摘  要：本发明公开了一种利用BnXTH2基因提高植物抗寒能力的方法，所述方法具体为将BnXTH2基因在辣椒中异源表达。实验证明，通过将BnXTH2 基因在辣椒体内异源表达可明显提高辣椒抗寒能力。

 

技术要点

1.一种利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法，其特征在于，所述方法具体为将BnXTH2基因在辣椒中进行表达，其中，所述BnXTH2基因的完整的开放阅读框如SEQ ID NO:1所示，编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、BnXTH2基因过表达载体的构建；

1.1)提取植物整株的总RNA，反转录为cDNA；

1.2)以步骤1.1)得到的cDNA为模板，采用引物BnXTH2?F和BnXTH2?R进行PCR扩增，得到带酶切位点的BnXTH2的开放阅读框；

BnXTH2?F:CGGGATCCATGAGATCATCATCAAGTAGT；

BnXTH2?R:CGAGCTCCTAGTAGCCAGCGAGGCACT；

                     

1.3)将表达载体pBI 121和BnXTH2片段进行酶切，酶切体系如下：

37℃反应过夜，凝胶电泳胶回收目的PCR片段；

                      

1.4)采用T4连接酶将步骤1 .3)中得到的PCR片段与载体片段连接，具体体系如下：

16℃反应过夜，进行大肠杆菌转化；

1.5)质粒提取：

将步骤1 .4)中成功转化大肠杆菌采用质粒提取试剂盒进行质粒提取；

1.6)转化EHA105：

利用步骤1.5)提取得到的质粒进行农杆菌EHA105转化；

S2、对辣椒进行农杆菌侵染转化：

2.1)接种农杆菌至含30mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，摇菌至OD1 .0；

2.2)4℃离心收集菌体，加入1/2MS液体培养基重悬，使其OD＝0 .5，得到农杆菌重悬液；

2.3)将辣椒带柄子叶浸入农杆菌重悬液中20min后，20度下共培养2d转移至愈伤及分化培养基为：MS+0.6mg/L IAA+5.0mg/L 6?BA+300mg/LTim+100mg/L Kan，每2周更换一次培养基。

2.4)待长出丛生芽后移入芽伸长培养基为：

Ms+0.8mg/L IAA+2.0mg/L6?BA+2.0mg/LGA3 300mg/LTim+300mg/L Kan

2.5)后移入生根培养基1/2MS+0.5mg/LIAA，生根待根长为1cm左右后移入营养土中正常培养收获辣椒种子。

3.根据权利要求2所述的利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法，其特征在于，还包括转BnXTH2基因辣椒抗寒冻能力鉴别；其中，将野生型与转BnXTH2基因T3代辣椒种子浸种催芽后播种于营养土中，15℃正常条件下培养到2?3片叶的幼苗期，将幼苗分别在(5±l)℃ ,(10±l)℃ ,(15±l)℃(对照)下处理,第5d和第10d分别取样测定抗坏血酸及MDA含量；

不同低温处理后第5d测定幼苗的MDA含量低温处理第5d ,转基因株系在(5±1)℃MDA的含量比非转基因株系低28.72％；转基因株系在(5±1)℃抗坏血酸含量的含量比非转基因株系高58.72％。

 

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法。

 

背景技术

辣椒(Capsicum anmuum L .)是一种重要的喜温性蔬菜,在北方保护地种植面积较大,但由于冬季温度低,光照弱,影响了北方地区辣椒的生产。苗期越冬易受突然寒流低温(0℃以下)霜冻或早春阴雨低温(0℃以上)的冷害,严重影响辣椒的生长、早期产量和商品性。急需一种增强辣椒抗寒冬的一种技术。

近期的研究发现XTH5/7过表达(oxXTH5、ox XTH7)转基因植物在低温处理下植株存活率实验发现，过表达XTH基因能够促进辣椒细胞壁中半纤维素的积累从而增强植株抗冻性。番茄XTH3基因也发现与植物抗寒性相关。

利用BnXTH2基因增强辣椒抗寒能力，可以有效解决辣椒抗寒的问题。

 

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法，经过实验表明，利用苎麻BnXTH2基因可以有效提高辣椒的抗寒能力。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用苎麻BnXTH2基因提高辣椒抗寒能力的方法，所述方法具体为将苎麻BnXTH2基因在辣椒中过表达。

进一步地，所述方法包括如下步骤：

S1、BnXTH2基因过表达载体的构建；

1.1)提取整株的总RNA并反转录为cDNA；

1.2)以步骤1.1)得到的cDNA为模板，采用引物BnXTH2?F和BnXTH2?R进行PCR扩增，得到带酶切位点的BnXTH2的开放阅读框；

 BnXTH2?F:CGGGATCCATGAGATCATCATCAAGTAGT；

 BnXTH2?R:CGAGCTCCTAGTAGCCAGCGAGGCACT；

 1.3)将表达载体pBI 121和BnXTH2片段进行酶切，酶切体系如下：

                         

37℃反应过夜，凝胶电泳胶回收目的PCR片段；

1.4)采用T4连接酶将步骤1.3)中得到的PCR片段与载体片段连接，具体体系如下：

 

16℃反应过夜，进行大肠杆菌转化；

1.5)质粒提取：

将步骤1.4)中成功转化大肠杆菌采用质粒提取试剂盒进行质粒提取；

1.6)转化EHA105：

利用步骤1.5)提取得到的质粒进行农杆菌EHA105转化；

S2、对辣椒进行农杆菌侵染转化及组织培养：

2.1)接种农杆菌至含Rif+Kan的YEP液体培养基中，摇菌至OD＝1.5；

2.2)4℃离心后加入含0.3％AS的1/2MS液体培养基重悬，使其OD＝0.5；

2.3)将辣椒带子叶胚轴下胚轴进行农杆菌浸染后共培养2d后，转移至MS+6?BA3mg/L+NAA 0.8mg/L+Tim 300mg/L+Kan100mg/L愈伤培养基上，每14d更换培养基直至长出丛生芽；

2.4)将丛生芽转移至生根培养基1/2MS+IBA 0.7mg/L+Tim 300mg/L+Kan100mg/L， 直至长出1cm左右根系，移入营养钵中正常养护，收获种子，待收获种子低温烘干，4℃保存。  S3、转BnXTH2基因辣椒抗寒冻能力鉴别

将野生型与转BnXTH2基因T3代辣椒种子浸种催芽后播种于营养土中，15℃正常条件下培养到2?3片叶的幼苗期，将幼苗分别在(5±l)℃ ,(10±l)℃ ,(15±l)℃(对照)下处理,第5d和第10d分别取样测定抗坏血酸及MDA含量。具体地说，不同低温处理后第5d测定幼苗的MDA含量低温处理第5d ,转基因株系在(5±1)℃MDA的含量比非转基因株系低28.72％；转基因株系在(5±1) ℃抗坏血酸含量的含量比非转基因株系高58.72％ ，因此可以判定

BnXTH2基因在辣椒体内表达可明显提高辣椒抗寒能力。

本发明的有益效果在于：实验证明，通过将BnXTH2基因在辣椒体内过表达可明显提高辣椒抗寒能力。

 

具体实施方式

以下对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提， 给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。

实施例1

一、总RNA的提取及第一链cDNA的合成

采用RNA提取试剂盒提取辣椒总RNA；然后取5μL总RNA，

根据转录组测序BnXTH2基因片段克隆BnXTH2完整的ORF(序列为SEQ ID NO:1) ，推导出编码氨基酸序列(序列为SEQ ID NO:2)。

二、序列分析

经分析发现BnXTH2 cDNA长开放阅读框大小为870bp，预测编码289个氨基酸。发现BnXTH2蛋白具有典型的GH16_XET和Glyco_hydro_16结构域，属于XET_C超家族、LamG超家族与SKN1超家族。

实施例2

本实施例提供了一种BnXTH2的转基因试验方法，具体来说是将BnXTH2基因转导到辣椒中，观察转基因辣椒在低温下的表型变化。

1、BnXTH2基因过表达载体的构建

S1、BnXTH2基因过表达载体的构建；

1.1)提取整株的总RNA并反转录为cDNA；

1.2)以步骤1.1)得到的cDNA为模板，采用引物BnXTH2?F和BnXTH2?R进行PCR扩增，得到带酶切位点的BnXTH2的开放阅读框；

BnXTH2?F:CGGGATCCATGAGATCATCATCAAGTAGT；

BnXTH2?R:CGAGCTCCTAGTAGCCAGCGAGGCACT；

1.3)将表达载体pBI 121和BnXTH2片段进行酶切，酶切体系如下：

                         

37℃反应过夜，凝胶电泳胶回收目的PCR片段；

1.4)采用T4连接酶将步骤1.3)中得到的PCR片段与载体片段连接，具体体系如下：

PCR片段1μL

pBI 121 4μL

5×T4 DNA Ligase Buffer 2μL

T4 DNA Ligase 1μL

ddH2O 2μL

16℃反应过夜，进行大肠杆菌转化；

1.5)质粒提取：

将步骤1.4)中成功转化大肠杆菌采用质粒提取试剂盒进行质粒提取；

1.6)转化EHA105：

利用步骤1.5)提取得到的质粒进行农杆菌EHA105转化；

S2、对辣椒进行农杆菌侵染转化及组织培养：

2.1)接种农杆菌至含Rif+Kan的YEP液体培养基中，摇菌至OD＝1.5；

2.2)4℃离心后加入含0.3％AS的1/2MS液体培养基重悬，使其OD＝0 .5；

2.3) 将辣椒带子叶胚轴下胚轴进行农杆菌浸染后共培养2d后，转移至MS+6?BA 3mg/L+NAA 0.8mg/L+Tim 300mg/L+Kan100mg/L愈伤培养基上，每14d更换培养基直至长出丛生芽；

2.4)将丛生芽转移至生根培养基1/2MS+IBA 0.7mg/L+Tim 300mg/L+Kan100mg/L，直至长出1cm左右根系，移入营养钵中正常养护，收获种子，待收获种子低温烘干，4℃保存。 

2.5)转BnXTH2基因T3代辣椒抗寒的鉴定

将野生型与转BnXTH2基因T3代辣椒种子浸种催芽后播种于营养土中，15℃正常条件下培养到2?3片叶的幼苗期，将幼苗分别在(5±l)℃ ,(10±l)℃ ,(15±l)℃(对照)下处理,第5d和第10d分别取样测定抗坏血酸及MDA含量。

结果如表1所示，不同低温处理后第5d测定幼苗的MDA含量低温处理第5d ,转基因株系在(5±1)℃MDA的含量比非转基因株系低28.72％。转基因株系在(5±1)℃抗坏血酸含量的含量比非转基因株系高58.72％。结果如下表所示，表明转基因植株提高了抗寒性。

表1 BnXTH2基因辣椒与非转基因辣椒生理生化指标

 

对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。