摘  要：为分离与鉴定大麻(Cannabis sativa L.)雌株及雄株3个部位的叶片(从植株茎基向茎尖方向第二轮叶，第五轮叶，雄花周围叶)和花的内生细菌，本研究采用微生物培养和分子生物学鉴定方法，探讨其种类其及分布特征。结果显示，从大麻雄株中分离到6属35株内生细菌，大麻雌株中分离到11属39株内生细菌。内生细菌种属在大麻雌雄植株不同部位的叶和花中的分布存在显著差异，大麻雌株与雄株的内生细菌种类只共有葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和马赛菌属(Massilia sp.)，其余均不共有。大麻雄株3个部位叶片中共有阿尔莱特葡萄球菌和溶血葡萄球菌而不存在于雄花中；在雄花中到分离到地衣芽孢杆菌、木糖葡萄球菌和贝莱斯芽孢杆菌而不存在于叶中。大麻雌株3个部位叶片共有贝莱斯芽孢杆菌和特基拉芽孢杆菌而不存在于雌花中；在雌花中分离到粪短波单胞菌、谷粒申氏菌、农杆菌、香料葡萄球菌、缺陷短波单胞菌、地衣芽胞杆菌和弗留明拜叶林克氏菌而不存在于叶中。结果表明大麻内生细菌在不同植株、叶和花中的多样性以及不同内生细菌的分布差异。本研究结果为进一步研究大麻内生细菌的多样性提供科学依据，为未来大麻内生菌功能性促生菌种的筛选奠定基础。

关键词：大麻；内生细菌；分离与鉴定

大麻(Cannabis sativa L.)为大麻科(Cannabaceae)大麻属(Cannabis)植物，又名火麻、野麻，是雌雄异株的一年生草本植物，其主要分布在亚洲及欧洲地区(Li，1974；杨永红，2003；Groom，2014)。在中草药植物当中，大麻具有极高的药用价值潜力；其大麻素是发挥大麻药理活性的主要成分，并且具有很好的治疗效果。除此之外还富含一些非大麻素化合物，如常见的黄酮、皂苷、多酚和生物碱等生物活性化合物(刘毅，2012)。目前大麻已知的主要大麻素酚类化合物主要有四氢大麻酚、大麻二酚、大麻萜酚、大麻酚和大麻环萜酚等(凌年，1980，国外医学.药学分册，(6):346-353)。现代药理研究表明，大麻在抗癫痫(Maa，2014；Devinskyet al.，2016)、治疗精神紊乱(Zuardi et al.，1991)、缓解失眠焦虑(Chagas et al.，2014)、抗炎、抑菌(Oláhet al.，2014；Burstein，2015；Nalli et al.，2019)以及镇痛(Boychuk et al.，2015)等方面有显著的疗效。研究发现，雌雄异株的大麻的叶片和花蕾是富含活性化合物的主要部位，大麻植株在性别分化过程当中，其雌、雄株不同器官组织间的化合物含量差异显著，如大麻雌株叶片和花中的过氧化物酶活性、吲哚乙酸和玉米素以的含量都显著高于大麻雄株的叶片和花(强晓霞，2012)。

植物内生菌(Endophyte)是植物微生态系统的自然组成部分，是指一种细菌或真菌可以在健康的植物组织中生存一定时间或所有时间，而不会导致宿主植物表现出明显的症状感染(Hallmann et al.，1997)。内生细菌可以促进宿主植物活性物质的积累(Garyali et al.，2013)，产生与宿主相同或者相似的生理活性代谢产物(文才艺等，2004)，促进宿主药用植物次生代谢物的产生(谭燕等，2013)。内生菌其自身合成的抗生素、激素、酶抑制剂、诱导物和其他多种活性物质通过诱导物来胁迫宿主植物合成的帖类、生物碱、皂苷、黄酮或酚类等次生代谢产物(Schulzet al.，2005；Hassan，2017)。如自从Stierle等(1999；2001)在短叶红豆杉(Taxus brevifolia)中分离并鉴定出能够产生紫杉醇的内生真菌，引起了许多的学者对内生菌的关注，并且在分离和筛选能够产生与宿主植物相同或相似的次生代谢产物的功能性内生菌种方面掀起了一股热潮。

大麻植株中含有大量的生物活性成分，而不同雌、雄株以及不同部位分布次生代谢含量不同，因此推测其内生菌多样性分布可能不同。目前未见关于大麻植物内生细菌的报道，因此本研究对大麻雌株、雄株的不同部位叶片和花进行内生细菌分离鉴定，探讨种类其及分布特征，为进一步研究大麻内生细菌的多样性提供科学依据，为未来大麻内生菌功能性促生菌种的筛选奠定基础。

1结果与分析

1.1内生细菌分离与鉴定

从大麻雌、雄株不同部位的叶片和花中分离纯化共得到的231株菌株，将菌株进行编号培养，对照培养皿内无菌落生长，证明试验材料表面消毒彻底，确定所分离得到菌株为植物内生菌。在1％琼脂糖凝胶上检查PCR产物，获得1500bp左右条带(图1)，每个泳道均只出现一条清晰明亮的条带，送擎科生物科技有限公司测序。将最终所获得大麻内生细菌的16SrDNA在NCBI上利用BLAST测序得到的结果在GenBank中序列比对，找到与其同源性大于97%的菌株并去除重复菌株，最终确定大麻雌、雄植株不同部位共74株内生细菌。

 图1大麻内生细菌PCR产物的电泳检测

注:1:无菌水；2~7:鉴定菌株(部分)

1.2大麻雄株内生细菌在植物器官内的分布

从大麻雄株内生细菌的16S rDNA序列比对分析结果和构建的系统发育树(图2)，可以看出内生细菌可以归类到芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcu sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)、马赛菌属(Massiliasp.)、藤黄单胞菌属(Luteimonassp.)、假黄色单胞菌属(Pseudoxanthomonassp.)等6个属中。大麻雄株内生细菌的16S rDNA序列比对分析结果显示(表1)，35株内生细菌在大麻雄株各个部位的分布各不相同，在第二轮叶片和雄花周围叶片分离到的内生细菌数量最多，第五轮叶次之，花中最少。从大麻雄株叶片中分离得到菌株30株，包括第二轮叶(DA)12株、第五轮叶(DB)9株以及雄花周围叶(DC)9株，从雄花(DD)中分离得到菌株5株。大麻雄株叶片和花中微生物多样性分布不同，阿尔莱特葡萄球菌(Staphylococcus arlettae)和溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)在大麻雄株3个部位叶片中共有而不存在于雄花中，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)只在雄花(DD)中分离到。大麻雌株微生物在3个部位叶片分布也各不相同：其余部分的菌株种类各不相同。如变化马赛菌(Massilia varians)、单独棒杆菌(Corynebacterium singular)、木犀草单胞菌(Luteimonas granuli)和蒂莫内马塞菌(Massilia timonae)只在雄株第二轮叶(DA)中分离到；特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)、棒状杆菌(Corynebacterium sp.)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)只在雄株第五轮叶(DB)中分离到；腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)和苏芸金杆菌(Bacillus thuningiensis)只在雄花周围叶(DC)中分离到。

表1大麻雄株不同部位中的内生细菌种属差异

注：DA:从雄株茎基向茎尖方向的第二轮叶片编号；DB:从雄株茎基向茎尖方向的第五轮叶片编号；DC:雄花周围叶片的编号；DD:雄花的编号

图2邻接法构建的大麻雄株内生细菌16S rDNA序列系统发育树

1.3大麻雌株内生细菌在植物器官内的分布

从大麻雌株内生细菌的16S rDNA序列比对分析结果和构建的系统发育树(图3)，可以看出内生细菌可以归类到葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、芽胞八叠球菌属(Sporosarcina sp.)、短波单胞菌属(Brevundimonassp.)、农杆菌属(Agrobacterium sp.)、拜叶林克氏菌属(Beijerinckia sp.)、地芽孢杆菌属(Geobacillus sp.)、土壤芽胞杆菌属(Solibacillus sp.)、显核菌属(Caryophanon sp.)、马赛菌属(Massilia sp.)和申氏菌属(Shinella sp.)等11个属中。

大麻雌株的16SrDNA序列比对分析结果显示(表2)，39株内生细菌在大麻雌株各个部位的分布各不相同，在雌花和雄花周围叶片分离到的内生细菌数量最多，第五轮叶次之，第二轮叶片中最少。从大麻雌株叶片中分离得到菌株29株，包括第二轮叶(XA) 8株、第五轮叶(XB) 9株、雌花周围叶(XC) 12株，从雌花(XD)中分离得到菌株10株。大麻雌株叶片和花中微生物多样性分布不同，如贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)和特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)在3个部位叶片中都分离到，而不存在于雌花中；粪短波单胞菌(Brevundimonas faecalis)、谷粒申氏菌(Shinella granuli)、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、香料葡萄球菌(Staphylococcus condiment)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)和弗留明拜叶林克氏菌(Beijerinckia fluminensis)只在雌花中分离到而不存在于叶片中。大麻雌株内生细菌在3个部位叶片分布也各不相同：如炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、显核菌Caryophanon SU18、苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)等只在第二轮叶(XA)中分离到；嗜气芽胞杆菌(Bacillus aerophilus)、人参土生孢八叠球菌(Sporosarcina ginsengisoli)和高空芽胞杆菌(Bacillus altitudinis)等只在雌株第五轮叶(XB)中分离到。

综上可得，大麻雌株和雄株的不同部位叶片及花中内生细菌分布差异显著，且大麻雌株中分离的内生细菌种类及数量较多，而大麻雄株分离的内生细菌种类及数量较少。大麻的雌、雄植株间以及不同部位叶片和花的大部分内生菌种类明显不同，说明大麻的内生细菌种类具有一定的组织专一性。

表2大麻雌株不同部位中的内生细菌种属差异

注：XA:从雌株茎基向茎尖方向的第二轮叶片编号；XB:从雌株茎基向茎尖方向的第五轮叶片编号；XC:雌花周围叶片的编号；XD:雌花的编号

图3邻接法构建的大麻雌株内生细菌16S rDNA序列系统发育树

2讨论

近年来，随着大麻的药用价值不断提高，它引起了研究人员的关注。大麻含有多种药用活性化合物，其药用成分提取物已被用于治疗抗癌和精神疾病，并且效果显著(王林，2002，国外医学(药学分册)，29(4):247-248)。在抗菌方面，大麻能生产一些抗菌功能性纤维产品及杀菌药物(张正海等，2019)。内生菌广泛的存在于植物的各个器官和组织中，并且可以从植物的每个部位中分离出来。内生菌的种类数量与化合物在植物不同器官和组织中的分布有关(Suryanarayanan，2013)。内生菌本身可以合成或诱导宿主植物产生所需的次级代谢产物，这在促进宿主植物的生长中起重要作用(Thimmarajuet al.，2010)。何玲敏等(2019，安徽农业科学，47(23):157-160)研究了小麦不同生长阶段和不同器官内生细菌的多样性，在整个生长周期中，叶片内生细菌多样性明显高于根和茎，内生细菌多样性在扬花期较高，其次是苗期和成熟期。

宋庭宁(宋庭宁等，2019)等在不同器官中研究了来自3个不同地点的6种植物的内生细菌群落。结果表明，不同植物内生细菌群落的种类和含量不同；同一植物不同器官内生菌株无明显差异，但含量不同，表明生长环境和植物不同部位对内生群落的分布有一定的影响。陈璐(陈璐等，2014)从4个品种的芭蕉属植物的10个不同组织部位中分离内生细菌，两种芭蕉中分离根中内生细菌含量远高于叶和茎，一种的叶片内生细菌含量高于根部，表明内生细菌可能具有宿主特异性，并且宿主不同器官中分类群的数量和流动动态不同。

本研究发现大麻不同植株、叶和花中内生细菌的种类和数量都表现出差异。从大麻雌、雄植株不同部位共分离得到74株内生细菌，大麻雄株中分离到35株内生细菌归属于6个属。大麻雌株中分离到39株内生细菌归属于11个属。大麻雄株中芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)为优势菌属，棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)和马赛菌属(Massilia sp.)次之，藤黄单胞菌属(Luteimonas sp.)、假黄色单胞菌属(Pseudoxanthomonas sp.)最少。大麻雌株中葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)和芽孢杆菌属(Bacillus sp.)为优势菌属，芽胞八叠球菌属(Sporosarcina sp.)和短波单胞菌属(Brevundimonas sp.)次之，农杆菌属(Agrobacterium sp.)、拜叶林克氏菌属(Beijerinckia sp.)、地芽孢杆菌属(Geobacillus sp.)、土壤芽胞杆菌属(Solibacillus sp.)、显核菌属(Caryophanon sp.)、马赛菌属(Massilia sp.)以及申氏菌属(Shinella sp.)最少。芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)为大麻雌株和雄株的共同优势内生细菌。芽孢杆菌属(Bacillus sp.)目前研究最多的生防菌，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有对土壤提质改良、促进作物生长发育及产质的提高、耕作土壤降害与修复等作用(Zhang et al.，2021)；苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)对线虫的防治方面显示出了很大的潜力(Wei et al.，2003)；丰年芽孢杆菌(Bacillus toyonensis)能产生长素和细胞分裂素介导的玉米根系的生长和耐铝性需要生长素的极性运输(Zerrouket al.，2020)。特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)能著增加内源茉莉酸和水杨酸含量并显著诱导大豆耐热性(Kang et al.，2019)。葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)作为生防菌对病原菌层出镰刀(Fusarium proliferatum)有拮抗作用(黄涛，2020)，阿尔莱特葡萄球菌(Staphylococcus arlettae)接种水稻后能促进植物生长并抑制对砷的吸收(Singhet al.，2016)。棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)促进了水稻作物(Oryza sativa L.)的生长和产量并对叶枯病侵袭有抑制作用；马赛菌属(Massilia sp.)与丛枝菌根接种玉米后的双重作用提高了玉米的耐盐性(Ramasamy et al.，2016)；藤黄单胞菌属 (Luteimonas sp.)具有氧化酶、碱性磷酸酶和萘酚-AS-BI磷酸水解酶活性，具有耐砷作用(穆遥，2020)。假黄色单胞菌属(Pseudoxanthomonas sp.)具有将砷还原为亚砷酸盐的能力以及促进植物蕨类植物蜈蚣草(fern Pteris vittata)生长的作用(Lampis et al.，2015)。芽胞八叠球菌属(Sporosarcina sp.)促进辣椒的生长并诱导植物对轴突叶枯病菌的系统抗性(Kanget al.，2007)。短波单胞菌属(Brevundimonas sp.)具有增强植物修复重金属铜的作用，且能促进植物生物量的积累(Rathi and Yogalakshmi，2020)。农杆菌属(Agrobacterium sp.)一直是世界各国科学家们研究的热点，它携带有一种特殊的质粒可以被用于植物基因工程的遗传转化研究中(https://www.doc88.com/p-9992182736248.html)。拜叶林克氏菌属(Beijerinckia sp.)能提高洋葱植株的干质量和含氮量，是Döbereiner与Ruschei于甘蔗的根际首次成功分离得到固氮菌(Manjunath et al.，1981)。地芽孢杆菌属(Geobacillus sp.)含有多糖类的细胞胞囊或胞外多糖，可作为增稠剂添加到食品中，也可应用在制药工业中(Schiano et al.，2003)。土壤芽胞杆菌属(Solibacillus sp.)中的Solibacillus silvestris第一个被报道用于生产功能性淀粉样蛋白的菌株，它是一种耐热糖蛋白淀粉样生物乳化剂，能够影响环境和生物膜的形成(Markande et al.，2018)。显核菌属(Caryophanon sp.)在死海沿海生态系统微生物对极端因素的耐药性有重要作用(Romanovskaia et al.，2013)。申氏菌属(Shinella sp.)曾在甘蔗中分离出来的内生生长菌，是草中Shinella属菌株的首例(Tauléet al.，2016)。

植物的性别分化是体内生理生化代谢的结果，内生细菌的多样性分布随雌雄植物不同部位次生代谢含量的变化而变化。因此，分析雌雄异株的大麻叶片和花不同部位的内生细菌组成，为进一步研究大麻中内生细菌的多样性提供了科学依据，为未来大麻内生菌功能促生长菌株的筛选奠定基础。

3材料与方法

3.1试验材料与内生细菌的分离

供试材料于2020年8月采自云南省昆明市中国农业科学院的大麻(Cannabis sativa L.)健康雌、雄植株，以大麻的雄株3个部位的叶片(从植株茎基向茎尖方向第二轮叶，第五轮叶，雄花周围叶)和雄花，雌株取相同3个部位的叶片(从植株茎基向茎尖方向第二轮叶，第五轮叶，雌花周围叶)和雌花为试验材料进行内生细菌的分离。用流动的自来水洗涤大麻雌株和雄株的叶片和花，然后用无菌蒸馏水洗涤，在超净工作台中用75％的乙醇表面消毒1min，用5%次氯酸钠的表面消毒5min，再用75％的乙醇表面消毒30s，最后在无菌蒸馏水中洗涤10min，总共洗3次，将最后的洗涤水铺在Luria-Bertani固体培养基上，表面消毒方法的成功是通过最后的洗涤水在培养基中未检测到微生物生长来确认的。将大麻雌株、雄株的叶片和花分别磨碎后装入加有Luria-Bertani液体培养基的离心管中，荡培养3h之后使其充分混匀，再用无菌水稀释浓度成10-1、10-2、10-3、10-4和10-55个浓度，然后分别涂布在Luria-Bertani固体培养基上，放在30℃恒温培养箱中倒置培养24~48h，每个浓度涂布5个重复培养基。等细菌长出，随后挑取单菌落纯化培养并编号。将纯化后的菌落用Luria-Bertani液体培养基摇一夜后加入灭菌后的50%甘油按1:1的比例保存在-20℃冰箱中。

3.2内生细菌的分子鉴定

基于细菌16S rRNA基因重复扩增和序列分析进行分子鉴定。根据Miller(1999)的方法提取基因组DNA。使用基因组DNA作为模板，细菌通用引物扩增细菌16S rRNA基因：27F(5-GAGTTTGATCACTGGCTCAG-3)、1492R(5-TACGGCTACCTTGTTACGA-3)(Hassan，2017)，该引物由昆明擎科生物工程公司合成。PCR混合物包含：金牌Mix45μL；27F(10mmol/L)2μL；1492R(10mmol/L)2μL；DNA模板1μL。PCR反应条件：98℃预变性进行2min，98℃变性进行10s，55℃复性进行30s，72℃延伸进行10s，30个循环后72℃延伸进行1min。

在1%琼脂糖凝胶上检查PCR产物的预期大小，随后送昆明擎科生物工程公司测序，使用NCBIBLAST程序将序列与GenBank数据库进行比较，找出相似性最高的菌株确定生物学分类地位。使用MEGA6(Version6.1)软件通过邻居连接方法构建了系统发育分析，并通过自举分析(1000次重复)对置信度进行了测试。

文章摘自：王宪菊，许艳萍，字淑慧，金洪伶，斯那永宗，刘涛.大麻(Cannabis sativa L.)内生细菌的分离与鉴定[J/OL].分子植物育种:1-17[2021-11-24]