5mL-10mL。
(4)纤维素纳米化：在所述的成分相对单一的纤维素加入蒸馏水，继续超声破碎后即可得纳米纤维素，超声破碎的条件为：变幅杆为6号，55％功率，为避免超声过程中溶液过热，在4℃下进行超声1s停1s，总超声时间为20-25min。
步骤(1)中，所述的黄麻叶渣粉与石油醚的料液比为1g：5mL-10mL；
所述的黄麻叶渣粉与85％的乙醇的料液比为1g：5mL-10mL。
步骤(2)中，所述的黄麻叶粉末与磷酸缓冲液的料液比为1g：10mL-20mL。
实施例1
黄麻纳米纤维素制备，步骤如下：
(1)将新鲜的黄麻叶烘干粉碎后，粉碎烘干后的黄麻叶用石油醚进行脱脂，脱脂后用85％的乙醇进行除杂糖，干燥得到黄麻叶粉末；其中，每1g烘干粉碎后的黄麻叶加入10mL的石油醚，每1g的烘干粉碎后的黄麻叶用10mL的85％的乙醇除杂糖。
(2)在步骤(1)得到的黄麻叶粉末中加入磷酸缓冲液，调节pH为6，依次经淀粉葡萄糖苷酶和α-淀粉酶除淀粉，之后使用中性蛋白酶处除蛋白，每次酶解后均需要加热灭酶失活；第三次灭酶后用真空抽滤后得到滤渣即为不可溶膳食纤维；
(3)称取步骤(2)得到的不可溶膳食纤维，然后按料液比1g：5mL加入pH12的氢氧化钠等强碱溶液处理1小时后用蒸馏水洗至中性。接着将强碱处理后的不可溶纤维也按料液比1g：5mL加入pH2的硝酸等强酸溶液处理1小时，再经蒸馏水冲洗中性后烘干并粉碎，得到成分相对单一的纤维素；
(4)称取步骤(3)中成分相对单一的纤维素，按料液比1g：500mL加入无菌蒸馏水，经超声破碎20-25min后即可得纳米纤维素，超声时在4℃下进行超声1s停1s。
如图1所示：图1为本实施例1获得的纳米纤维素的扫描电镜图(SEM)，从图中可以清晰的看到成功分离出的纳米纤维素，并且已经达到了纳米级别的尺寸。
实施例2
我们以模式昆虫蜜蜂为例，将出房蜂放入自制的饲养盒中，饲喂50％的糖水，每组3个重复，每个重复30只蜂，对照组不做任何处理，处理组添食1000μg/mL的四环素(根据文献报道修改)，实验组添食四环素的同时添食不同浓度(高浓度：100μg/mL，中浓度：10μg/mL 和低浓度：1μg/mL)上述制备的黄麻纳米纤维素，连续喂7天。每天统计死亡蜜蜂数，并收集蜂样的肠道及肠道内容物并立即存放于-80℃ ， 便于进行后续检测肠道菌群的丰度。在饲养实验结束后，使用E .Z .N .A.Stool DNAKit(Omega Bio-Tek，USA)提取粪便微生物DNA，具体步骤参照使用说明书进行即可。之后使用NanoDrop分光光度计(Thermo Electron)测浓度，每个样品测3次，取平均值后将DNA浓度进行定量到1μg/μL，95度加热3min后立即至于冰上。使用引物Universal_F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT)和Universal_R(TATTACCGCGGCTGCTGGC) 对 细 菌 1 6 Sr RNA 基 因 的 V 3 - V 4 区 域 进 行 荧 光 定 量PCR扩 增。使 用 引 物 1 8 s_ F (CGAACGTCTGCCCTATCAACTT)和18s_R(CCGGAATCGAACCCTGATT)对真菌18SrRNA基因的V3-V4区域进行荧光定量PCR扩增。使用的荧光定量PCR试剂盒为诺唯赞的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京，中国)，具体步骤参照使用说明书进行即可，PCR程序分为：将混合物加热至95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃扩增32s，40个循环。熔解曲线程序为仪器自带程序，使用的荧光定量PCR仪为美国伯乐的CFX96Touch。细菌的绝对丰度是根据标准曲线计算 出 的拷 贝数，具体步骤如下：以其 中一个样 品为扩增模板，使用Univer sal__F和 Universal_R为扩增引物，其PCR条件为，在95℃孵育预变性1min，其相应的循环参数为94℃下变性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸1min，33个循环；随后在72℃下终延伸10min，于4℃下冷却。紧接着将PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，证实与目标大小一致。用DNA凝胶回收与纯化试剂盒(江苏康为世纪生物科技股份有限公司)对目的片段进行回收纯化，其主要步骤参照说明书进行。最后用洗脱缓冲液将目标DNA洗脱，并收集于管中，使用NanoDrop分光光度计(Thermo Electron)测浓度。根据浓度和分子量大小将目标DNA定量到109copies/μL，并进行梯度稀释至108、107、106、105、104、103、102copies/μL，以梯度稀释的标准品为模板，用CFX96Touch进行荧光定量PCR反应，荧光定量PCR反应体系与上述中描述的一致，每个梯度样品进行第三次重复实验，获得标准曲线。
根据标准曲线获得每个样品中细菌的绝对丰度，如图2所示：图2为本实施例2中受抗生素胁迫后以及使用黄麻纳米纤维素进行改善后的模式昆虫蜜蜂肠道细菌绝对丰度图。从图中可以清晰的看到抗生素处理能显著减少肠道细菌丰度，而高中低浓度的黄麻纳米纤维素均能显著改善受抗生素胁迫后肠道细菌丰度，其肠道细菌丰度甚至高于健康蜜蜂。之后以16SrRNA基因为内参，计算真菌的相对丰度，如图3所示：图3为本实施例2中受抗生素胁迫后以及使用黄麻纳米纤维素进行改善后的模式昆虫蜜蜂肠道真菌相对丰度图。从图中可以清晰的看到三个浓度的黄麻纳米纤维素均能显著减少肠道真菌丰度。
最后应说明的是：显然，上述实施例只为清楚地解释本发明所作的例子，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员及其他人员来说，在上述说明的基础上还可以进行其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
摘自国家发明专利，发明人：邓春炎，侯春生，杨修仕，迟海洋，刘京宏，申请号：202310382053.3，申请日：2023.04.12
