摘  要：本发明公开了一种工业大麻根系土壤检测用微生物提取方法，通过土壤取样装置取出同一处工业大麻植物根系处的土壤样品两份，两份工业大麻植物根系处的土壤样品分别用玻璃瓶盛装，两份土壤样品量一样，一份用作土壤微生物量测定，一份作土壤微生物提取，第一份土壤样品经过蒸熏处理测定后微生物量符合标准后，再通过第二份土壤样品进行微生物的提取。本发明具有提取土壤微生物前先对土壤中的微生物含量进行检测，达标后在进行提取作业，避免了提取微生物不达标的优点。

技术要点

1.一种工业大麻根系土壤检测用微生物提取方法，其特征在于：通过土壤取样装置取出同一处工业大麻植物根系处的土壤样品两份，第一份土壤样品经过蒸熏处理测定后微生物量符合标准后，再通过第二份土壤样品进行微生物的提取。

2.根据权利要求1所述的一种工业大麻根系土壤检测用微生物提取方法，其特征在于：两份工业大麻植物根系处的土壤样品分别用玻璃瓶盛装，两份土壤样品量一样，一份用作土壤微生物量测定，一份作土壤微生物提取。

3.根据权利要求1所述的一种工业大麻根系土壤检测用微生物提取方法，其特征在于：土壤微生物含量测定流程：

S1、将取出的一份土壤样品进行前处理，并分成等量的四份，将处理后的一份土壤样品放入蒸熏装置内进行蒸熏处理，通过蒸熏将土壤中微生物杀死；熏蒸开始的同时，另取剩下的三份土壤于聚乙烯塑料瓶中，直接加入KSO4提取，另作三个土壤样品；

S2、将蒸熏处理后的土壤无损地转移到聚乙烯塑料瓶中，加入的KSO4，将聚乙烯塑料瓶通过振荡机振荡，再用中速定量滤纸过滤在塑料瓶中；

S3、吸取上述土壤提取液于消化管中，准确加入H2SO4溶液，加入两个玻璃珠，混匀后置于磷酸浴中煮沸，冷却后将溶液无损地转移至三角瓶中，用去离子水洗涤消化管使溶液体积约为，加入一滴邻菲罗啉指示剂，用硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色变为蓝色，再变为红棕色，即为滴定终点；

S4、根据相应的计算公式，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解而放出CO2,根据释放出的CO2的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。

4.根据权利要求1所述的一种工业大麻根系土壤检测用微生物提取方法，其特征在于：土壤微生物提取方法：

S1、称取第二份土壤样品，与DNA提取液一起加入瓶中放置在摇床上摇动；

S2、接着加入20％SDS在水浴加热设备中加热,每隔20分钟轻微晃动瓶子，晃动瓶子时注意不要烫到手；

S3、水浴加热后，将瓶子放置在离心机上离心,收集上清液,转移到离心管中；土壤沉淀再加入DNA提取液和20％的SDS,通过摇床摇晃,在水浴加热设备中加热，在离心机上离心,收集上清液与上次的上清液合并；再进行一侧上述操作，收集到的上清液与前两次上清液合并；

S4、收集到的上清液与等体积的氯仿异戊醇混合液24:1混合，混合后经过离心机离心,吸取水相转移至另一个离心管中，以0.6倍体积的异丙醇作为添加液沉淀,经过离心机离心,收集核酸沉淀，用冷的70％乙醇洗涤沉淀，溶于TE溶液中；

S5、通过上述方法可以的提取处第二份土壤中的微生物。

技术领域

本发明涉及土壤检测用微生物提取技术领域，具体为一种工业大麻根系土壤检测用微生物提取方法。

背景技术

工业大麻是深耕作物，为直根系，侧根多，主根能深人土壤2-2.5米，侧根大部分分布在20-40厘米土层内，横向伸展可达60-80厘米。根侧根大部分分布在20-40厘米土层内，横向伸展可达60-80厘米。根分布在30-50厘米深度范围内。在湿软土壤中,主根深度仅达到40-60厘米，侧根主要分布在10-20厘米深度范围内。根区深度还取决于地下水深度以及工业大麻的品种和生态类型。雄麻的根.系没有雌麻发达，密植工业大麻的根系没有稀疏种植工业大麻的根系发达。一般而言，根重占整个工业大麻植株重量的8-9％。

工业大麻种植处的土壤中含有各种的微生物。微生物是生态系统的重要组成部分,在地球生类极其丰富,1克农田土壤中含有几百万细菌数十万真菌孢子和数万个原生动物和藻类。目前,关于土壤微生物尤其是土壤中微生物多样性及其在生态系统中的作用的研究越来越受到重视。

对工业大麻根系土壤检测时是对其土壤内的微生物检测，检测时需要将微生物提取出来。现有的土壤微生物提取方法直接取样提取，不同位置的土壤中含有的微生物量不一样，直接对土壤提取微生物有可能导致提取不达标，影响后续的进程。

发明内容

本发明的目的在于提供一种工业大麻根系土壤检测用微生物提取方法，具备提取土壤微生物前先对土壤中的微生物含量进行检测，达标后在进行提取作业，避免了提取微生物不达标的优点，解决了不同位置的土壤中含有的微生物量不一样，直接对土壤提取微生物有可能导致提取不达标，影响后续的进程的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种工业大麻根系土壤检测用微生物提取方法，通过土壤取样装置取出同一处工业大麻植物根系处的土壤样品两份，第一份土壤样品经过蒸熏处理测定后微生物量符合标准后，再通过第二份土壤样品进行微生物的提取。

作为本发明的进一步方案，两份工业大麻植物根系处的土壤样品分别用玻璃瓶盛装，两份土壤样品量一样，一份用作土壤微生物量测定，一份作土壤微生物提取。

一种工业大麻根系土壤检测用微生物提取方法，土壤微生物含量测定流程：

S1、将取出的一份土壤样品进行前处理，并分成等量的四份，将处理后的一份土壤样品放入蒸熏装置内进行蒸熏处理，通过蒸熏将土壤中微生物杀死；熏蒸开始的同时，另取剩下的三份土壤于聚乙烯塑料瓶中，直接加入KSO4提取，另作三个土壤样品；

S2、将蒸熏处理后的土壤无损地转移到聚乙烯塑料瓶中，加入的KSO4，将聚乙烯塑料瓶通过振荡机振荡，再用中速定量滤纸过滤在塑料瓶中；

S3、吸取上述土壤提取液于消化管中，准确加入H2SO4溶液，加入两个玻璃珠，混匀后置于磷酸浴中煮沸，冷却后将溶液无损地转移至三角瓶中，用去离子水洗涤消化管使溶液体积约为，加入一滴邻菲罗啉指示剂，用硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色变为蓝色，再变为红棕色，即为滴定终点；

S4、根据相应的计算公式，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解而放出CO2,根据释放出的CO2的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。

一种工业大麻根系土壤检测用微生物提取方法，土壤微生物提取方法：

S1、称取第二份土壤样品，与DNA提取液一起加入瓶中放置在摇床上摇动；

S2、接着加入20％SDS在水浴加热设备中加热,每隔20分钟轻微晃动瓶子，晃动瓶子时注意不要烫到手；

S3、水浴加热后，将瓶子放置在离心机上离心,收集上清液,转移到离心管中；土壤沉淀再加入DNA提取液和20％的SDS,通过摇床摇晃,在水浴加热设备中加热，在离心机上离心,收集上清液与上次的上清液合并；再进行一侧上述操作，收集到的上清液与前两次上清液合并；

S4、收集到的上清液与等体积的氯仿异戊醇混合液24:1混合，混合后经过离心机离心,吸取水相转移至另一个离心管中，以0.6倍体积的异丙醇作为添加液沉淀,经过离心机离心,收集核酸沉淀，用冷的70％乙醇洗涤沉淀，溶于TE溶液中；

S5、通过上述方法可以的提取处第二份土壤中的微生物。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：通过土壤取样装置取出同一处工业大麻植物根系处的土壤样品两份，将取出的一份土壤样品进行前处理，并分成等量的四份，将处理后的一份土壤样品放入蒸熏装置内进行蒸熏处理，通过蒸熏将土壤中微生物杀死，根据相应的计算公式，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解而放出CO2,根据释放出的CO2的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量，从而测定土壤中微生物的含量。

取第二份土壤样品，加入DNA提取液制取上清液，上清液与等体积的氯仿异戊醇混合液24:1混合，混合后经过离心机离心,吸取水相，以0.6倍体积的异丙醇作为添加液沉淀,经过离心机离心,收集核酸沉淀，用冷的70％乙醇洗涤沉淀，溶于TE溶液中，再用紫外分光光度法测定DNA溶液的光密度值，根据公式得出土壤微生物含量。

提取土壤微生物前先对土壤中的微生物含量进行检测，达标后在进行提取作业，避免了提取微生物不达标，提高提取的效率。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”“前端”、“后端”、

“两端”、“一端”、“另一端”等指示的方位或位置关系为基于方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

实施例1

本发明提供的一种实施例：一种工业大麻根系土壤检测用微生物提取方法，通过土壤取样装置取出同一处工业大麻植物根系处的土壤样品两份，两份工业大麻植物根系处的土壤样品分别用玻璃瓶盛装，两份土壤样品量一样，一份用作土壤微生物量测定，一份作土壤微生物提取，第一份土壤样品经过蒸熏处理测定后微生物量符合标准后，再通过第二份土壤样品进行微生物的提取。

实施例2

本发明提供的一种实施例：一种工业大麻根系土壤检测用微生物提取方法，土壤蒸熏前进行土壤前处理：

土壤疏松，清理残存草莓茎叶及根系，土面整平无大土块，土壤湿度适中；

熏蒸必须在密闭的环境条件下举行，要用透亮的聚乙烯薄膜覆盖，厚度为0.1毫米，宽度要比土壤样品宽，并准备宽胶带，用于修补薄膜上的破洞；

土壤用商品溴甲烷，加入2％的氯化苦作催泪剂，根据土壤类型和湿度可适当调剂；

上述准备工作做完后可对土壤样品进行熏蒸作业。

实施例3

本发明提供的一种实施例：一种工业大麻根系土壤检测用微生物提取方法，土壤微生物含量测定流程：

S1、将取出的一份土壤样品进行前处理，并分成等量的四份，将处理后的一份土壤样品放入蒸熏装置内进行蒸熏处理，通过蒸熏将土壤中微生物杀死；熏蒸开始的同时，另取剩下的三份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mIKSO4提取，KSO4水液比例为1:5，另作三个土壤样品；

S2、将蒸熏处理后的土壤无损地转移到150mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL的KSO4，KSO4水液比例为1:5，,将聚乙烯塑料瓶通过振荡机振荡30分钟，再用中速定量滤纸过滤在100mL塑料瓶中；

S3、吸取10mL上述土壤提取液于100mL消化管中，准确加入10mLH2SO4溶液，加入两个玻璃珠，混匀后置于150℃磷酸浴中煮沸10分钟，冷却后将溶液无损地转移至100mL三角瓶中，用去离子水洗涤消化管5次使溶液体积约为80mL，加入一滴邻菲罗啉指示剂，用硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色变为蓝色，再变为红棕色，即为滴定终点；

S4、根据相应的计算公式，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解而放出CO2,根据释放出的CO2的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。

实施例4

本发明提供的一种实施例：一种工业大麻根系土壤检测用微生物提取方法，土壤微生物提取方法：

S1、称取第二份土壤样品，与DNA提取液一起加入瓶中放置在225r/min摇床上摇动30分钟,温度设定在36℃；

S2、过了30分钟后，接着加入1.5mL20％SDS在65℃的水浴加热设备中加热2小时,每隔20分钟轻微晃动瓶子，晃动瓶子时注意不要烫到手；

S3、水浴加热后，将瓶子放置在6000r/min的离心机上离心10分钟,收集上清液,转移到50mL离心管中；土壤沉淀再加入4.5mLDNA提取液和0.5mL20％的SDS,通过摇床摇晃20秒,在65℃的水浴加热设备中加热10分钟，6000r/min的离心机上离心10分钟,收集上清液与上次的上清液合并；再进行一侧上述操作，收集到的上清液与前两次上清液合并；    

S4、收集到的上清液与等体积的氯仿异戊醇混合液24:1混合，混合后经过离心机离心,吸取水相转移至另一个50mL离心管中，以0.6倍体积的异丙醇作为添加液沉淀1小时,经过12000r/min离心30分钟,收集核酸沉淀，用冷的70％乙醇洗涤沉淀，溶于10mmol/L，pH8.0的TE溶液中；

S5、采用紫外分光光度法测定DNA溶液的光密度值，根据公式:[dsDNA]＝50xOD260x稀释倍数,计算DNA的浓度,换算出每克土壤中提取DNA的量，估算DNA的纯度，通过上述方法可以的提取处第二份土壤中的微生物。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。

摘自国家发明专利，发明人：郭丽，李泽宇，陈祥伟，王明泽，车野，张玲，姜泽宇，接思源，王迪，刘冰，马兰，申请号202010672328.3，申请日2020.07 .14