摘 要：目的：2C类蛋白磷酸酶（PP2Cs）参与植物多种信号转导途径。其通过负调节丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路参与植物多种胁迫响应和代谢产物合成的调控。对工业大麻PP2C（CsPP2Cs）基因家族进行全基因组鉴定及表达分析，以期为研究CsPP2Cs在工业大麻生长发育过程中的生物学功能提供参考。方法：利用MEGA X构建系统发育树，利用ExPASy、WoLF PSORT、MEME、Batch-CD-Search、PlantCare、TBtools分别对CsPP2Cs蛋白理化性质、亚细胞定位、保守基序、蛋白结构域、CsPP2Cs基因启动子顺式作用元件和与拟南芥PP2Cs(AtPP2Cs)基因的共线性进行预测和分析。通过转录组数据和实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）对CsPP2Cs基因表达进行分析和验证。结果：从工业大麻全基因组中共鉴定出52个具有保守结构域的PP2Cs，基因编码蛋白长度从244~1089个氨基酸不等，相对分子质量在26.76~122.53kDa，亚细胞定位主要分布于细胞核、细胞质和叶绿体。系统进化树将52个CsPP2Cs分为10个亚族和5个未分组成员。共线性分析发现，工业大麻与拟南芥存在7对同源基因。顺式元件预测显示光响应元件和脱落酸元件居多。基因表达热图显示，相同基因在各组织中存在差异表达。对部分基因进行Real-time PCR验证，进一步证实了转录组数据的准确性。同时，可变剪切分析表明部分CsPP2Cs基因在进化过程中存在可变剪切本。结论：从全基因组层面对CsPP2Cs进行了分析和预测，提示CsPP2Cs可能广泛参与工业大麻的多种生物学过程，为进一步研究CsPP2Cs功能奠定了基础。
关键词：工业大麻；PP2C 基因家族；成员鉴定；功能预测；表达分析
大麻（Cannabis sativa）是大麻科（Cannabinaceae）大麻属(Cannabis)一年生草本植株，多雌雄异株，生长适应能力强，各国均有分布[1]。大麻具有广泛的药用价值，食用价值和工业价值。火麻仁为成熟的大麻种子，是中医常用的润下药，始载于《神农本草经》“补中益气，久服肥健”，对消化系统、心血管系统、中枢神经系统有不同程度的药理作用，可用于治疗肠燥便秘、高血压、高血脂、风湿性疼痛等[2,3]。此外，火麻仁含有丰富的不饱和脂肪酸、蛋白质、氨基酸、维生素等成分。食用火麻油、火麻酒等火麻仁食品，对人体具有一定的保健作用[4]。大麻化学成分复杂，可以分为大麻素和其他类化合物[5]。大麻素为具有C21骨架的次生代谢产物，主要存在于大麻的花和苞片中，具有镇痛、降眼压、抗肿瘤、抗炎等药理作用，对于治疗癌症效果显著，可通过抑制细胞活性和诱导细胞凋亡，治疗乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胰腺癌等[6,7]。大麻富含植物纤维，韧皮纤维是最好的天然纤维之一，是上等的纺织和造纸原材料[8]。大麻纤维所制成的衣物具有良好的透气性、吸汗排湿，导热性能出色，同时因其含有酚类物质及其衍生物，具有较好的抗菌性，深受消费者喜爱[9,10]。根据大麻不同的使用价值可以将大麻分为用于收获种子、纤维及非精神活性大麻二酚的工业大麻或汉麻和具有精神活性物质四氢大麻酚的毒品大麻、娱乐大麻或药用大麻两类[11]。大麻最早在新石器时代时在东亚地区被驯化，目前所有的工业大麻和毒品品种都是从中国的野生植物和地方品种代表的祖先基因库中分化出来的[12]。
PP2Cs为丝氨酸/苏氨酸残基蛋白磷酸酶，以单体的形式存在，其活性依赖于镁离子或锰离子[13]。PP2Cs为多功能蛋白磷酸酶，其结构特殊，C端为保守的催化区，N端为长短不一的延伸区。延伸区域的差异导致PP2Cs具有多种生物学功能[13,14,15]。PP2C基因家族成员参与植物多种生理途径，包括脱落酸（ABA）信号途径、调控植物生长发育、植物创伤信号途径、植物抗病信号途径等[16]。PP2C基因家族A亚族参与ABA信号转导途径。例如，拟南芥PP2C（AtPP2Cs）基因家族A亚族9个成员启动子区域均含有ABA响应元件，其中ABI1、PP2C A、HAB1、HAB2已被证实对ABA信号转导途径具有负调控作用[17]。黄花蒿中，AaPP2C1与ABA受体蛋白AaPYLs相互作用，在拟南芥中过表达AaPP2C1后，ABA响应基因在ABA处理后表达下调，从而降低植株对于ABA的敏感性，促进种子发芽生根[18]。多个PP2C基因家族B亚族成员负调节丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径，而蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎涉及植物所有的生理过程[19]。MAPK信号途径促进表皮扁平细胞的分化并抑制气孔细胞的形成，这一空间上特殊的细胞发育过程是通过AP2C3基因特异性地负调节MPK3，MPK4和MPK6基因的表达实现的[20]。在苜蓿中，机械损伤可以激活盐胁迫诱导的MAPK（SIMK）蛋白，而PP2C基因家族B亚族的MP2C通过去磷酸化SIMK使MAPK途径失活，负调控外界损伤响应[21]。烟草毛状根中过表达NtMPK4或叶片瞬时表达NtMPK4基因可以提高尼古丁的生物合成，而NtPP2C2b通过去磷酸化活化NtMPK4而减少尼古丁的积累[22]，表明PP2Cs可能参与植物次生代谢产物合成的调控。
目前，许多园艺植物和药用植物的PP2C基因家族均已进行了鉴定和分析，其中拟南芥和水稻分别含有76个[23]和78个PP2C基因家族成员[24]，谷子80个[25]，毛竹125个[26]、甘蓝128个[27]、蒺藜苜蓿94个[28]、丹参83个[29]等。大麻基因组测序已完成，但尚未有关于大麻PP2C基因家族的研究报道。本研究基于工业大麻基因组和转录组数据，通过生物信息学技术对CsPP2Cs基因家族进行鉴定和分析，以期为后续研究CsPP2Cs基因功能提供参考依据，为工业大麻分子育种提供研究思路。
1材料
本项目使用的工业大麻CRBRx基因组数据及其他品种Cherry Chem、Canna Tsu、White Cookies、Black Berry Kush、Black Lime、Valley Fire、Sour Diesel、Mama Thai和Terple腺毛转录组数据均来源于（NCBI）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov），拟南芥基因组和AtPP2Cs基因家族数据来源于TAIR数据库（https://www.arabidopsis.org）。工业大麻Dinamed Kush（Diku）的叶、花、苞片和种子转录组数据由本课题组测序获得。
2方法
2.1CsPP2Cs基因家族成员鉴定及染色体定位
使用TBtools软件[30]提取工业大麻所有蛋白序列与AtPP2Cs成员文件进行双向Blast，并结合结构域获取可能的CsPP2Cs基因家族成员，去除重复转录本后获取CsPP2Cs蛋白序列。利用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam）网站对CsPP2Cs蛋白理化性质、分子质量、等电点和氨基酸数目进行预测。采用WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp）网站，根据结果分值预测CsPP2Cs蛋白亚细胞定位。
2.2进化树系统分类
将CsPP2Cs蛋白序列和AtPP2Cs蛋白序列共同导入MEGA X软件中进行多序列比对，利用邻接法（NJ）构建系统进化树（Bootstrap值1000），以AtPP2Cs为分类依据对CsPP2Cs成员进行分类。
2.3基因结构、保守基序与系统进化分析
将CsPP2Cs与AtPP2Cs蛋白序列共同导入MEGA X软件中进行多序列比对，利用邻接法构建系统进化树（Bootstrap值1000）。运用MEME（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）网站预测CsPP2Cs蛋白保守基序（Motif），保守基序参数设为10，其他值默认。利用NCBI的Batch-CD-Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）对CsPP2Cs蛋白结构域进行预测。最后，将CsPP2Cs进化树文本、全基因组注释文件、CsPP2Cs保守基序、CsPP2Cs保守结构域及重命名文件在TBtools软件中进行可视化作图。
2.4共线性分析
从NCBI网站上下载拟南芥、大麻的全基因组数据，在TBtools软件中导入二者的基因组序列文件，同时导入CsPP2Cs的ID，对二者的共线性关系进行可视化。
2.5顺式作用元件预测
通过TBtools软件获取CsPP2Cs基因上游2kb序列文件，利用PlantCare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）网站预测启动子区的顺式作用元件，在TBtools软件中将其可视化。
2.6表达模式分析
将已报道的9个大麻栽培品种（Cherry Chem,Canna Tsu,White Cookies,Black Berry Kush, Black Lime, Valley Fire, Sour Diesel, Mama Thai和Terple）腺毛转录组以及工业大麻Diku品种的叶、花、苞片和种子的转录组数据中CsPP2Cs基因的表达量数据导入TBtools软件中绘制热图，对该基因在不同组织中差异性表达和基因在不同品种的表达进行聚类分析。
2.7实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）分析
根据转录组数据的差异性表达，对CsPP2C31、CsPP2C33、CsPP2C41进行Real-time PCR验证分析。利用WARYONG试剂盒提取工业大麻Diku品种花、苞片、叶和种子的RNA，后用TransGen试剂盒反转录获取cDNA。利用NCBI设计引物，用FOREVER STAR试剂盒进行实时荧光定量PCR分析，反应程序为：95℃预变性3 min，95℃变性30s，56℃退火20s，72℃延伸15 s，循环40次。CsPP2C31正向引物5’-GAAAATTGAGGACGACGCCG-3’，反向引物5’-GCAAATGTTCGGCGGTGAT-3’；CsPP2C33正向引物5’-AGAACCAGAACTTGCTCCGG-3’，反向引物5’-GTCTTCCATCTCCTCTCGCG-3’；CsPP2C41正向引物5’-GGCGGTTCTTGTTGTGTGAC-3’，反向引物5’-TGTTAGAGCCTCAGCAGCAC-3’；内参基因EFla正向引物5’-ACCAAGATTGACAGGCGTTC-3’，反向引物5’-CCTTCTTCTCCACAGCCTTG-3’。
2.8可变剪切分析
利用IGV软件对工业大麻可变剪切文件和工业大麻基因组文件进行处理，获取大麻部分基因家族成员可变剪切图谱。将Diku品种的叶、花、苞片和种子的转录组数据中部分CsPP2Cs成员的表达量数据导入TBtools软件中绘制热图。
3结果与分析
3.1CsPP2Cs基因家族成员鉴定和进化树分析
利用TBtools软件将工业大麻基因组蛋白序列与AtPP2Cs蛋白序列进行双向Blast比对，共获得52个CsPP2Cs成员，见表1。CsPP2Cs数目明显少于拟南芥、水稻和丹参等。生物信息学分析发现，CsPP2Cs编码的蛋白氨基酸数目在244~1089；相对分子质量范围是26.76~122.53 kDa，相对分子质量相差较大；等电点范围4.74~9.60。利用WoLF PSORT对CsPP2Cs进行亚细胞定位预测发现，52个CsPP2Cs可能分布在叶绿体、细胞核、细胞质、线粒体、液泡和质膜。其中，90%以上成员分布于细胞核、细胞质和叶绿体。进一步利用TBtools软件分析发现，CsPP2Cs基因不均匀地分布在工业大麻的10条染色体上，其中Chr.NC_044370.1染色体上PP2Cs基因数目最多，达13个，且该染色体上含有明显的基因簇，如CsPP2C10-13，而Chr.NC_044372.1仅含有1个基因CsPP2C23。见图1。
表1 工业大麻PP2C基因家族基本信息及特征
图1 CsPP2Cs基因染色体分布（A）和PP2C基因家族系统发育树（B）
注：染色体的NC号以黄色字体标注；At.拟南芥；Cs.工业大麻
PP2Cs因其结构的特殊性，N端比C端保守性差，N端延伸区的差异性决定了成员之间的功能差异性[23,31]，为了进一步研究CsPP2Cs基因家族成员进化特性，将AtPP2Cs与CsPP2Cs共同构建系统发育树，见图1。根据进化树的分类结果，可将CsPP2Cs分为10个亚家族。其各亚家族成员分布情况为A亚族4个、B亚族4个、C亚族4个、D亚族7个、E亚族11个、F亚族6个、G亚族5个、H亚族3个、I亚族2个、J亚族1个，剩余5个成员未聚类，分为其他类。
3.2CsPP2Cs基因家族保守基序、基因结构和顺式作用元件分析
利用MEME网站和TBtools分别对CsPP2Cs的保守基序和基因结构进行了分析。保守基序分析发现，保守基序1、2、3分布于51个工业大麻PP2C基因家族成员，除CsPP2C4不含保守基序1，CsPP2C46不含保守基序2，CsPP2C42不含保守基序3外，其他基因家族成员均含有相应的结构域。保守基序4、6、8存在于48个CsPP2Cs成员中，保守基序5、9、10分布少数基因家族成员。除此之外，同一亚族内成员的保守基序组成几乎相同，进一步表明进化树分类的可靠性，而不同亚族中的保守基序组成具有一定差异。见图2、表2。
图2 CsPP2Cs保守基序、结构、和顺式作用元件
注：A：Motif.保守基序；UTR.非编码区；CDS.编码区；B：顺式作用元件从上到下依次为黄酮类合成基因调控元件、分生组织表达调控元件、水杨酸响应元件、厌氧呼吸响元件、光响应元件、低温响应元件、赤霉素响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、脱落酸响应元件、生物钟响应元件、干旱诱导响应元件、玉米醇溶蛋白响应元件、细胞周期调控、生长素响应元件、胚乳表达、损伤诱导、防御和胁迫响应、种子特异性调控、缺氧特异性诱导、光敏色素表达负调控
表2 CsPP2Cs基因家族10个保守基序
基因结构分析发现，CsPP2Cs普遍含有外显子和2个以上的内含子。其中A、C、D和G亚族基因的外显子数量不超过4个。十分有趣的是，5个未聚类PP2C基因或含有10个以上的外显子(CsPP2C46、CsPP2C3、CsPP2C33)，或仅含有3个外显子（CsPP2C34、CsPP2C31），见图2。
基因启动子对基因的表达和调控十分关键，因此，利用PlantCare对CsPP2Cs基因家族成员的启动子的顺式作用元件进行预测。共计发现20个顺式作用元件，其中主要顺式作用元件包括光响应元件、脱落酸响应元件、无氧诱导元件和茉莉酸甲酯响应元件，在工业大麻基因家族中的分布数量依次为290、163、118、104个。数量最少的是光敏色素下调表达作用元件，仅有1个，位于CsPP2C24启动子区。
3.3工业大麻PP2C基因家族表达模式分析及Real-time PCR验证
利用工业大麻Diku品种的叶、花、苞片、种子的转录组测序数据和已发表的不同大麻品种的腺毛转录组数据[32]，绘制CsPP2Cs在不同品种和不同组织的表达热图，见图3。通过聚类分析发现，CsPP2Cs在不同组织中的表达有较为明显的差异，CsPP2C33（未聚类）在叶中高表达，CsPP2C21（F亚族）和CsPP2C31（未聚类）在种子中高表达，CsPP2C41（B亚族）在苞片中高表达。而CsPP2C7、CsPP2C15、CsPP2C48、CsPP2C51在10个品种中均有较高的表达量，CsPP2C1、CsPP2C2、CsPP2C4、CsPP2C6、CsPP2C9、CsPP2C10、CsPP2C16、CsPP2C17、CsPP2C19、CsPP2C26、CsPP2C31、CsPP2C38、CsPP2C40、CsPP2C42、CsPP2C47、CsPP2C49表达量较低。相同基因在同一植物、不同品种中表达量存在差异，间接表明品种之间的表型差异与基因表达存在一定联系。
图3 CsPP2Cs基因在不同品种和组织的表达热图
注：CsPP2Cs基因在BB(Black Berry Kush),MT(Mama Thai),CC(Cherry Chem),BL(Black Lime),T(Terple),S(Sour Diesel),VF(Valley Fire).CT(Canna Tsu)和WC(White Cookies)品种腺毛的表达；种子（seed）、花（flower）、叶（leaf）和苞片（bract）为CsPP2Cs在Diku品种不同组织的表达
为了进一步验证转录组数据的可靠性，利用Real-time PCR对CsPP2C31、CsPP2C33、CsPP2C41在工业大麻Diku不同组织部位的表达情况进行了验证。Real-time PCR结果显示，CsPP2C31，CsPP2C33，CsPP2C41分别在种子，叶和苞片中高表达，与转录组结果一致，见表3。
表3 CsPP2Cs Real-time PCR（x±s，n=3）
3.4CsPP2Cs基因家族共线性和可变剪切分析
拟南芥作为模式植物，其PP2C基因家族成员功能研究较为全面。因此，利用TBtools对CsPP2Cs和AtPP2Cs基因家族成员进行了共线性分析，共计发现7对同源基因，分别CsPP2C12/AT4G38520，CsPP2C32/AT5G53140，CsPP2C40/AT3G05640，CsPP2C48/AT3G17250，CsPP2C42/AT3G23360，CsPP2C46/AT5G19280，CsPP2C1/AT5G01700。这与系统进化树的分类结果一致。见图4。
图4 大麻与拟南芥PP2C基因共线性分析（A）和CsPP2Cs基因可变剪切分析（B）
可变剪切是前体mRNA通过不同的剪切方式形成多种成熟mRNA的过程，是调控基因表达和产生蛋白质多样性的重要机制。可变剪切对植物的生长发育、信号转导、生物胁迫和非生物胁迫有重要调控作用。为此，对CsPP2Cs基因家族中CsPP2C31、CsPP2C33、CsPP2C41 3个基因进行可变剪切分析。分析结果表明CsPP2C31、CsPP2C33存在1个可变剪切本，CsPP2C41存在4个可变剪切本，表明该基因在进化的过程中发生了可变剪切事件，见图4。不同的可变剪切本在不同的组织和部位可能受到不同的调控，与热图表达结果一致。
4讨论
PP2Cs蛋白在进化上十分保守，细菌、真菌、植物和动物体内均存在大量的PP2Cs[33]。植物中的已知的PP2Cs主要参与胁迫信号转导，但大多数的PP2Cs功能仍然未知。本文利用生物信息学技术，通过Blast比对序列、构建系统发育树、基因表达分析等方法，从工业大麻全基因组中获取了52个CsPP2Cs成员。并对其亚细胞定位、理化性质、基因结构和表达情况等进行了分析与预测。其中，90% CsPP2Cs分布于细胞核、细胞质、叶绿体，为后续基因互作研究提供一定的参考依据。CsPP2Cs基因不均匀分布在工业大麻的10条染色体上，大部分染色体存在基因簇，表明该基因在进化的过程中发生了复制事件，同一基因簇的成员可能含有相类似的功能。
进化树分析将CsPP2Cs分为10个亚家族和5个未分类成员，与拟南芥分类结果一致，表明该基因家族在进化过程中较为保守。拟南芥中，PP2C A亚族主要参与ABA信号响应，而ABA广泛调控植物的蒸腾作用、营养生殖和种子萌发[17,34]。CsPP2C A亚族的CsPP2C15启动子区域含有ABA响应元件，定位于细胞质。这与处于同一进化分支上的拟南芥AT3G11410非常相似，AT3G11410在拟南芥种子萌发时调控ABA信号通路[35]。PP2C B亚族基因成员与MAPK基因家族成员有显著调控关系[36]。由于植物不同胁迫响应共享MAPK信号通路的调控，因此，推测PP2C可能是MAPK信号转导的特异性响应的分子基础。CsPP2Cs B亚族含有4个成员，分别是CsPP2C41、CsPP2C14、CsPP2C26和CsPP2C19。其中，CsPP2C41定位在叶绿体，在进化中与At2G30020（AtAP2C1）更相近。At2G30020在拟南芥中负调控胁迫引起的MAPK信号转导。植物受伤后，At2G30020突变体中的茉莉酸含量升高[37]，过表达株系中，损伤引起的MAPK信号降低，而CsPP2C41的启动子中具有茉莉酸甲酯响应元件，提示CsPP2C41与At2G30020可能具有相似的功能。
保守基序与基因功能密切相关，保守基序9为CsPP2Cs D亚族所特有，AtPP2Cs基因家族D亚族具有明显的核定位和质膜定位信号[23]，与细胞发育相关。拟南芥PP2C基因家族的MIDAs蛋白调节幼苗脱黄化，其中，MIDA11参与下胚轴伸长，MIDA9和MIDA10调节顶钩的发育，MIDA1调控子叶分离[38]，其他D亚族成员对植物幼苗的萌发及生长均有不同程度的调控作用[39]，推测CsPP2Cs基因家族D亚族成员可能具有相应的功能。工业大麻与拟南芥共线性分析共获取了7对同源基因，其中，蛋白质定位在细胞质的E亚族基因CsPP2C40与AT3G05640（AtPP2CF1）具有共线性。拟南芥中外源ABA处理可显著提高AT3G05640基因在维管组织和保卫细胞的表达[40]。另外，AT3G05640基因过表达株系表现出对ABA处理的低敏感表型[40]。CsPP2C48基因共线性基因AT3G17250在拟南芥胚乳中表达，其负调控蛋白激酶途径、脂类信号转导途径和茉莉酸生物合成途径[41]。因此，CsPP2C40和CsPP2C48基因在大麻中可能具有类似的功能。
通过Real-time PCR对部分差异性表达的基因进行分析发现，CsPP2C33基因在叶中高表达。CsPP2C33与AT4G27800在进化中处于同一分支，AT4G27800.1基因为拟南芥AT4G27800基因的3种剪切形式中的一种，在叶片中表达，与植物的光合作用密切相关[42]；种子高表达基因CsPP2C31与AT4G11040基因同源，AT4G11040在种子吸胀期抑制去磷酸化，影响种子的休眠和萌发[43]。因此，CsPP2C33与CsPP2C31基因在大麻中极有可能具有类似的功能。
本研究通过生物信息学技术和方法对CsPP2Cs基因家族成员进行了系统且全面的分析，为工业大麻PP2C基因家族的功能研究和大麻的分子育种品种选育提供了参考依据。
利益冲突：本文不存在任何利益冲突。
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文章摘自：蔡晓雪,王思凡,米要磊,万会花,曹雪,孙伟,苏畅,陈士林,徐艳琴,陈伟强.工业大麻PP2C基因家族成员鉴定及表达分析[J/OL].中国实验方剂学杂志:1-13[2022-07-08].DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.20221111.
