摘 要：本发明公开了一种高CBD含量工业大麻的育种及育苗方法，所述的育种方法包括：(1)高CBD含量工业大麻的亲本的选择：以CBD含量大于1％的工业大麻种子作为父本，以CBD：THC含量比例高于5的雌雄异株大麻DMG245作为母本；(2)高CBD含量工业大麻品系的培育：将筛选出的亲本进行杂交获得F1代；F1代自交，获得F2代；从F2代中选择CBD含量为1.5％以上的单株与DMG245母本回交，获得F3代；将F3代自交，获得F4代；从F4 代中选择CBD含量为1.5％以上的单株与DMG245母本回交，获得F5代；将F5代自交，获得F6代，即得CBD含量为1.5％以上工业大麻品系。
技术要点
1.一种高CBD含量工业大麻的育种方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）高CBD含量工业大麻的亲本的选择：以CBD含量大于1％的工业大麻种子作为父本， 以CBD：THC含量比例高于5的雌雄异株大麻DMG245作为母本；
（2）高CBD含量工业大麻品系的培育：将筛选出的亲本进行杂交获得F1代；F1代自交，获得F2代；从F2代中选择CBD含量为1.5％以上的单株与DMG245母本回交，获得F3代；将F3代自交，获得F4代；从F4代中选择CBD含量为1.5％以上的单株与DMG245母本回交，获得F5代；将F5代自交，获得F6代，即得。
2.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述的高CBD含量工业大麻为CBD含量为1.5％以上工业大麻品系。
3.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，以CBD含量大于1％的工业大麻云麻7号作为父本。
4.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述的CBD含量采用HPLC方法测定CBD。
5.根据权利要求4所述的育种方法，其特征在于，所述的HPLC法中色谱柱为C18柱；所述的HPLC法中流动相甲醇-水(80：20)；所述的HPLC法中检测波长210nm；所述的HPLC法中流动相的流速为1ml/min；所述的HPLC法中样品的进样量为20μl。
6.根据权利要求4所述的育种方法，其特征在于，所述的HPLC法中样品溶液的处理方法包括：取工业大麻花叶粉碎，过筛，称取3g加入甲醇25ml，超声15min，冷却，用甲醇补重，过滤，取续滤液3ml置10ml量瓶中，加甲醇定容。
7.一种高CBD含量工业大麻的育苗方法，所述的方法包括：
（1）获得高CBD含量工业大麻种子：以CBD含量大于1％的工业大麻种子作为父本，以CBD：THC含量比例高于5的雌雄异株大麻DMG245作为母本；将上述筛选出的亲本进行杂交获得F1代；F1代自交，获得F2代；从F2代中选择CBD含量为1.5％以上的单株与DMG245母本回交，获得F3代；将F3代自交，获得F4代；从F4代中选择CBD含量为1.5％以上的单株与DMG245母本回交，获得F5代；将F5代自交，获得F6代，即得CBD含量稳定在1.5％以上的大麻品系；
（2）将育苗基质装入漂浮育苗盘中；
（3）向步骤(2)的漂浮育苗盘中播种步骤(1)获得的工业大麻种子，然后覆盖育苗基质；
（4）将步骤(3)的漂浮育苗盘放入育苗池中；
（5）出苗后第3-5天炼苗；
（6）出苗第9-11天追肥。
8.根据权利要求7所述的育种方法，其特征在于，所述的育苗基质包含草炭、珍珠岩、蛭石，三者的比例为2-4：1-3：1。
9.根据权利要求7所述的育种方法，其特征在于，所述的漂浮育苗盘为162孔漂浮育苗盘。
10.根据权利要求7所述的育种方法，其特征在于，步骤(3)中播种的种子为在播种前经过温水浸泡和消毒处理的饱满种子。
技术领域
本发明涉及工业大麻育种技术领域，更具体地，涉及一种高含量CBD工业大麻的育种方法。
背景技术
大麻是大麻科(Cannabinaceae)大麻属(Cannabis)1年生草本植物。工业大麻是指四氢大麻酚含量低于0.3％的大麻，也称为汉麻(hemp)，可作纤用、籽用、药用等。现在国内外广泛应用的大麻为工业大麻。大麻酚类化合物中药用价值最高的活性成分为四氢大麻酚和大麻二酚，两者为同分异构体，但活性作用有很大差异。大麻二酚是从大麻中提取的非精神活性成分，不会导致生理依赖，具有良好的耐受性，对神经疾病、癫痫、肿瘤、炎症、肝损伤、糖尿病、疼痛等多种疾病都表现出一定的治疗特性，在医药领域的重要性越发凸显。在允许使用工业大麻的国家中，实际上允许使用的是具有医疗作用的CBD(大麻二酚)，也即工业大麻。工业大麻中CBD含量越高价值越高。我国目前成熟的高CBD含量的工业大麻种子是云麻7号，CBD含量最高在1.3％，平均值在1％。
杂交育种包括单杂交、复合杂交、回交等方法。单杂交即两个品种间的杂交(单交)用甲×乙表示，其杂种后代称为单交种，由于简单易行、经济，在生产上应用最广，一般主要是利用杂种第一代，如丰鲤、福寿鱼。回交即杂交后代继续与其亲本之一再杂交，以加强杂种世代某一亲本性状的育种方法。回交育种能把某一群体乙的一个或几个经济性状引入另一群体甲中。将回交子代选择的注意力集中在某个目标性状上，从而最终育成一个具有目标形状的新品种/品系。
CN109673505A公开了一种工业大麻的杂交育种方法，以雌雄同株工业大麻DMG240为父本，以高大麻二酚含量的雌雄异株工业大麻DMG231为母本，得到F1代全雌型高大麻二酚工业大麻杂交种，命名为汉麻1号。汉麻1号平均CBD含量为3.60％，是云麻7号的CBD含量的3-4倍，平均THC含量为0.18％。
CN109122306A公开了一种获得高大麻二酚含量工业大麻植株的方法，包括：当工业大麻实生苗植株初长到拔节期或灌浆期时，在植株茎尖上包裹或放置棉团，然后用甲基磺酸乙酯溶液滴于植株茎尖的棉团上，进行诱变反应；移去棉团，用NaS2O3溶液涂抹茎尖终止诱变反应，再用流水冲洗，作成长高度标记；待工业大麻植株从标记的部位向上长到获得生长高度时，取插穗进行扦插，待插穗生根后移栽，并按常规栽培管理；经甲基磺酸乙酯处理后成活的突变植株，对其进行性状稳定性验证后，从中筛选出大麻二酚CBD含量高的突变植株。
然而，目前仍然需要寻找新的工业大麻品系，提高工业大麻花叶中CBD含量。
发明内容
本发明提供了一种高CBD含量工业大麻的育种方法，所述的方法包括：
(1)高CBD含量工业大麻的亲本的选择：以CBD含量大于1％的工业大麻种子作为父本，以CBD：THC含量比例高于5的雌雄异株大麻DMG245作为母本；
(2)高CBD含量工业大麻品系的培育，具体步骤如下：
将上述筛选出的亲本进行杂交获得F1代；
F1代自交，获得F2代；
从F2代中选择CBD含量为1.5％以上的单株与DMG245母本回交，获得F3代；
将F3代自交，获得F4代；
从F4代中选择CBD含量为1.5％以上的单株与DMG245母本回交，获得F5代；
将F5代自交，获得F6代，即得CBD含量稳定在1.5％以上的大麻品系。
优选的，本发明所述的以CBD含量大于1％的工业大麻种子作为父本选择CBD含量大于1％的工业大麻云麻7号作为父本。
优选的，本发明所述的雌雄异株大麻DMG245具有抗病抗虫、低毒、耐盐的特性。
优选的，本发明所述的CBD含量的测定方法为HPLC法测定工业大麻花叶中CBD的含量。更优选的，所述的HPLC法中色谱柱为C18柱；所述的HPLC法中流动相甲醇-水(80：20)；所述的HPLC法中检测波长210nm；所述的HPLC法中流动相的流速为1ml/min；所述的HPLC法中样品的进样量为20μl。
更优选的，所述的HPLC法中工业大麻花叶的处理方法包括：取工业大麻花叶粉碎， 过筛，称取3g加入甲醇25ml，超声15min，冷却，用甲醇补重，过滤，取续滤液3ml置10ml量瓶中，加甲醇定容。
本发明还提供了一种高CBD含量工业大麻的育苗方法，所述的方法包括：
(1)获得高CBD含量工业大麻种子：以CBD含量大于1％的工业大麻种子作为父本，以CBD：THC含量比例高于5的雌雄异株大麻DMG245作为母本；将上述筛选出的亲本进行杂交获得F1代；F1代自交，获得F2代；从F2代中选择CBD含量为1.5％以上的单株与DMG245母本回交，获得F3代；将F3代自交，获得F4代；从F4代中选择CBD含量为1.5％以上的单株与DMG245母本回交，获得F5代；将F5代自交，获得F6代，即得CBD含量稳定在1.5％以上的大麻品系。
(2)将育苗基质装入漂浮育苗盘中；
(3)向步骤(2)的漂浮育苗盘中播种步骤(1)获得的工业大麻种子，然后覆盖育苗基质；
(4)将步骤(3)的漂浮育苗盘放入育苗池中；
(5)出苗后第3-5天炼苗；
(6)出苗第9-11天追肥。
优选的，所述的育苗基质包含草炭、珍珠岩、蛭石，三者的比例为2-4：1-3：1；更优选的，所述的育苗基质为将草炭、珍珠岩和蛭石按照3：2：1的比例混合所得。
优选的，所述的育苗基质的水分含量控制为50％-70％(具体如，50％、60％、70％)。
在本发明的一个实施方式中，所述的漂浮育苗盘为162孔漂浮育苗盘。
在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中的播种包括每孔播种1-5粒(如1、2、3、4、5 粒)工业大麻种子。
具体地，步骤(3)中播种后覆盖的育苗基质的厚度为1-2cm。
具体地，步骤(3)中播种的种子为在播种前经过温水浸泡和消毒处理的饱满种子。
在本发明的一个实施例中，所述的温水浸泡处理包括：在35-45℃温水浸泡4-5h。
在本发明的一个实施例中，所述的消毒处理包括：采用杀菌剂溶液浸泡5-10min；所述的杀菌剂选自：多菌灵、波尔多液、百菌清、托布津、代森锌等中的一种或多种的组合；在本发明的一个实施例中，上述杀菌剂为多菌灵；在本发明的一个实施例中，所述的杀菌剂溶液为300-700倍(具体如，300、400、500、600、700倍)多菌灵溶液。
具体地，步骤(3)还包括：对育苗盘中的育苗基质表面进行消毒处理的步骤，如采用杀菌剂溶液进行消毒处理；所述的杀菌剂选自：多菌灵、波尔多液、百菌清、托布津、代森锌等中的一种或多种的组合；在本发明的一个实施例中，所述的杀菌剂为百菌清；在本发明的一个实施例中，所述的杀菌剂溶液为600-1000倍(具体如，600、700、800、900、1000倍)百菌清溶液。
在本发明的一个实施方式中，步骤(4)中的育苗池在放入漂浮育苗盘前预先进行水体消毒和病害预防以及施肥处理。
具体地，所述的水体消毒和病害预防处理包括向育苗池水中施入杀菌剂溶液的步骤；上述杀菌剂选自：多菌灵、波尔多液、百菌清、托布津、代森锌、敌克松、恶霉灵等中的一种或多种的组合；在本发明的一个实施例中，所述的杀菌剂包括多菌灵和敌克松。
在本发明的一个实施方式中，所述的水体消毒和病害预防处理包括向育苗池水中施入75％多菌灵和敌克松。
具体地，所述的75％多菌灵的施用量为0.1-0.2g/L。
具体地，所述的敌克松的施用量为0.1-0.2g/L。
具体地，所述的施肥处理包括向育苗池水中施入复合肥，其施用量为0.2-0.35g/L；在本发明的一个实施例中，复合肥中氮、磷、钾的比例为N：P：K＝19：19：19。
具体地，步骤(4)中的育苗池水的深度可为10-12cm。
具体地，步骤(4)中的育苗池水可为自来水或井水。
具体地，步骤(4)中的育苗池可采用黑色膜为池膜。
具体地，步骤(4)中的育苗池位于遮阳条件下，如在遮阳网下。
在本发明的一个实施方式中，步骤(4)中的育苗池可位于育苗棚内；具体地，该育苗棚采用白色塑料膜为顶膜，并在顶膜上覆盖遮阳网，该遮阳网的遮阳率可为75％。
在本发明的一个实施例中，所述的育苗池的池膜长7.8m、宽2.2m，沿育苗棚四周卡槽固定，上述育苗棚长6.0m、宽1.4m、高1.2m。
具体地，步骤(5)中的炼苗包括在上午10点前和下午5点后移除遮阳条件(如遮阳网)的步骤，还包括3天后全部移除遮阳条件(如遮阳网)的步骤。
具体地，步骤(6)中的追肥为向育苗池水中施入复合肥、磷酸二氢钾和碳能水溶肥。
具体地，所述的复合肥的施用量为0.15-0.25g/L。
在本发明的一个实施例中，所述的复合肥中氮、磷、钾的比例为N：P：K＝30：10：15。
具体地，所述的磷酸二氢钾的施用量为0.1-0.2g/L。
具体地，所述的碳能水溶肥的施用量为0.1-0.2g/L。
在本发明的方法所述育苗过程中，育苗环境内通风，温度控制在30℃以内。
出苗后第18-20天，苗的株高达到12-15cm，根系成团状时，即完成整个育苗周期。
本发明所述的育种方法精准的选择高含量CBD的工业大麻种子亲本，缩短育种的周期，提高了育种的效果，最终杂交得到的工业大麻种子发育后花叶中CBD的含量可稳定的达到1.5％以上。而本发明所述的育种方法受自然气候变化影响小，环境可控，所培育的种苗整齐一致，有效解决了大田种子直播存在的出苗率低、出苗不整齐等问题。
具体实施方式
实施例1 工业大麻花叶中CBD含量测定方法
对照品溶液制备：取CBD对照品适量，加甲醇制成含0.002、0.02、0.2、1mg/ml作为对照品溶液。
样品溶液制备：取工业大麻花叶粉碎，过筛，称取3g加入甲醇25ml，超声15min，冷却，用甲醇补重，过滤，取续滤液3ml置10ml量瓶中，加甲醇定容。
HPLC条件：色谱柱C18柱(3.9mm×300mm，10um)；流动相甲醇-水(80：20)；检测波长210nm；流速1ml/min；进样量20μl。
线性实验：取对照品溶液各10μ1，以进样量为横坐标，相应峰面积A为纵坐标进行线性回归，结果表明在0.02-0.2μg范围内线性关系良好。
重现性和精密度实验：取对照品溶液，连续进样6次，做精密度试验。另取同批工业大麻花叶样品6份，制备样品溶液，做重现性试验。结果表明，所述的HPLC含量测定方法精密度和重现性RSD均较好。
样品测定：按照样品溶液的制备方法制备样品溶液，取10μ1进样，计算样品中CBD 的含量。
实施例2 高CBD含量工业大麻品系的培育
采用实施例1的方法测定大麻花叶中CBD含量。选取CBD含量在1％以上的云麻7号作为父本，选择CBD：THC含量比例高于5的雌雄异株大麻DMG245(由中国农业科学院麻类研究所提供，来源于国家麻类作物种质资源中期库)作为母本，进行杂交得到F1代；采用实施例1的方法测定对F1代大麻花叶中CBD含量，筛选出CBD含量1.5％以上株系进行自交得到F2代；采用实施例1的方法测定对F2代大麻花叶中CBD含量，筛选出CBD含量1.5％以上株系与DMG245母本进行回交得到F3代；采用实施例1的方法测定对F3代大麻花叶中CBD含量，从F3 代筛选出稳定的CBD含量1.5％以上株系自交得到F4代；采用实施例1的方法测定对F4代大麻花叶中CBD含量，从F4代中筛选出稳定的CBD含量1.5％以上株系与DMG245母本进行回交得到F5代；F5代自交，得到F6代，采用实施例1的方法测定对F6代大麻花叶中CBD含量。
重复上述方法3次，分别得到3批次高CBD含量工业大麻种子。
表1 三批次父本与F6代工业大麻种子CBD含量的比较
|
花叶中CBD含量 |
批次1 |
批次2 |
批次3 |
|
父本 |
1.12％ |
1.18％ |
1.13％ |
|
F6代 |
1.63％ |
1.57％ |
1.66％ |
实施例3 高CBD含量工业大麻品系的育苗
(1)选择地势平坦、水源方便、水质无污染、通风向阳的地方，搭建长6.0m、宽1.4m、高1.2m的钢架育苗棚，采用10丝厚的白色塑料膜作为顶膜，并在顶膜上盖1层75％遮阳率的遮阳网。每个育苗棚内可放置漂浮育苗盘36个；
(2)采用长7.8m、宽2.2m、厚12丝的黑色膜作为池膜，沿育苗棚四周卡槽固定，制作成高约20cm育苗池；
(3)注入自来水或井水，深度10cm，每个育苗池施入75％多菌灵100g和敌克松100g，进行水体消毒和病害预防，同时施入N：P：K比例为19：19：19的复合肥200g；
(4)将草炭、珍珠岩、蛭石按照3：2：1的比例配制基质，800倍多菌灵溶液消毒处理，基质含水量控制在60％左右；
(5)将配制好的基质均匀装入162孔的漂浮育苗盘中；
(6)选用实施例2批次2培育得到的工业大麻种子，40℃温水浸泡4-5h，500倍多菌灵浸泡5-10min进行种子消毒处理；按照每孔3粒种子播种，覆盖1-2cm厚的基质；将播种后的漂浮育苗盘放入育苗池中，用800倍百菌清喷洒基质表层；放下育苗棚侧膜，并压紧周围塑料膜；
(7)保持棚内通风，棚内温度控制在30℃以内；出苗第4d开始，上午10点前和下午5点后揭开遮阳网，3d后全部揭去遮阳网；出苗第10d，将N：P：K比例为30：10：15的复合肥150g、磷酸二氢钾100g和碳能水溶肥0.1-0.2g/L施入育苗池；
出苗后第18-20d，苗的株高达到12-15cm，根系成团状时，即完成整个育苗周期，成苗率达到97.5％。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
摘自国家发明专利，发明人：张可，谭昕，陈越，王卫，田伟，施逢时，胡岂瑄，刘有贵，申请号201911336979.9，申请日2019.12.23
