摘  要：工业大麻的生长和发育情况对药用成分的含量、纤维品质和产量均有较大的影响。随着数据统计分析方法、数量遗传学、分子生物学和生物信息学的飞速发展，分子标记技术已经广泛应用到工业大麻的生长发育研究中，可以在分子水平上明确不同品种的遗传背景、变异规律、代谢网络调控因素等，从而加快对工业大麻各种性状的研究进程。本研究全面介绍了分子标记技术在工业大麻研究中的应用现状、全基因组关联分析、特异性标记的开发等研究工作，简要讲述了分子标记辅助选择的优越性，探讨了分子标记技术的发展方向和潜力，为工业大麻种质资源创新奠定基础。

关键词：工业大麻；分子标记；全基因组关联分析；特异性标记

大麻(Cannabis sativa L.)是大麻属一年生直立草本植物，雌雄异株，按THC的含量分为药用型、中间型和纤维型(工业大麻)，具有较高的药用价值和经济价值。工业大麻中所含有的CBD具有抗炎、杀菌、镇痛、减轻精神疾病、抗氧化等功效，可用于治疗焦虑和睡眠障碍、止痛消炎、神经保护、抗肿瘤和保护血管等方面疾病(宁康等,2020)；除此以外，工业大麻的纤维是各种植物纤维中最细软的一种，其独特的结构具有吸湿排汗、阻挡紫外线辐射、避免静电、耐热、抗霉杀菌等功能；工业大麻籽油富含不饱和脂肪酸和植物甾醇，可以降低胆固醇、抗氧化、清除人体内自由基等功效，属于高利用价值的功能性油脂(卢延旭等,2007)。

工业大麻的农艺性状(即纤维含量,植株性别等)、品种类型均为目前工业大麻育种和法医学研究的主要方向，为了研究结果更加精准、快速，随着多元数据统计分析方法、数量遗传学、分子生物学和生物信息学的飞速发展，分子标记技术已经广泛应用到工业大麻研究中，并且不断更新换代保障研究更加深入。迄今为止，研究方向主要有品种类型鉴定、遗传多样性分析、性别鉴定、种质资源鉴定、全基因组关联分析(genome-wide association studies, GWAS)以及特异性标记开发等，本综述将对分子标记技术在工业大麻研究中的应用和发展前景进行介绍。

1分子标记技术在工业大麻中的应用进展

分子标记技术种类繁多，在工业大麻研究中的应用主要有以下几种：限制性片段长度多态性标记技术(restriction fragment length polymorphism,RFLP)，随机扩增多态性DNA标记技术(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD )和序列特征化扩增区域标记技术(sequence characterized amplified region,SCAR)，简单重复序列标记技术(simple sequence repeat, SSR)、短串联重复标记技术(short tandem repeats,STR)和简单重复序列间区标记技术(inter-simple sequence repeat,ISSR)，以及扩增片段长度多态性标记技术(amplified fragment length polymorphism,AFLP)。

1.1RFLP分子标记

RFLP是第一个被应用于遗传研究的DNA分子标记，其原理是利用限制性内切酶酶解后，得到差异性片段与发生形态分离的数据相结合，进而构建遗传连锁图谱，使间接选择简单易行。RFLP标记在生物体内广泛存在，且数目无限可覆盖整个基因组、结果稳定可靠。RFLP主要应用于构建遗传图谱、基因定位、遗传多样性和物种亲缘关系鉴定、种质鉴定和遗传背景分析，在工业大麻的研究中重要用来进行药用型品种的鉴定。

Cirovic等(2017)使用RFLP方法，对20种药用大麻样品和3种工业大麻样品进行了THCA(tetrahydrocannabinolic acid)合成酶基因活性的分析，发现药用大麻样品均为活性拷贝，其中16种为杂合子，工业大麻品种均为纯合的非活性拷贝，据此建立了一个快速而准确的大麻样品法医学分析算法，可解答分析样品是否能够产生浓度高于0.3%的THC (Δ-9-tetrahidrocanabinol)的问题。但在RFLP的操作过程中，对样品DNA质量要求较高，且须使用放射性同位素进行分子杂交、酶切等，步骤较为繁琐。

1.2RAPD和SCAR分子标记

RAPD标记技术是通过分析遗传物质DNA经过PCR扩增的多态性来确定生物体内在基因排布与外在性状表现规律的技术。在植物学研究中，RAPD标记技术主要应用于遗传资源保存和分类、遗传多样性研究、遗传图谱构建、种质资源鉴定、品种纯度鉴定和杂交育种、突变检测、基因标记和基因组比较等。其所用引物无种属限制、不需要探针，操作简便。RAPD标记技术在大麻研究中较多的应用于种质资源遗传多样性、品种鉴定和产地溯源、遗传变异分析、性别鉴定和SCAR标记开发等方面。

汤志成等(2013)通过RAPD技术对12份野生型和4份栽培品种进行遗传多样性研究，将16份种质资源分成3个类群，与表型聚类结果相同；筛选出14条引物可以扩增出79条多态性条带，表明我国野生大麻遗传变异较复杂。陈璇等(2015)对云南5个工业大麻品种进行RAPD和ISSR分子标记鉴定，共得到多态性位点64个，品种间遗传相似系数为0.8749-0.9255，即5个品种间遗传多样性较小，可为育种群体的选择提供依据。黄艳梅等(2013)对国内4省6地100株工业大麻样品进行RAPD和ISSR引物扩增，所得到的多态性条带所占比率分别为51.9%和57.9%，结果可用来鉴定大麻种类和产地溯源。姜颖等(2017)对经过化学诱变和物理诱变的工业大麻材料进行遗传变异分析，结果显示Co⁶⁰-γ诱变剂量在100-150 Gy之间、2% EMS诱变剂处理6 h的条件下后代发生突变几率较高。

由于RAPD标记技术利用单条引物扩增多个基因位点导致结果不稳定，可将具有多态性的RAPD扩增产物进行克隆和测序，设计一对稍长且互补的的引物将RAPD标记转化为更稳定的SCAR标记。陈其军等(2001)用30个RAPD引物对10株工业大麻雌株和10株雄株进行分析，最后筛选出1个与性别相关的特异性引物，并通过片段克隆和序列分析将其转化为SCAR标记。李仕金等(2012)选用200条RAPD引物在云麻1号中扩增出一条大麻雄性相关的特异性条带，并将该条RAPD引物转换成SCAR标记。赵铭森等(2019)通过3个已有的工业大麻雄性相关标记开发出6个SCAR标记，其中1个标记MADC2-8在123份已知性别的工业大麻样本材料群体中进行验证，准确性达98.34%。姜颖等(2019)通过RAPD分子标记技术对一个工业大麻品种的雌雄株进行引物筛选，获得1条与雄性相关的特异性条带，以此设计2个SCAR标记引物，可对苗期性别未知的植株进行预测应用。赵艳红等(2021)在560对相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism, SRAP)标记引物中筛选出24对雌雄差异相关引物，其中发现1个引物扩增出1条雄性相关的特异性条带，将该引物作为基础，向两端延伸2-3个碱基，获得了一个新的与雄性相关的SCAR标记。

1.3SSR和ISSR分子标记

简单重复序列(SSR)和短串联重复(STR)是一类由几个碱基组成的基因序列串联重复而形成的DNA序列，SSR标记技术就是以这些长度不同的片段在不同材料中的表现形式为基础，研究其与表型之间的关系。SSR分子标记技术具有共显性、高度重复性、高度多态性等优点，在工业大麻研究中通常用来构建遗传连锁图谱、群体遗传多样性分析和遗传学研究、系谱分析和作为法医鉴定工具。此外，为突破SSR标记的一些限制性因素，将SSR序列两端随机添加2-4个核苷酸，形成简单重复序列间区(ISSR)，ISSR的引物设计相对SSR则较为简单且更具专一性，在应用方面更是兼具RAPD和SSR的优点。

信朋飞等(2014)通过NCBI中大麻EST数据库设计49对SSR引物，筛选出29对多态性引物，并选择其中的7对引物对所研究的24份材料构建了SSR指纹图谱。张庆滢等(2017)通过筛选出的9条ISSR引物对96个辽宁科尔沁沙地野生大麻自然群居个体进行遗传多样性分析，最终确定样本量在多于25个时可以较好代表该群体的遗传多样性水平。Marcello等(2021)从41个nSSR(nuclear SSR)标记中筛选出20个高度多态性和鉴别位点，对11个工业大麻品种的104个个体进行了测试。选择的标记能够成功地评估品种内部和品种间的纯合性、遗传一致性和遗传变异。基于性别表现(雌雄异株和雌雄同株)和地理起源，群体结构分析确定了八个遗传类群。张庆滢等(2018)利用筛选出的19对EST-SSR引物构建了30个工业大麻品种的指纹图谱，这30个大麻品种包含22份野生型和8份栽培品种，共检测到235个等位变异，被分成南、北两个类群显示出地域性分布，但亲缘关系比较相近。Dufresnes(2017)利用13个STRs标记将1324个样本分为24个工业大麻品种和15个药用型品种，可用于法医学鉴定。

1.4AFLP分子标记

AFLP是通过限制性内切酶酶切基因组DNA后，所得片段的不同长度检测多态性的一种DNA指纹分析技术，兼具RFLP标记的可靠性和高效性的同时，更加快速、灵敏、稳定。目前，AFLP标记技术主要在工业大麻的遗传多样性分析、品种分类和产地溯源、性别鉴定方面应用较多。

胡尊红等(2012)利用AFLP进行的工业大麻品种多样性分析表明，云南地区的群体遗传多样性水平较高，其次是黑龙江群体；四川和广西群体遗传一致程度最高；云南、贵州和四川群体一致程度趋于中间水平；甘肃和山西群体一致度最低，表明工业大麻遗传变异较大。吕佳淑等(2010)选用64对AFLP引物对10个品种雌雄株混合的群体进行筛选，在引物E-ACT/M-CTA扩增结果中发现一条与工业大麻雄性植株相关的特异性条带，可用于早期性别鉴定。郭丽等(2015)选用AFLP技术对11个品种雌雄株混合的群体进行筛选，共得到6对多态性引物，并在引物E-ACA/M-CTG扩增结果中发现一雄性相关特异性条带，可用于早期性别鉴定。

2工业大麻全基因组关联分析应用进展

GWAS是以连锁不平衡为基础，在研究群体中利用一定数量的分子标记进行全基因组水平上的多态性分析，再与表型数据结合起来进行研究的一种方法。GWAS的优势在于所用群体为富含基因资源的自然群体，分辨率高，研究周期短。随着研究深入细化，GWAS在大麻中的应用除了进行群体结构分析，还用于重要农艺性状相关位点和候选基因的挖掘，如CBD和THC合成途径、性别发育、纤维素品质等相关基因的挖掘研究。

陈璇等(2018)对野生型和栽培型工业大麻进行全基因组测序，检测到226万多个SNP位点，这两个品种的杂合度分别为0.12%和0.11%，二等位多态性SNP分为4种类型，亲本纯合、杂合类型SNP分别占46.32%、53.47%，因此以当前状态下两种类型品种即可构建遗传分离群体。

Van等(2011)对药用大麻基因组DNA和RNA进行测序，报告了一个534 Mb的单倍体基因组序列草图和一个30000个基因的转录组。通过对药用型和工业用大麻品种转录组的比较发现，药用型大麻表达更多的编码大麻素和前体蛋白的基因，药用型大麻转录组中只有四氢大麻酸合成酶，而工业用大麻中的四氢大麻酸合成酶被大麻二酚酸合成酶取代了，以此表明THC是在药用型大麻中生成的，而不是在工业大麻中。Gao等(2018)采用RNA-seq 技术，研究了工业大麻在干旱胁迫下的转录组变化。共鉴定出差异表达基因1292个，其中上调基因409个(31.66%)，下调基因883个(68.34%)，并用qRT-PCR方法对12个基因的表达模式进行了验证，GO和KEGG分析显示NAC、B3、过氧化物酶、膨胀素和肌醇加氧酶等可能在抗旱中起重要作用，11个KEGG途径受到显著影响，其中影响最大的是含有15个差异表达基因的植物激素/信号转导途径。在干旱和ABA诱导条件下，脱落酸途径相关基因的表达模式相似，说明脱落酸在抗旱胁迫中起重要作用。Kaitlin等(2019)通过药用大麻和工业大麻杂交得到的物理和遗传图谱地图显示，大麻素生物合成基因通常是不连锁的，但是芳香烯基转移酶(ap)为THCA和CBDA合成酶提供底物，与已知的大麻素含量标记紧密连锁。Zhang等(2018)利用大麻基因组和转录组鉴定了不同大麻品种LBD基因家族，并分析其表达模式。结果显示，大麻LBD包含32个成员，分为两大类，七个亚科，不均匀的分布在10条染色体上。该基因的上游启动子区含有多种与植物激素和环境因子有关的顺式作用元件，不同品种(低四氢大麻酚、高大麻二醇)的茎、叶和花中的顺式作用元件表达模式不同。Lbd基因家族成员主要表达在两个品种的花和茎中，成员在叶片中表达极少，这些基因可能参与大麻的生长和发育，并影响大麻素的生物合成。Ren等(2021)使用110个来自世界各地的大麻材料进行全基因组重测序，证明了现在所有的工业型和药用品种都是从一个祖先的基因库中分离出来的，这个基因库目前以中国的野生品种和地方品种为代表，分析了与工业型和药用品种鉴别相关的候选基因，包括分枝模式和纤维素/木质素生物合成，发现在选择增加纤维产量或精神活性的过程中，参与大麻素合成的基因功能丧失。

Petit等(2020)采用全基因组关联分析方法，对大麻开花时间和性别决定的遗传建成进行研究。使用SNP标记对123份大麻材料进行研究，发现8个QTLs，其中6个与开花时间相关、两个2个与性别相关。这些QTLs覆盖了基因组区域，预测有33个转录本参与开花和性别决定。在开花时间性状的QTLs中发现了与光感知和转录相关的基因，以及调控开花的转录因子。在性别决定的QTLs中发现了转录因子和调节植物激素(特别是生长素和赤霉酸)平衡的基因。同年，Petit等(2020)利用相同的群体材料，研究了与纤维品质相关的7个细胞壁性状和韧皮纤维性状的遗传基础。使用RAD-seq对大麻纤维板进行基因分型，SNP标记进行全基因组关联分析(GWAS)，对不同纤维品质性状的16个QTL进行了定位，包括葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖、木糖、木质素和韧皮纤维含量，以及12个候选基因，它们可能参与了单糖、多糖和木质素的生物合成和修饰，在大麻纤维品质的决定中起着重要作用。Hua等(2022)在工业大麻全基因组水平鉴定了WRKY基因家族中39个CasWRKYs，分析了它们的系统发育关系、染色体位置、顺式作用元件、基因结构、保守序列和表达模式。根据基因结构和系统发育分析，将CasWRKY蛋白分为3个群和7个亚群，CasWRKY启动子区的调控因子含有多种顺式调控元件，其中P-box顺式调控元件的频率较高，说明CasWRKY对赤霉素的调控具有一定的反应性。又通过RNA-seq和qRT-PCR表达谱分析发现，13个CasWRKY基因对GA3胁迫作出反应，影响纤维发育，并在茎生长和发育中发挥重要作用。

3大麻特异性标记开发研究进展

针对特定的研究需要，学者们根据相应的基因组区域或者CBD和THC相关基因序列，开发出一系列特异性标记用来鉴定群体特征和CBD及THC的合成规律，这些标记的开发和使用成本比较低廉，且检测手段简单、快速、靶向性强，结果稳定可靠、重复性好。

Zhang等(2018)在叶绿体5个高频突变区间，开发了5个特异性标记，对52份大麻样品(25个野生种群和27个栽培种群)中的645个个体进行了单倍群的鉴定，发现这3个单倍群具有明显的高、中、低纬度梯度分布格局，首次揭示了低纬度单倍群是最早的分支，这意味着大麻可能起源于低纬度地区。

陈璇等(2016)根据THCAS和CBDAS基因多态性，设计了一个共显性复合PCR分子标记，通过对我国不同来源地的23份大麻种质资源共69个单株材料中THC和CBD含量特征及其关键合成酶基因多态性进行分析，鉴定了我国大麻种质资源的大麻素化学型及基因型。Garfinkel(2021)利用两个杂交群体，一个是CBGA优势品种与THCA优势品种之间的杂交群体，另一个是CBGA优势品种与CBDA优势品种之间的杂交群体，进行THCA合成酶基因的等位基因分析，最终发现一个SNP可能使合成酶无法将CBGA转换为THCA，从而导致CBGA的积累。Flavia等(2021)对一组基因型代表所有欧洲大麻化学类型的品种，开发高度特异性的引物以精确区分不同的大麻素合酶基因，除了作为检测基因组水平上CBCAS存在的标记，还可以分析大麻的转录谱。研究表明，虽然THCAS和CBDAS的高转录水平清楚地反映了植物的化学表型，但CBCAS在所有基因型中的低但稳定的转录水平表明这些基因是活跃的，可能对最终的大麻素含量有贡献。

4展望

随着分子标记技术的不断优化、改良、创新，其解决科学问题的所属领域也不断扩大、加深。由最开始的构建遗传连锁图谱到鉴别品种类型、测定品系纯度，再到种质资源的遗传多样性分析、指纹图谱构建、农艺表型相关的候选基因挖掘、各种代谢通路相关基因的表达分析等，分子标记技术的发展和应用使育种家多年以来繁琐的育种工作日益便捷。

在工业大麻研究中，研究学者比较关注的三个领域分别为法医学、医药学和遗传育种学，即品种类型(药用型和工业用型)、药用成分含量、植株性别决定因素以及纤维素的品质和含量。通过分子标记技术的应用，一些与农艺表型和生理生化特征相关的特异性标记和候选基因相继被发掘，为不同领域的鉴别和分析工作奠定了坚实的理论基础，此外，候选基因的发掘不仅可以在分子水平阐明各种代谢途径的调控网络、拓展野生品种和栽培品种的遗传基础，还可以突破现有种质资源瓶颈、使工业大麻种质创新成为可能。

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[30]Zhang Q.Y.,Guo R.,Xu Y.P.,Guo M.B.,Yang M.Guo H.Y.,and Chen X.,2018,Construction of EST-SSR fingerprinting for 22 wild hemp(Cannabis sativa L.)germplasms and 8 representative varieties,Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding),16(2):493-501.(张庆滢,郭蓉,许艳萍,郭孟璧,杨明,郭鸿彦,陈璇,2018,22份大麻野生资源与8份栽培品种EST-SSR指纹图谱构建,分子植物育种,16(2):493-501.)

[31]Zhao M.S.,Fang S.S.,Chen Y.Y.,Kang H.M.,Gao J.H.,Chen S.Y.,Yang X.,Feng X.P.,and Zhang L.W.,2019,Evaluation of markers linked to sex-specific and development of SCAR makers in seed hemp (Cannabis sativa L.),Redai Zuowu Xuebao(Chinese Journal of Tropical Crops),40(10):2076-2082.(赵铭森,方书生,陈瑶,康红梅,高金虎,陈思远,杨昕,冯旭平,张立武,2019,籽用大麻性别连锁标记的验证及SCAR标记开发,热带作物学报,40(10):2076-2082.)

文章摘自：赵曦,王玉杰,王家有,李晓娟,冷春旭,赵伟,王贵江,胡少新,张利国,王珣.分子标记技术在工业大麻研究中的应用进展[J/OL].分子植物育种:1-7[2022-07-08].http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20220602.1555.008.html