摘 要:一种超高液相色谱法制备高纯度大麻二酚的方法，属于天然药物化学制备技术领域。针对目前大麻二酚提取工艺流程复杂，提取率及纯度低的问题，本发明提供了一种利用超高液相色谱制备高纯度大麻二酚的方法，所述方法为以工业大麻为原料，以醇溶液或酮溶液为提取溶剂，利用动态超声逆流提取或加热回流提取，获得提取液；将提取液浓缩后经不锈钢加压硅胶柱色谱分离，再用超高液相色谱分离获得大麻二酚提取物。本发明适用于高纯度大麻二酚的工业化生产。
技术要点
1.一种超高液相色谱法制备高纯度大麻二酚的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)提取：以工业大麻为原料，以醇溶液或丙酮溶液为提取溶剂，利用动态超声逆流提取或加热回流提取，获得提取液；
2)分离：将提取液浓缩后经不锈钢加压硅胶柱色谱分离，再用超高液相色谱分离获得大麻二酚提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述提取，方法如下：将原料粉碎，按照1g：(6～20)mL的料液比，加入体积浓度为10％～80％的醇溶液或酮溶液，动态超声逆流提取或加热回流提取获得提取液；所述原料为工业大麻的花絮和叶片中的一种或两种的混合物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述动态超声逆流提取或加热回流提取2～3次，每次0.5～2h，100-120目滤网或板框压滤机过滤，然后合并提取液。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述醇溶液为甲醇、乙醇和异丙醇中的一种或多种的混合溶液；所述酮溶液为丙酮溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述浓缩是指将提取液经减压回收提取溶剂，获得浸膏。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述不锈钢加压硅胶柱色谱分离是指将浓缩后获得的浸膏加60-200目硅胶拌样，所述浸膏与硅胶的质量比为(1:4)～(1:30)，经加压不锈钢柱色谱，以300～1400目硅胶为填料，进行洗脱，获得洗脱液，洗脱剂采用正己烷、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇中的一种或者是任意几种的混合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述任意几种的混合物为下述组合中的任意一种：
①正己烷与丙酮的混合物，所述正己烷与丙酮的体积比为(12:1)～(3:1)；
②正己烷与乙酸乙酯的混合物，所述正己烷与乙酸乙酯的体积比为(10:1)～(2:1)；
③正己烷与甲醇的混合物，所述正己烷与甲醇的体积比为(15:1)～(5:1)；
④正己烷与乙醇的混合物，所述正己烷与乙醇的体积比为(12:1)～(4:1)；
⑤二氯甲烷与甲醇的混合物，所述二氯甲烷与甲醇的体积比为(90:1)～(10:1)；
⑥二氯甲烷与乙醇的混合物，所述二氯甲烷与乙醇的体积比为(95:1)～(15:1)；
⑦二氯甲烷与乙酸乙酯的混合物，所述二氯甲烷与乙酸乙酯的体积比为(60:1)～(5:1)；
⑧二氯甲烷与丙酮的混合物，所述二氯甲烷与丙酮的体积比为(80:1)～(20:1)；
⑨石油醚与丙酮的混合物，所述石油醚与丙酮的体积比为(15:1)～(3:1)；
⑩石油醚与乙酸乙酯的混合物，所述石油醚与乙酸乙酯的体积比为(12:1)～(3:1)；
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述超高液相色谱，使用正相硅胶柱或反相C18柱色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱所用流动相由流动相A与流动相B组成，其中流动相A为乙腈或甲醇，流动相B为含0.02％～0.1％(体积分数)三氟乙酸的水、含0.02％～0.1％(体积分数)冰醋酸的水或含0.02％～0.1％(体积分数)甲酸的水。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤2)所述梯度洗脱，在0-10min，流动相A与流动相B体积比为(100∶5)～(90：10)；10～12min，流动相A与流动相B体积比为(95∶5)～(100∶0)；12～15min流动相A与流动相B体积比为100∶0。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤2)所述梯度洗脱的流速为0.8mL·min-1～1.5mL·min-1；柱温为30℃～40℃；检测波长为220nm。
技术领域
本发明属于天然药物制备技术领域，具体涉及一种超高液相色谱法制备高纯度大麻二酚的方法。
背景技术
工业大麻(Cannabissativa)与传统有毒大麻具有本质差别，根据1988年联合国明确规定，工业大麻是指不具备提取成瘾性成分(四氢大麻酚THC)价值或直接作为毒品吸食，专供工业用途的原料大麻，生长期的工业大麻的花絮及叶中的四氢大麻酚含量(THC)<0.3％，可以合法进行规模化种植与工业化开发利用。
工业大麻是一种非常有前途的药用植物，其中大麻酚类化合物中药用价值最高的活性成分为大麻二酚(CBD)。大麻二酚(CBD)为大麻中非成瘾部分，CBD能阻止四氢大麻酚(THC)对人体神经系统的影响，同时具有抗肌肉引起的不随意挛缩、抗结缔组织炎症、风湿性关节炎、抗精神焦虑、抗细胞凋亡、抗氧化、抗炎、保护神经细胞等药理活性。二氢大麻酚(CBD)不溶于水，溶于乙醇、乙醚、石油醚、苯、碱溶液、正己烷、6号溶剂油、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇。熔点67℃、沸点185℃。目前大麻二酚提取大多采用醇提法、柱层析或单纯超临界萃取等技术，技术相对老旧，且生产效率低，纯度低。
发明内容
针对目前大麻二酚提取工艺流程复杂，提取率及纯度低的问题，本发明提供了一种超高液相色谱法制备高纯度大麻二酚的方法，所述方法包括：
1)提取：以工业大麻为原料，以醇溶液或酮溶液为提取溶剂，利用动态超声逆流提取或加热回流提取，获得提取液；
2)分离：将提取液浓缩后经不锈钢加压硅胶柱色谱分离，再用超高液相色谱分离获得大麻二酚提取物。
进一步地限定，步骤1)所述提取，方法如下：将原料粉碎，按照1g：(6～20)mL的料液比，加入体积浓度为10％～80％的醇溶液或酮溶液，动态超声逆流提取或加热回流提取获得提取液；所述原料为工业大麻的花絮和叶片中的一种或两种的混合物。
进一步地限定，所述动态超声逆流提取或加热回流提取2～3次，每次0.5～2h，100-120目滤网或板框压滤机过滤，然后合并提取液。
进一步地限定，所述醇溶液为甲醇、乙醇和异丙醇中的一种或多种的混合溶液；所述酮溶液为丙酮溶液。
进一步地限定，步骤2)所述浓缩是指将提取液经减压回收提取溶剂，获得浸膏。
进一步地限定，步骤2)所述不锈钢加压硅胶柱色谱分离是指将浓缩后获得的浸膏加60-200目硅胶拌样，所述浸膏与硅胶的质量比为(1:4)～(1:30)。经加压不锈钢柱色谱，以300～1400目硅胶为填料，进行洗脱，获得洗脱液，洗脱剂采用正己烷、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇中的一种或者是任意几种的混合物。
进一步地限定，所述任意几种的混合物为下述组合中的任意一种：
①正己烷与丙酮的混合物，所述正己烷与丙酮的体积比为(12:1)～(3:1)；
②正己烷与乙酸乙酯的混合物，所述正己烷与乙酸乙酯的体积比为(10:1)～(2:1)；
③正己烷与甲醇的混合物，所述正己烷与甲醇的体积比为(15:1)～(5:1)；
④正己烷与乙醇的混合物，所述正己烷与乙醇的体积比为(12:1)～(4:1)；
⑤二氯甲烷与甲醇的混合物，所述二氯甲烷与甲醇的体积比为(90:1)～(10:1)；
⑥二氯甲烷与乙醇的混合物，所述二氯甲烷与乙醇的体积比为(95:1)～(15:1)；
⑦二氯甲烷与乙酸乙酯的混合物，所述二氯甲烷与乙酸乙酯的体积比为(60:1)～(5:1)；
⑧二氯甲烷与丙酮的混合物，所述二氯甲烷与丙酮的体积比为(80:1)～(20:1)；
⑨石油醚与丙酮的混合物，所述石油醚与丙酮的体积比为(15:1)～(3:1)；
⑩石油醚与乙酸乙酯的混合物，所述石油醚与乙酸乙酯的体积比为(12:1)～(3:1)；
进一步地限定，步骤2)所述超高液相色谱，使用正相硅胶柱或反相C18柱色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱所用流动相由流动相A与流动相B组成，其中流动相A为乙腈或甲醇，流动相B为含0.02％～0.1％(体积分数)三氟乙酸的水、含0.02％～0.1％(体积分数)冰醋酸的水或含0.02％～0.1％(体积分数)甲酸的水。
进一步地限定，步骤2)所述梯度洗脱，在0-10min，流动相A与流动相B体积比为(100∶5)～(90：10)；10～12min，流动相A与流动相B体积比为(95∶5)～(100∶0)；12～15min流动相A与流动相B体积比为100∶0。
进一步地限定，步骤2)所述梯度洗脱的流速为0.8mL·min-1～1.5mL·min-1；柱温为30℃～40℃；检测波长为220nm。
有益效果
本发明采用超高液相色谱制备技术提取获得的纯度为90％～98％的大麻二酚晶体。
具体实施方式
本发明所使用的仪器或试剂，如无特殊说明，均可通过商业化途径购买获得。
实施例1:
1)提取：以工业大麻为原料，以醇溶液或酮溶液为提取溶剂，利用动态超声逆流提取或加热回流提取，获得提取液。具体方法为：
将工业大麻花絮粉碎至50目，按照1g：6mL的料液比，加入体积浓度为10％的甲醇溶液，动态超声逆流提取2次，每次2h，100目滤网过滤，然后合并提取液。
2)分离：将提取液浓缩后经不锈钢加压硅胶柱色谱分离，再用超高液相色
谱分离获得大麻二酚提取物。具体方法为：
将提取液经减压回收提取溶剂，获得浸膏。将浓缩后获得的浸膏加60目硅胶拌样，所述浸膏与硅胶的质量比为1:4。经加压不锈钢柱色谱(120～150cm×12～15cm)，以800目硅胶为填料，进行洗脱，获得洗脱液，洗脱剂为正己烷与丙酮的混合物，所述正己烷与丙酮的体积比为(12:1)～(3:1)，可以采用梯度洗脱的方式，梯度洗脱过程中正己烷与丙酮的体积比由12:1降低至3:1。然后将加压不锈钢柱色谱处理获得的洗脱液采用超高液相色谱(超高液相色谱流动相携载样品在进样前，先用0.45微米滤膜过滤)，使用反相C18硅胶柱进行梯度洗脱，梯度洗脱所用流动相由流动相A与流动相B组成，其中流动相A为乙腈，流动相B为含0.02％(体积分数)三氟乙酸的水，在0-10min，流动相A与流动相B体积比为100∶5；10～12min，流动相A与流动相B体积比为95∶5；12～15min流动相A与流动相B体积比为100∶0。梯度洗脱的流速为0.8mL·min-1；柱温为30℃；检测波长为220nm，获得的洗脱液经减压回收流动相后冷冻干燥，条件为预冻温度-30℃℃，预冻时间10h，隔板温度60℃，干燥时间30h。最终得到淡黄色纯度为90％的大麻二酚晶体。
实施例2:
1)提取：以工业大麻为原料，以醇溶液或酮溶液为提取溶剂，利用动态超声逆流提取或加热回流提取，获得提取液。具体方法为：
将工业大麻花絮粉碎至10目，按照1g：20mL的料液比，加入体积浓度为80％的甲醇溶液，动态超声逆流提取3次，每次0.5h，板框压滤机过滤，然后合并提取液。
2)分离：将提取液浓缩后经不锈钢加压硅胶柱色谱分离，再用超高液相色谱分离获得大麻二酚提取物。具体方法为： 将提取液经减压回收提取溶剂，获得浸膏。将浓缩后获得的浸膏加100目硅胶拌样，所述浸膏与硅胶的质量比为1:30。经加压不锈钢柱色谱(120～150cm×12～15cm)，以1400目硅胶为填料，进行洗脱，获得洗脱液，洗脱剂为正己烷与乙酸乙酯的混合物，所述正己烷与乙酸乙酯的体积比为(10:1)～(2:1)，可以采用梯度洗脱的方式，梯度洗脱过程中正己烷与乙酸乙酯的体积比由10:1降低至2:1。然后将加压不锈钢柱色谱处理获得的洗脱液采用超高液相色谱(超高液相色谱流动相携载样品在进样前，先用0.45微米滤膜过滤)，使用反相C18柱色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱所用流动相由流动相A与流动相B组成，其中流动相A为甲醇，流动相B为含0.1％(体积分数)冰醋酸的水，在0～10min，流动相A与流动相B体积比为90：10；10～12min，流动相A与流动相B体积比为98:2；12～15min流动相A与流动相B体积比为100∶0。梯度洗脱的流速为1.5mL·min-1；柱温为40℃；检测波长为220nm，获得的洗脱液经减压回收流动相后冷冻干燥，条件为预冻温度-40℃，预冻时间8h，隔板温度60℃，干燥时间25h。最终得到淡黄色纯度为98％的大麻二酚晶体。
实施例3:
1)提取：以工业大麻为原料，以醇溶液或酮溶液为提取溶剂，利用动态超声逆流提取或加热回流提取，获得提取液。具体方法为：
将工业大麻花絮粉碎至100目，按照1g：10mL的料液比，加入体积浓度为80％的甲醇溶液，动态超声逆流提取3次，每次0.5h，120目滤网过滤，然后合并提取液。
1) 分离：将提取液浓缩后经不锈钢加压硅胶柱色谱分离，再用超高液相色谱分离获得大麻二酚提取物。具体方法为：
将提取液经减压回收提取溶剂，获得浸膏。将浓缩后获得的浸膏加80目硅胶拌样，所述浸膏与硅胶的质量比为1:15。经加压不锈钢柱色谱(120～150cm×12～15cm)，以1000目硅胶为填料，进行洗脱，获得洗脱液，洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯的混合物，所述石油醚与乙酸乙酯的体积比为(12:1)～(3:1)，可以采用梯度洗脱的方式，梯度洗脱过程中石油醚与乙酸乙酯的体积比由12:1降低至3:1。然后将加压不锈钢柱色谱处理获得的洗脱液采用超高液相色谱(超高液相色谱流动相携载样品在进样前，先用0.45微米滤膜过滤)，使用反相C18柱色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱所用流动相由流动相A与流动相B组成，其中流动相A为甲醇，流动相B为含0.1％(体积分数)冰醋酸的水，在0-10min，流动相A与流动相B体积比为100∶5；10～12min，流动相A与流动相B体积比为100∶0；12～15min流动相A与流动相B体积比为100∶0。梯度洗脱的流速为1.0mL·min-1；柱温为35℃；检测波长为220nm，获得的洗脱液经减压回收流动相后冷冻干燥，条件为预冻温度-35℃，预冻时间10h，隔板温度55℃，干燥时间30h。最终得到淡黄色纯度为95％的大麻二酚晶体。
实施例4:
重复实施例1，与实施例1的不同在于，本实施例中步骤2)所述的洗脱剂为正己烷与甲醇的混合物。最终制备获得的淡黄色纯度为91％的大麻二酚晶体。
实施例5:
重复实施例1，与实施例1的不同在于，本实施例中步骤2)所述的洗脱剂为石油醚与丙酮的混合物。最终制备获得的淡黄色纯度为92％的大麻二酚晶体。
实施例6:
重复实施例1，与实施例1的不同在于，本实施例中步骤1)所述的提取为将工业大麻花絮粉碎80目，按照1g：6mL的料液比，加入体积浓度为50％的甲醇溶液，80℃加热回流提取2次，每次2h，120目滤网过滤，然后合并提取液。最终制备获得的淡黄色纯度为94％的大麻二酚晶体。
摘自国家发明专利，发明人：刘欣，曹亮，申请号201910362991.0，申请日 2019.04.30
