摘 要：本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用红麻子叶柄作为外植体的的红麻组织培养方法。本发明将红麻种子经过消毒处后置于MS培养基上生长，12天后切下子叶柄，置于诱导生芽培养基中，待不定芽长大后切下置于生根培养基中培养至长出根系，再经炼苗与移栽得到得到再生苗。本发明所提供的方法在各品种间无基因型限制、培养周期短、再生植株生长正常，适合于各种红麻品种的组织培养。
权利要求书
1.一种利用子叶柄作为外植体的红麻组织培养方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)无菌苗的制备：对红麻种子进行消毒灭菌处理，接种于MS培养基上培养至萌发，得到红麻无菌幼苗；
(2)愈伤组织与不定芽诱导：取步骤(1)中培养得到的无菌苗的子叶柄作为外植体，接种至诱导生芽培养基中进行培养，期间定期更换培养基，获得不定芽簇；
(3)芽伸长：将(2)获得的不定芽簇从愈伤组织上剥离，接种至芽伸长培养基上进行培养，期间定期更换培养基，待不定芽长至一定高度时，分开不定芽簇，获得单个伸长的不定芽苗；
(4)生根诱导：取(3)获得的单个伸长的不定芽苗，接种至生根诱导培养基上，培养至生根，获得再生苗；
(5)炼苗与移栽：将(4)中获得的再生苗进行炼苗，炼苗完成后，取出再生苗，洗去根部培养基，移栽于营养土中，放于温室培养。
2.根据权利要求1所述的一种利用子叶柄作为外植体的红麻组织培养方法，其特征在于：所述的红麻的品种选自福红952、赞引1号。
3.根据权利要求1所述的一种利用子叶柄作为外植体的高效红麻组织培养方法，其特征在于：所有操作均在无菌环境中进行。
4.根据权利要求1所述的一种利用子叶柄作为外植体的高效红麻组织培养方法，其特征在于：步骤(1)中获得无菌苗的方法为：选取饱满、干净的红麻种子，先用体积分数75%酒精清洗3min，再用无菌水清洗3min，再用体积分数50%84消毒液清洗20min，最后用无菌水清洗4次，每次3min，消毒结束；将消毒后的红麻种子接种于MS培养基中，在培养温度25℃、16h光照与8h黑暗交替处理、2000Lux条件下培养至种子萌发，即获得无菌苗；其中，所述的MS培养基的配方为：MS粉末4.46g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L，pH=5.8。
5.根据权利要求1所述的一种利用子叶柄作为外植体的高效红麻组织培养方法，其特征在于：步骤(2)中获得不定芽簇的方法为：取步骤(1)萌发12~14天的无菌苗，用无菌剪刀取下完整的子叶柄作为外植体，接种至诱导生芽培养基中，在培养温度25℃，16h光照与8h黑暗交替处理、2000Lux条件下培养45天左右，期间每隔15天更换培养基，即获得不定芽簇；其中，所述的诱导生芽培养基以MS培养基为基本培养基，并添加了0.1mg/L的噻苯隆和0.1mg/L的2,4 二氯苯氧乙酸。
6.根据权利要求1所述的一种利用子叶柄作为外植体的高效红麻组织培养方法，其特征在于：步骤(3)中获得单个伸长的不定芽苗的方法为：将步骤(2)中获得的不定芽簇从愈伤组织上剥离，转接至芽伸长培养基中，在培养温度25℃、16h光照与8h黑暗交替处理、2000Lux条件下培养，期间每隔15天更换培养基，待不定芽长到3 5cm高时，分开不定芽簇，即获得单个伸长的不定芽苗；其中，所述的芽伸长培养基以MS培养基为基本培养基，并添加了0.1mg/L的噻苯隆和0.1mg/L的2,4 二氯苯氧乙酸。
7.根据权利要求1所述的一种利用子叶柄作为外植体的高效红麻组织培养方法，其特征在于：步骤(4)中获得再生苗的方法为：将单个伸长的不定芽苗转接至生根培养基中，在培养温度25℃、16h光照与8h黑暗交替处理、2000Lux条件下培养至生5~6条须根，即获得再生苗；其中，所述的生根培养基以MS培养基为基本培养基。
8.根据权利要求1所述的一种利用子叶柄作为外植体的高效红麻组织培养方法，其特征在于：步骤(5)炼苗与移栽的方法具体为：将培养步骤(4)中再生苗的培养瓶瓶盖打开，于室温、自然光照下放置3h，随后往培养瓶中添加25 30ml自来水，继续于室温、自然光照下放置12h，炼苗结束；炼苗结束以后，将培养瓶中的再生苗取出，用自来水将再生苗基部附着的培养基洗净，移栽到营养土中，放于温室中在温度25℃、16h光照与8h黑暗交替处理、2000Lux条件下培养，按常规肥水管理至长成成品苗，出圃；其中，所述的营养土在使用前需与自来水按照5:1的质量比混合使其完全润湿。
9.如权利要求1所述的一种利用子叶柄作为外植体的红麻组织培养方法在规模化培育红麻中的应用。
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用子叶柄作为外植体的红麻组织培养方法。
背景技术
红麻(Hibiscus)为锦葵科木槿属一年生纤维作物，是继棉花和黄麻之后的世界上第三大天然纤维作物，具有抗旱、耐盐碱、适应性广、生物量大等特性，在造纸、纺织、建筑材料、复合材料、水土保持、吸附剂、饲料等方面有良好的应用价值广泛，在亚热带和热带地区种植。由于红麻韧皮部纤维具有抑菌、透气、吸湿性好和可降解等特点，被视为21世纪潜在的优势作物。常规遗传育种方法虽然能改良红麻品质、提高抗病性等重要农艺性状，但周期较长，并且还要投入大量的人力与物力。借助植物转基因技术向红麻中导入控制有效性状的外源基因或者对基因组进行定向靶向修饰，将会是红麻分子育种的高效途径之一。植物转基因技术离不开高效稳定的遗传转化体系，而制约红麻遗传转化的关键因素是缺乏高效的离体再生体系。
目前较多主要农作物已建立稳定高效的离体再生体系，而红麻却未见相关报道。大多数植物已报道的再生体系外植体为子叶、下胚轴和茎尖，与子叶相比子叶柄在再生过程中更不易白霜化；与下胚轴相比子叶柄是具有更强分裂能的细胞聚集区，其细胞更具转化为胚性细胞的潜质；与茎尖相比子叶柄在遗传转化体系中更易获得纯合植株，而不是嵌合体。因此与子叶、下胚轴还有茎尖相比，子叶柄有更高的再生率、周期更短和能产生更多不定芽等优点，能为再生体系的建立奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以子叶柄为外植体的红麻组织培养方法，通过产生不定芽簇，能够在较短时间内获得大量的再生苗，实现红麻离体再生。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用子叶柄作为外植体的红麻组织培养方法，包括如下步骤：
(1)无菌苗的制备：对红麻种子进行消毒灭菌处理，接种于MS培养基上培养至萌发，得到红麻无菌幼苗；
(2)愈伤组织与不定芽诱导：取步骤(1)中培养得到的无菌苗的子叶柄作为外植体，接种至诱导生芽培养基中进行培养，期间定期更换培养基，获得不定芽簇；
(3)芽伸长：将(2)获得的不定芽簇从愈伤组织上剥离，接种至芽伸长培养基上进行培养，期间定期更换培养基，待不定芽长至一定高度时，分开不定芽簇，获得单个伸长的不定芽苗；
(4)生根诱导：取(3)获得的单个伸长的不定芽苗，接种至生根诱导培养基上，培养至生根，获得再生苗；
(5)炼苗与移栽：将(4)中获得的再生苗进行炼苗，炼苗完成后，取出再生苗，洗去根部培养基，移栽于营养土中，放于温室培养。
进一步的，上述的红麻的品种选自福红952和赞引1号。
进一步的，上述的所有操作均在无菌环境中进行。
进一步的，上述的步骤(1)中获得无菌苗的方法为：选取饱满、干净的红麻种子，先用体积分数75%酒精清洗3min，再用无菌水清洗3min，再用体积分数50%84消毒液清洗20min，最后用无菌水清洗4次，每次3min，消毒结束；将消毒后的红麻种子接种于MS培养基中，在培养温度25℃、16h光照与8h黑暗交替处理、2000Lux条件下培养至种子萌发，即获得无菌苗；其中，所述的MS培养基的配方为：MS粉末4.46g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L，pH=5.8。
进一步的，上述的步骤(2)中获得不定芽簇的方法为：取步骤(1)萌发12~14天的无菌苗，用无菌剪刀取下子叶柄作为外植体，接种至诱导生芽培养基中在培养温度25℃，16h光照与8h黑暗交替处理、2000Lux条件下培养45天左右，期间每隔15天更换培养基，即获得不定芽簇；其中，所述的诱导生芽培养基以MS培养基为基本培养基，并添加了0.1mg/L的噻苯隆和0.1mg/L的2,4 二氯苯氧乙酸。
进一步的，上述的步骤(3)中获得单个伸长的不定芽苗的方法为：将步骤(2)中获得的不定芽簇从愈伤组织上剥离，转接至芽伸长培养基中，在培养温度25℃、16h光照与8h黑暗交替处理、2000Lux条件下培养，期间每隔15天更换培养基，待不定芽长到3 5cm高时，分开不定芽簇，即获得单个伸长的不定芽苗；其中，所述的芽伸长培养基以MS培养基为基本培养基，并添加了0.1mg/L的噻苯隆和0.1mg/L的2,4 二氯苯氧乙酸。
进一步的，上述的步骤(4)中获得再生苗的方法为：将单个伸长的不定芽苗转接至生根培养基中，在培养温度25℃、16h光照与8h黑暗交替处理、2000Lux条件下培养至生5~6条须根，即获得再生苗；其中，所述的生根培养基以MS培养基为基本培养基。
进一步的，上述的步骤(5)炼苗与移栽的方法具体为：将培养步骤4）中再生苗的培养瓶瓶盖打开，于室温、自然光照下放置3h，随后往培养瓶中添加25 30ml自来水，继续于室温、自然光照下放置12h，炼苗结束；炼苗结束以后，将培养瓶中的再生苗取出，用自来水将再生苗基部附着的培养基洗净，移栽到营养土中，放于温室中在温度25℃、16h光照与8h黑暗交替处理、2000Lux条件下培养，按常规肥水管理至长成成品苗，出圃；其中，所述的营养土在使用前需与自来水按照5:1的质量比混合使其完全润湿。
进一步的，上述一种利用子叶柄作为外植体的红麻组织培养方法可应用于规模化培育红麻。
本发明的显著优点在于：
本发明为国内首个红麻离体再生方案。一是，本发明使用无菌苗子叶柄作为外植体是实现红麻高效离体再生的核心之一；二是，本发明使用同一培养基对红麻子叶柄进行愈伤组织诱导、不定芽分化以及不定芽伸长，得到的不定芽数量较多，最终生根率可达到90.3%；三是，本发明操作简单，具有投入少，产出高的特点。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。
实施例1
(1)无菌苗的制备：在无菌环境中，选取成熟饱满的“福红952”红麻种子（图1），先用体积分数75%酒精清洗3min，再用无菌水清洗3min，再用体积分数50%84消毒液清洗20min，最后用无菌水清洗4次，每次3min，完成消毒。将消毒灭菌后的种子接种到萌发培养基中，于培养温度25℃、16h光照与8h黑暗交替处理、2000Lux条件下培养至种子萌发，获得无菌苗；其中，所述的萌发培养基为MS培养基，其配置方法为：MS粉末4.46g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L，将培养基pH值调至5.8。
(2)愈伤组织与不定芽诱导：在无菌环境中，将(1)中萌发12 14天的无菌苗用无菌手术剪剪下完整的子叶柄（图2），接种于不定芽诱导培养基上，在培养温度25℃、16h光照与8h黑暗交替处理、2000Lux条件下培养45天左右，期间每隔15天继代一次，获得不定芽簇（图3），统计得到不定芽诱导率（32.1%）；其中，所述的不定芽诱导培养基以MS培养基为基本培养基，并添加了浓度为0.1mg/L的噻苯隆(TDZ)和0.1mg/L的2,4 二氯苯氧乙酸(2，4 D)，其中MS培养基配制方法为：MS粉末4.46g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L，将培养基pH值调至5.8
(3)不定芽伸长：在无菌环境中，将(2)中得到的不定芽簇用无菌手术剪从愈伤组织上剪下，转接至不定芽伸长培养基中，每隔15d继代一次，在培养温度25℃、16h光照与8h黑暗交替处理、2000Lux条件下培养30天左右、不定芽长高至3 5cm（图4）时，分开不定芽簇，即获得单个伸长的不定芽苗；其中，所述的不定芽伸长培养基以MS培养基为基本培养基，并添加了浓度为0.1mg/L的噻苯隆(TDZ)和0.1mg/L的2,4 二氯苯氧乙酸(2，4 D)，其中MS培养基配制方法为：MS粉末4.46g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L，将培养基pH值调至5.8。
(4)生根诱导：在无菌环境中，将(3)获得的单个伸长的不定芽苗转接至不定芽诱导生根培养基，在培养温度25℃、16h光照与8h黑暗交替处理、2000Lux条件下培养至长出5 6条须根，即获得再生苗（图5）；其中，所述的生根诱导培养基为MS培养基，不添加任何激素，其配制方法为添加MS粉末4.46g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L，培养基pH值为5.8。
(5)炼苗与移栽：将培养(4)中已经生根5 6条须根的生根苗的培养瓶瓶盖打开，于室温、自然光照下放置3h，随后往培养瓶中添加25 30ml自来水（图6），继续于室温、自然光照下放置12h，炼苗结束；炼苗结束以后，将培养瓶中的再生苗取出，用自来水将再生苗基部附着的培养基洗净，移栽到营养土中（图7），放于温室中在温度25℃、16h光照与8h黑暗交替处理、2000Lux条件下培养，按常规肥水管理至长成成品苗，出圃；其中，所述的营养土在使用前需与自来水按照5:1的质量比混合使其完全润湿。
附图说明
图1 成熟饱满的“福红952”红麻种子
图2 无菌苗子叶柄
图3 不定芽簇
图4 伸长30天的不定芽
图5 生根的再生苗
图6 炼苗示意图
图7 移栽到营养土中的红麻组培苗
摘自国家发明专利，发明人：张立武，徐益，何青垚，陈思远，祁建民，张列梅，
申请号：202210216212.8，申请日：2022.03.07
