摘 要:本发明公开了一种大孔树脂富集结合动态轴向压缩柱系统制备高纯度大麻二酚的方法，属于天然药物制备技术领域。该方法是将工业大麻的花絮和叶烘干后粉碎过筛，得工业大麻粉，加热回流提取后制备上柱溶液，使其通过大孔吸附树脂层析柱，水洗后洗脱，洗脱液回收溶剂后浓缩得大麻二酚初提物，然后加入甲醇和粗硅胶，拌匀后烘干作为上样样品，利用动态轴向压缩柱系统处理上样样品，并用流动相进行梯度洗脱，洗脱液经过浓缩、过滤和回收流动相溶剂后进行干燥，得大麻二酚结晶。该方法产率高，大麻二酚纯度高，提取时间短，解决了现有大麻二酚提取技术生产效率低，纯度低和提取时间长的问题，适用于工业提取大麻二酚。
技术要点
1.一种大孔树脂富集结合动态轴向压缩柱系统制备高纯度大麻二酚的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：将工业大麻的花絮和叶烘干后粉碎过筛，得工业大麻粉；
步骤二：对工业大麻粉进行加热回流提取，将所得加热回流提取液制备成上柱溶液，将上柱溶液通过大孔吸附树脂层析柱，然后用蒸馏水水洗并弃去水洗脱液，再用甲醇溶液或乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液并回收洗脱液中的甲醇或乙醇，浓缩得大麻二酚初提物；
步骤三：向步骤二所得大麻二酚初提物中加入甲醇和粗硅胶，拌匀后烘干作为上样样品，利用动态轴向压缩柱系统处理上样样品，并用流动相进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经过浓缩、过滤和回收流动相溶剂后进行干燥，得大麻二酚结晶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一是在40℃～90℃条件下烘干6h～12h至含水量为3％～5％，粉碎后过10目～100目筛。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二所述加热回流提取是向工业大麻粉中加入6倍体积-20倍体积的水，在70℃～90℃下进行加热回流提取2～3次，每次0.5～3h，合并提取液，然后向合并后的提取液中加入甲醇或乙醇至其在提取液中的体积浓度为60％～80％以进行沉淀，过滤后回收提取溶剂，得加热回流提取液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二所述加热回流提取是向工业大麻粉中加入6倍体积-20倍体积的10％～80％(v/v)的醇溶液或10％～80％(v/v)丙酮溶液或10％～80％(v/v)异丙醇溶液，加热回流提取2次～3次，每次1～2.5h，合并提取液，回收提取溶剂得加热回流提取液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二所述加热回流提取的温度为70℃～90℃，提取次数为2次-3次，每次1h-2.5h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二是对工业大麻粉进行加热回流提取，然后将加热回流提取液浓缩并调节pH值至2.5～6.8得上柱溶液，然后将上柱溶液按照上柱溶液中固形物的质量与大孔吸附树脂层析柱中干树脂的质量之比为1：(6～9)、且流速为2BV/h～4BV/h通过大孔吸附树脂层析柱，然后用3BV～6BV的蒸馏水洗以1BV/h～3BV/h的流速涤树脂柱床，弃去水洗脱液后再用体积浓度为20％～95％的甲醇溶液或乙醇溶液按照2BV/h～5BV/h的洗脱流速进行洗脱，收集并合并洗脱液，回收甲醇或乙醇，浓缩得大麻二酚初提物。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三所述粗硅胶为100目～200目的粗硅胶。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三所述梯度洗脱是在0.5MPa～3.6MPa下进行的。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三所述动态轴向压缩柱系统的动态轴向压缩柱以300目～1400目的硅胶为填料；步骤三所述流动相为正己烷-二氯甲烷、正己烷-氯仿、正己烷-乙酸乙酯、正己烷-丙酮、石油醚-二氯甲烷、石油醚-氯仿、石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述流动相按照以下方式进行梯度洗脱：
(1)所述流动相为正己烷-二氯甲烷，在梯度洗脱过程中正己烷和二氯甲烷的体积比由9:2降低至4:1；
(2)所述流动相为正己烷-氯仿，在梯度洗脱过程中正己烷和氯仿的体积比由11：2降低至5:1；
(3)所述流动相为正己烷-乙酸乙酯，在梯度洗脱过程中正己烷和乙酸乙酯的体积比由10:1降低至2:1；
(4)所述流动相为正己烷-丙酮，在梯度洗脱过程中正己烷和丙酮的体积比由8:1降低至3:1；
(5)所述流动相为石油醚-二氯甲烷，在梯度洗脱过程中石油醚和二氯甲烷的体积比由10:1降低至3:1；
(6)所述流动相为石油醚-氯仿，在梯度洗脱过程中石油醚和氯仿的体积比由12:1降低至4:1；
(7)所述流动相为石油醚-乙酸乙酯，在梯度洗脱过程中石油醚和乙酸乙酯的体积比由11:3降低至3:2；
(8)所述流动相为石油醚-丙酮，在梯度洗脱过程中石油醚和丙酮的体积比由9:1降低至3:1。
技术领域
本发明涉及一种大孔树脂富集结合动态轴向压缩柱系统制备高纯度大麻二酚的方法，属于天然药物制备技术领域。
背景技术
大麻类植物在中国种植历史悠久，古代大麻类植物纤维主要用于制作加工绳索、渔网、服装和造纸原料，火麻种仁用于榨取油脂及食品等行业。工业大麻(Cannabissativa)与传统有毒大麻具有本质差别，根据1988年联合国明确规定，工业大麻是指不具备提取成瘾性成分(四氢大麻酚THC)价值或直接作为毒品吸食，专供工业用途的原料大麻，生长期的工业大麻的花絮及叶中的四氢大麻酚含量(THC)<0.3％，可以合法进行规模化种植与工业化开发利用。
工业大麻是一种非常有前途的药用植物，其中大麻酚类化合物中药用价值最高的活性成分为大麻二酚(CBD)。大麻二酚(CBD)为大麻中非成瘾部分，CBD能阻止四氢大麻酚(THC)对人体神经系统的影响，同时具有抗肌肉引起的不随意挛缩、抗结缔组织炎症、风湿性关节炎、抗精神焦虑、抗细胞凋亡、抗氧化、抗炎、保护神经细胞等药理活性。研究表明大麻二酚具有重要的临床应用前景，如对于多种癌症，癫痫、阿尔茨海默病、糖尿病和抽动秽语综合征等具有一定的疗效。
中国农业统计年鉴》和联合国粮农组织的统计数字显示，中国已是世界上工业大麻种植面积最大的国家，种植面积占全球一半左右。而黑龙江省作为“工业大麻之乡”，具有适宜工业大麻生长的自然生态环境。
二氢大麻酚(CBD)不溶于水，溶于乙醇、乙醚、石油醚、苯、碱溶液、正己烷、6号溶剂油、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇。熔点67℃、沸点185℃。主要是叶子和花絮中含量较高。可用于医药、化妆品、保健品。阻碍四氢大麻酚对人体神经系统的影响，并具有抗痉挛、抗风湿关节炎、抗焦虑等药理活性。
现有的醇提或水提醇沉法结合柱层析制备工艺或单纯超临界萃取等技术提取二氢大麻酚，其产率低，约20％～40％，纯度低，约30％～60％，提取时间较长，技术相对老旧。
发明内容
为解决现有大麻二酚的提取方法产率低，纯度低且提取时间较长的问题，本发明提供了一种大孔树脂富集结合动态轴向压缩柱系统制备高纯度大麻二酚的方法，采用的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种大孔树脂富集结合动态轴向压缩柱系统制备高纯度大麻二酚的方法，该方法包括如下步骤：
步骤一：将工业大麻的花絮和叶烘干后粉碎过筛，得工业大麻粉；
步骤二：对工业大麻粉进行加热回流提取，将所得加热回流提取液制备成上柱溶液，将上柱溶液通过大孔吸附树脂层析柱，然后用蒸馏水水洗并弃去水洗脱液，再用甲醇溶液或乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液并回收洗脱液中的甲醇或乙醇，浓缩得大麻二酚初提物；
步骤三：向步骤二所得大麻二酚初提物中加入甲醇和粗硅胶，拌匀后烘干作为上样样品，利用动态轴向压缩柱系统处理上样样品，并用流动相进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经过浓缩、过滤和回收流动相溶剂后进行干燥，得大麻二酚结晶。
优选地，步骤一是在40℃～90℃条件下烘干6h～12h至含水量为3％～5％，粉碎后过10目～100目筛。
优选地，步骤二所述加热回流提取是向工业大麻粉中加入6倍体积-20倍体积的水，在70℃～90℃下进行加热回流提取2～3次，每次0.5～3h，合并提取液，然后向合并后的提取液中加入甲醇或乙醇至其在提取液中的体积浓度为60％～80％以进行沉淀，过滤后回收提取溶剂，得加热回流提取液。
优选地，步骤二所述加热回流提取是向工业大麻粉中加入6倍体积-20倍体积的10％～80％(v/v)的醇溶液或10％～80％(v/v)丙酮溶液或10％～80％(v/v)异丙醇溶液，加热回流提取2次～3次，每次1～2.5h，合并提取液，回收提取溶剂得加热回流提取液。
优选地，步骤二所述加热回流提取的温度为70℃～90℃，提取次数为2次-3次，每次1h-2.5h。
优选地，步骤二是对工业大麻粉进行加热回流提取，然后将加热回流提取液浓缩并调节pH值至2.5～6.8得上柱溶液，然后将上柱溶液按照上柱溶液中固形物的质量与大孔吸附树脂层析柱中干树脂的质量之比为1：(6～9)、且流速为2BV/h～4BV/h通过大孔吸附树脂层析柱，然后用3BV～6BV的蒸馏水洗以1BV/h～3BV/h的流速涤树脂柱床，弃去水洗脱液后再用体积浓度为20％～95％的甲醇溶液或乙醇溶液按照2BV/h～5BV/h的洗脱流速进行洗脱，收集并合并洗脱液，回收甲醇或乙醇，浓缩得大麻二酚初提物。
优选地，步骤三所述粗硅胶为100目～200目(150微米～75微米)的粗硅胶。
优选地，步骤三所述梯度洗脱是在0.5MPa～3.6MPa下进行的。
优选地，步骤三所述动态轴向压缩柱系统的动态轴向压缩柱以300目～1400目(25微米～10微米)的硅胶为填料；步骤三所述流动相为正己烷-二氯甲烷、正己烷-氯仿、正己烷-乙酸乙酯、正己烷-丙酮、石油醚-二氯甲烷、石油醚-氯仿、石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮。
更优选地，所述流动相按照以下方式进行梯度洗脱：
(1)所述流动相为正己烷-二氯甲烷，在梯度洗脱过程中正己烷和二氯甲烷的体积比由9:2降低至4:1；
(2)所述流动相为正己烷-氯仿，在梯度洗脱过程中正己烷和氯仿的体积比由11：2降低至5:1；
(3)所述流动相为正己烷-乙酸乙酯，在梯度洗脱过程中正己烷和乙酸乙酯的体积比由10:1降低至2:1；
(4)所述流动相为正己烷-丙酮，在梯度洗脱过程中正己烷和丙酮的体积比由8:1降低至3:1；
(5)所述流动相为石油醚-二氯甲烷，在梯度洗脱过程中石油醚和二氯甲烷的体积比由10:1降低至3:1；
(6)所述流动相为石油醚-氯仿，在梯度洗脱过程中石油醚和氯仿的体积比由12:1降低至4:1；
(7)所述流动相为石油醚-乙酸乙酯，在梯度洗脱过程中石油醚和乙酸乙酯的体积比由11:3降低至3:2；
(8)所述流动相为石油醚-丙酮，在梯度洗脱过程中石油醚和丙酮的体积比由9:1降低至3:1。
优选地，步骤三所述干燥为冷冻干燥、喷雾干燥或减压干燥。
本发明有益效果：
本发明提供了一种大麻二酚(CBD)的提取工艺，该工艺通过将大孔树脂柱层析富集技术与动态轴向压缩柱系统(DAC)结合提取工业大麻中的大麻二酚，利用本发明方法制备高纯度大麻二酚(CBD)，可在较低温下短时间完成提取，分离周期短、效率高，节省提取容积用量，降低生产成本、减少能耗和环境污染。经HPLC检测，该技术所得的大麻二酚(CBD)纯度可高达80％～98％；该方法产率可高达70％～85％，从提取到获得终产物用时仅需要35～48h，解决了现有大麻二酚的提取技术存在生产效率低，纯度低和提取时间长的问题。通过添加各种药用辅料、食品添加剂或化妆品原料，可用于医药、化妆品、功能保健食品、运动饮料等的开发，用于抗痉挛、抗类风湿性关节炎、抗焦虑，以及皮肤防皱、美白、修复疤痕等领域的应用,疗效确切,安全可靠。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
实施例1
本实施例提供了一种大孔树脂富集结合动态轴向压缩柱系统制备高纯度大麻二酚的方法，该方法按照如下步骤进行：
步骤一：将工业大麻的花絮和叶在55℃条件下烘干8h至含水量在3％～5％之间，粉碎后过100目筛，得工业大麻粉；
步骤二：向工业大麻粉中加入20倍体积的75％(体积百分浓度)乙醇溶液，加热回流提取3次，每次1.5h，合并提取液，离心或过滤后进行减压回收提取溶剂，进行双效浓缩，浓缩后调节pH值至5.0～6.0得上柱溶液，将上柱溶液以2BV/h的流速通过大孔吸附树脂层析柱，且上柱溶液按照上柱溶液中固形物质量与大孔吸附树脂层析柱中干树脂的比例为1：8)，先用4BV的蒸馏水洗涤树脂柱床，洗脱流速为2BV/h，弃去水洗脱液；再用体积百分比浓度为80％的甲醇洗脱剂洗脱，洗脱流速为2BV/h，合并洗脱液减压回收醇，减压浓缩至相对密度为1.05～1.45，得大麻二酚初提取物；
步骤三：向步骤二所得大麻二酚初提取物中加入甲醇和100目粗硅胶，拌匀后烘干作为上样样品，然后将上样样品填充到动态轴向压缩柱(以1000目的硅胶为填料)中填料的上方，并用流动相(正己烷-二氯甲烷)在0.1MPa～3MPa的条件下进行梯度洗脱，梯度洗脱过程中正己烷和二氯甲烷的体积比(正己烷：二氯甲烷)由9:2降低至4:1，分别收集含大麻二酚的主段洗脱液，合并洗脱液后进行减压浓缩，过滤后减压回收流动相溶剂，经过冷冻干燥(冷冻干燥条件为预冻温度-30℃～-40℃，预冻时间8h～10h，隔板温度50℃～60℃，干燥时间24h～30h)后即得高纯度大麻二酚结晶。
经过HPLC检测本实施例制得的大麻二酚的纯度为95％，本实施例方法的产率为83％，从提取至获得终产物所用时间为33h～45h。
实施例2
本实施例提供了一种大孔树脂富集结合动态轴向压缩柱系统制备高纯度大麻二酚的方法，该方法按照如下步骤进行：
步骤一：将工业大麻的花絮和叶在60℃条件下烘干6h至含水量在3％～5％之间，粉碎后过80目筛，得工业大麻粉；
步骤二：向工业大麻粉中加入16倍体积的50％(体积百分浓度)甲醇溶液，加热回流提取3次，每次2h，合并提取液，然后离心或过滤后进行浓缩，浓缩后调节pH值至4.0～5.0得上柱溶液，将上柱溶液以3BV/h的流速通过大孔吸附树脂层析柱，且上柱溶液按照固形物与干树脂的比例为1：10，先用6BV的蒸馏水洗涤树脂柱床，洗脱流速为4BV/h，弃去水洗脱液；再用体积百分比浓度为70％的乙醇溶液洗脱，洗脱流速为3BV/h，合并洗脱液减压回收醇，减压浓缩至相对密度为1.05～1.45，得大麻二酚初提取物；
步骤三：向步骤二所得大麻二酚初提取物中加入甲醇和200目粗硅胶，拌匀后烘干作为上样样品，然后将上样样品填充到动态轴向压缩柱(以1400目的硅胶为填料)中填料的上方，并用流动相在1.5MPa～3.6MPa的条件下进行梯度洗脱，分别收集含大麻二酚的主段洗脱液，合并洗脱液后进行减压浓缩，过滤后减压回收流动相溶剂，经过冷冻干燥(冷冻干燥条件为预冻温度-35℃～-45℃，预冻时间7h～9h，隔板温度45℃～55℃，干燥时间22h～28h)后即得高纯度大麻二酚结晶。
经过HPLC检测本实施例制得的大麻二酚的纯度为98％，本实施例方法的产率为85％，从提取至获得终产物所用时间(即，步骤二和步骤三总共所用的时间)为35h～44h。
表1流动相
由表1中的结果可知：当流动相选择正己烷-乙酸乙酯时的效果最好，大麻二酚纯度可以高达98％，产率高达85％。
实施例3
本实施例提供了一种大孔树脂富集结合动态轴向压缩柱系统制备高纯度大麻二酚的方法，该方法按照如下步骤进行：
步骤一：将工业大麻的花絮和叶在70℃条件下烘干6h至含水量在3％～5％之间，粉碎后过60目筛，得工业大麻粉；
步骤二：向工业大麻粉中加入12倍体积的80％(体积)甲醇溶液，加热回流提取2次，每次3h，合并提取液，过滤后将所得滤液进行减压回收提取溶剂，浓缩后调节pH值至6.8得上柱溶液，将上柱溶液以2BV/h的流速通过大孔吸附树脂层析柱，且上柱溶液按照固形物与干树脂的比例为1：9，先用5BV的蒸馏水洗涤树脂柱床，洗脱流速为3BV/h，弃去水洗脱液；再用体积百分比浓度为60％的甲醇溶液洗脱，洗脱流速为2BV/h，合并洗脱液减压回收甲醇，减压浓缩至相对密度为1.20～1.30，得大麻二酚初提取物；
步骤三：向步骤二所得大麻二酚初提取物中加入甲醇和100目粗硅胶，拌匀后烘干作为上样样品，然后将上样样品填充到动态轴向压缩柱(以300目的硅胶为填料)中填料的上方，并用流动相(石油醚-乙酸乙酯)在1.5MPa～3.6MPa的条件下进行梯度洗脱，梯度洗脱过程中石油醚和乙酸乙酯的体积比(石油醚：乙酸乙酯)由11:3降低至3:2，分别收集含大麻二酚的主段洗脱液，合并洗脱液后进行减压浓缩，过滤后减压回收流动相溶剂，经过冷冻干燥(冷冻干燥条件为预冻温度-40℃～-50℃，预冻时间6h～8h，隔板温度55℃～65℃，干燥时间18h～25h)后即得高纯度大麻二酚结晶。
经过HPLC检测本实施例制得的大麻二酚的纯度为88％，本实施例方法的产率为78％，从提取至获得终产物所用时间(即，步骤二和步骤三总共所用的时间)为30h～38h。
实施例4
本实施例与实施例2的区别在于：步骤二是向工业大麻粉中加入14倍体积的体积浓度为60％的乙醇溶液，加热回流提取2次～3次，每次1.5～2h，合并提取液，用于减压回收提取溶剂。其他步骤均与实施例3相同。
经过HPLC检测本实施例制得的大麻二酚的纯度为94％，本实施例方法的产率为83％，从提取至获得终产物所用时间(即，步骤二和步骤三总共所用的时间)为31h～39h。
实施例5
本实施例与实施例4的区别在于：步骤二是向工业大麻粉中加入15倍体积的体积浓度为70％的丙酮溶液，其他步骤均与实施例4相同。
经过HPLC检测本实施例制得的大麻二酚的纯度为96％，本实施例方法的产率为84％，从提取至获得终产物所用时间(即，步骤二和步骤三总共所用的时间)为32h～40h。
实施例6
本实施例与实施例4的区别在于：步骤二是向工业大麻粉中加入8倍体积的体积浓度为30％的异丙醇溶液，其他步骤均与实施例4相同。
经过HPLC检测本实施例制得的大麻二酚的纯度为85％，本实施例方法的产率为82％，从提取至获得终产物所用时间(即，步骤二和步骤三总共所用的时间)为34h～45h。
实施例7
本实施例与实施例2的区别在于：步骤二是向工业大麻粉中加入13倍体积的体积浓度为10％的乙醇溶液，其他步骤均与实施例2相同。
经过HPLC检测本实施例制得的大麻二酚的纯度为82％，本实施例方法的产率为73％，提取至获得终产物所用时间(即，步骤二和步骤三总共所用的时间)为33h～42h。
实施例8
本实施例与实施例3的区别在于：步骤二是向工业大麻粉中加入11倍体积的体积浓度为80％的乙醇溶液，其他步骤均与实施例3相同。
经过HPLC检测本实施例制得的大麻二酚的纯度为90％，本实施例方法的产率为87，从提取至获得终产物所用时间(即，步骤二和步骤三总共所用的时间)为32h～42h。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
摘自国家发明专利，发明人：刘欣，曹亮，申请号201910377710.9，申请日2019.04.30
