摘 要：本发明公开了一种合成大麻素的检测系统及其应用。所述检测系统包括检测合成大麻素的探针和免疫层析试纸条，所述探针为胶体金溶液或荧光微球溶液与识别合成大麻素的单克隆抗体共反应得到的检测探针，所述免疫层析试纸条检测线上喷涂有合成大麻素包被抗原，质控线上喷涂有二抗。本发明采用胶体金的比色免疫层析试纸条和基于荧光微球的荧光免疫层析试纸用于吲唑酰胺类合成大麻素的现场检测，装配简单，使用方便，能够快捷高效完成对吲唑酰胺类合成大麻素的定性和定量检测；极大地节约了检测时间和检测成本，并且对吲唑酰胺类合成大麻素具有普遍适用性。
技术要点
1.一种合成大麻素的检测系统，其特征在于，所述检测系统包括检测合成大麻素的探针和免疫层析试纸条，所述探针为胶体金溶液或荧光微球溶液与识别合成大麻素的单克隆抗体共孵育得到的检测探针，所述免疫层析试纸条检测线上喷涂有合成大麻素包被抗原，质控线上喷涂有二抗。
2.根据权利要求1所述合成大麻素的检测系统，其特征在于，所述合成大麻素为ADB?BUTINACA(N?(1?氨甲酰基?2,2?二甲基丙基)?1?丁基吲唑?3?甲酰胺)、ADB?4en?PINACA(N?(1?氨基?3,3?二甲基?1?氧代丁烷?2?基)?1?(4?戊烯?1?基)?1H?吲唑?3?甲酰胺)或4CNCUMYL?BUTINACA(1?(4?氰基丁基)?N?(1?甲基?1?苯乙基)?1H?吲唑?3?甲酰胺)中任意一种。
3.根据权利要求1所述合成大麻素的检测系统，其特征在于，所述胶体金溶液浓度为50?100μg/mL，所述荧光微球溶液浓度为1?10mg/mL，所述探针浓度为1?5mg/mL。
4.根据权利要求1所述合成大麻素的检测系统，其特征在于，所述识别合成大麻素的单克隆抗体序列如SEQ ID NO.1所示，所述单克隆抗体浓度为1?3mg/mL，孵育时间为4?6h。
5.根据权利要求1所述合成大麻素的检测系统，其特征在于，所述免疫层析试纸条的结构为：包括样品垫(1)、硝酸纤维素膜(2)、吸收垫(5)、聚氯乙烯平板(6)，所述硝酸纤维素膜(2)的表面设置一条检测线(3)以及一条质控线(4)。
6.根据权利要求1所述合成大麻素的检测系统，其特征在于，所述合成大麻素包被抗原的浓度为0.8?1mg/mL，包被量为1?2μL/cm；所述二抗浓度为0.8?1.2mg/mL，包被量为1?2μL/cm。
7.一种权利要求1所述合成大麻素的检测系统在检测合成大麻素中的应用。
8.一种权利要求1所述合成大麻素的检测系统在检测吲哚酰胺类合成大麻素中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述检测探针加入待测样品中，混合均匀后，静置，得到目标物与检测探针形成的免疫复合物；
(2)将步骤(1)得到的免疫复合物滴加于试纸条的样品垫，样品液在毛细管力的作用下往吸收垫移动，未与目标物结合的检测探针与检测线上的包被抗原进行特异性抗原抗体识别，将胶体金/荧光微球聚集于检测线，多余探针聚集于质控线；用Color Picker软件分析比色试纸T线RGB值，用ImageJ软件分析荧光试纸T线灰度值，分别与其对应的标准曲线对比，实现对待测样品中吲唑酰胺类合成大麻素浓度的定量判断。
10.根据权利要去9所述应用，其特征在于，所述步骤(1)待测样品浓度大于等于5ng/mL，静置时间为5?20min。
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种合成大麻素的检测系统及其和应用。
背景技术
合成大麻素(synthetic cannabinoids,SCs)是一类人工合成的大麻素受体激动剂，现已成为规模最大、结构最多样化的一类新精神活性物质。SCs对人体具有较强的致幻作用，同时伴随着精神错乱、心脏毒性、癫痫等副作用，严重威胁着人类的身体健康、经济发展和社会稳定。目前，合成大麻素的检测方法主要包括高效液相色谱?质谱、气相色谱?质谱、表面增强拉曼光谱、电化学方法等，多采用大型器设备对合成大麻进行检测，这些检测技术大多依赖于实验室环境，过程繁琐耗时，使其现场分析应用受到严重限制，耗时费力，且需要复杂的前处理过程以及专业人员操作，不利于民警的现场勘查工作。因此，开发一种快速、准确、灵敏度令人满意的SCs现场检测方法，作为毒品犯罪的高效取证工具，对公安工作具有重要意义。
侧流免疫层析技术(LFIA)是一种将色谱层析技术与免疫分析技术相结合的快速分析方法，具有稳定性高、快速、便携、简单和用户友好等优点，已广泛用于目标分析物的定性及半定量检测，是目前最常用的即时检测(POCT)平台。胶体金是一种带负电的球形纳米颗粒，合成简单且性质稳定，可通过非共价作用与抗体偶联。在免疫层析过程中，聚集在T、C 线上产生鲜艳的红色，形成裸眼可见的比色信号。目前，基于胶体金的LFIA已成功应用于疾病诊断、环境监测和食品质量检测等多个领域。
荧光微球是一类特殊的功能化微球，是指标记有荧光物质，在一定的激发下能产生荧光的聚合物，粒径通常在纳米至微米级。目前已开发了负载有不同荧光物质的荧光聚合物，如掺杂稀土元素、有机染料、量子点等的聚合物微球。由于荧光微球具有稳定的形态结构、良好的单分散性和高效的发光效率，现已广泛应用于免疫层析技术。。
发明内容
发明目的：为了解决上述技术问题，本发明旨在提供一种合成大麻素的检测系统，该检测系统能够快捷高效完成对吲唑酰胺类合成大麻素的定性和定量检测。
本发明还提供了一种合成大麻素检测系统的制备方法和应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明提供一种合成大麻素的检测系统，所述检测系统包括检测合成大麻素的探针和免疫层析试纸条，所述探针为胶体金溶液或荧光微球溶液与识别合成大麻素的单克隆抗体共孵育得到的检测探针，所述免疫层析试纸条上检测线上喷涂有合成大麻素包被抗原，质控线上喷涂有二抗。
进一步地，所述合成大麻素为ADB?BUTINACA(N?(1?氨甲酰基?2,2?二甲基丙基)?1?丁基吲唑?3?甲酰胺)、ADB?4en?PINACA(N?(1?氨基?3,3?二甲基?1?氧代丁烷?2?基)?1?(4?戊烯?1?基)?1H?吲唑?3?甲酰胺)或4CN?CUMYL?BUTINACA(1?(4?氰基丁基)?N?(1?甲基?1?苯乙基)?1H?吲唑?3?甲酰胺)中任意一种。
进一步地，所述胶体金溶液浓度为50?100μg/mL，所述荧光微球溶液浓度为1?10mg/mL，所述探针浓度为1?5mg/mL。
进一步地，所述识别合成大麻素的单克隆抗体序列如SEQ ID NO.1所示，所述单克隆抗体浓度为1?3mg/mL，孵育时间为4?6h。
进一步地，所述免疫层析试纸条的结构为：包括样品垫(1)、硝酸纤维素膜(2)、吸收垫(5)、聚氯乙烯平板(6)，所述硝酸纤维素膜(2)的表面设置一条检测线(3)以及一条质控线(4)。
作为优选，所述免疫层析试纸条的结构为：将硝酸纤维素膜(2)黏贴到聚氯乙烯平板(6)背衬底板上，聚氯乙烯平板(6)背衬底板的两侧设置有样品垫(1)和吸收垫(5)，样品垫(1)和吸收垫(5)分别与硝酸纤维素膜(2)重叠2?4mm，所述硝酸纤维素膜(2)的表面设置一条检测线(3)以及一条质控线(4)。
进一步地，所述合成大麻素包被抗原的浓度为0.8?1mg/mL，包被量为1?2μL/cm；所述二抗浓度为0.8?1.2mg/mL，包被量为1?2μL/cm。
本发明所述合成大麻素的检测系统在检测合成大麻素中的应用。
本发明所述合成大麻素的检测系统在检测吲哚酰胺类合成大麻素中的应用。
进一步地，所述检测吲哚酰胺类合成大麻素中的应用，包括如下步骤：
(1)将所述检测探针加入待测样品中，混合均匀后，静置，得到目标物与检测探针形成的免疫复合物；
（2)将步骤(1)得到的免疫复合物滴加于试纸条的样品垫，样品液在毛细管力的作用下往吸收垫移动，未与目标物结合的检测探针与检测线上的包被抗原进行特异性抗原抗体识别，将胶体金/荧光微球聚集于检测线，多余探针聚集于质控线；用Color Picker软件分析比色试纸T线RGB值，用ImageJ软件分析荧光试纸T线灰度值，分别与其对应的标准曲线对比，实现对待测样品中吲唑酰胺类合成大麻素浓度的定量判断。
进一步地，所述步骤(1)待测样品浓度大于等于5ng/mL，静置时间为5?20min。
作为优选，所述免疫层析试纸条制备方法，包括如下步骤：
(1)将吸水纸剪裁为宽20?30mm吸收垫；
(2)将吲唑酰胺类合成大麻素包被抗原配制成喷涂液，喷涂在硝酸纤维素膜上形成检测线；
(3)将二抗配成喷涂液，喷涂于硝酸纤维素膜上形成质控线；
(4)将聚酯膜剪裁为宽20?30mm，并用含3～5％的蔗糖、0.05～2％的曲拉通?100、0.05?0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、磷酸缓冲盐溶液浸泡2?4h，在35?42℃烘1?3h，得到样品垫；
(5)将硝酸纤维素膜黏贴到聚氯乙烯背衬底板上，再从聚氯乙烯背衬底板的一侧向另一侧依次黏贴样品垫和吸收垫，样品垫和吸收垫分别与硝酸纤维素膜重叠2?4mm。
本发明提供了比色和荧光两种免疫层析试纸条用于合成大麻素的现场检测，本发明采用样品垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、聚氯乙烯背衬底板共同组成了免疫层析试纸条，且样品垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘贴在聚氯乙烯背衬底板上，相邻处重叠，硝酸纤维素膜分别设置了一条检测线和一条质控线，检测线上喷涂牛血清白蛋白包被的吲唑酰胺类合成大麻素抗原，质控线上喷涂二抗。在检测过程中，待测样本与检测探针共孵育，目标物与检测探针结合，形成免疫复合物，检测探针上识别位点减少，使检测探针与检测线上包被抗原的结合减少，聚集在检测线的胶体金/荧光微球少，导致检测线产生的比色/荧光信号弱，多余的探针与质控线上的二抗结合，将胶体金/荧光微球聚集于质控线而显色/荧光。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
(1)本发明首次提供了比色和荧光两种免疫层析试纸条试同时用于对吲唑酰胺类合成大麻素的现场快速检测，装配简单，使用方便，能够快捷高效完成对吲唑酰胺类合成大麻素的定性和定量检测；极大地节约了检测时间和检测成本，并且对吲唑酰胺类合成大麻素具有普遍适用性；
(2)本发明基于胶体金的比色试纸可以裸眼读出检测结果，比色试纸检测限为 20ng/mL，而基于荧光微球的荧光试纸在配套便携式紫外手电使用时，能够在比色试纸的基础上，进一步提高检测灵敏度，更有利于民警对是否吸毒进行准确判断，本发明荧光试纸最低可检测到的吲唑酰胺类合成大麻素浓度为5ng/ml，在15min内即可完成全部检测。
(3)本发明对合成大麻素的检测灵敏度高、使用方便，且过程简便快捷，结果可靠。
附图说明
图1为本发明的侧流层析试纸条的示意图，其中1为样品垫、2为硝酸纤维素膜、3为检测线、4为质控线、5为吸收垫、6为聚氯乙烯平板；
图1
图2为本发明的AuNPs的透射电镜图；
图2
图3为本发明的荧光微球的透射电镜图；
图3
图4为AuNPs的紫外可见吸收光谱图；
图4
图5为荧光微球的荧光光谱图及紫外手电照射下的图片；
图5
图6为基于AuNPs的比色免疫层析试纸条检测吲唑酰胺类合成大麻素ADB?BUTINACA的显色检测结果，可视化检测结果为20ng/mL；
图6
图7基于荧光微球的荧光免疫层析试纸条检测吲唑酰胺类合成大麻素ADB?BUTINACA的显色检测结果，可视化检测结果为5ng/mL；
图7
图8为基于AuNPs检测的标准曲线图；
图8
图9为基于荧光微球检测的标准曲线图；
图9
图10为TRF?LFIA中(A)T线ADB?BSA喷涂浓度、(B)探针加入体积、(C)样本加入体积的优化；CM?LFIA中(D)T线ADB?BSA喷涂浓度、(E)探针加入体积、(F)样本加入体积的优化。
图10
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
本发明中技术术语的缩写如下：
LFIA：侧流免疫层析技术；
AuNPs：金纳米颗粒；
ADB?BUTINACA：N?(1?氨甲酰基?2,2?二甲基丙基)?1?丁基吲唑?3?甲酰胺；
SCs：合成大麻素；
POCT：即时检测；
4CN?CUMYL?BUTINACA：1?(4?氰基丁基)?N?(1?甲基?1?苯乙基)?1H?吲唑?3?甲酰胺)；
1?(3?二甲基氨基丙基)?3?乙基碳二亚胺/N?羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲液：分别称取10mg 1?(3?二甲基氨基丙基)?3?乙基碳二亚胺和10mg N?羟基琥珀酰亚胺溶于1mL 磷酸盐缓冲液中；
吸水纸：厂家BLS，货号XSZ301244；聚酯膜：厂家：BLS，货号：6613；硝酸纤维素膜：厂家：sartorius，货号：CN95；聚氯乙烯平板：厂家：BLS，货号DB630；
二抗(AffiniPureTM Mouse Anti?Goat IgG(H+L))：厂家Jackson ImmunoResearch，货号205?005?018；
样品ADB?BUTINACA(N?(1?氨甲酰基?2,2?二甲基丙基)?1?丁基吲唑?3?甲酰胺)、 ADB?4en?PINACA(N?(1?氨基?3,3?二甲基?1?氧代丁烷?2?基)?1?(4?戊烯?1?基)?1H?吲唑?3?甲酰胺)和4CN?CUMYL?BUTINACA(1?(4?氰基丁基)?N?(1?甲基?1?苯乙基)?1H?吲唑?3?甲酰胺)已于[1]刘生凤,张岚,刘书丞,等.4种酰胺类合成大麻素在人肝微粒体中Ⅰ相代谢规律研究[J].中国药科大学学报,2022,53(05):577?590.[2]接昭玮,张文芳,王继芬,等.新型合成大麻素ADB?BUTINACA在不同时间段斑马鱼体内的代谢组学分析[J].分析测试学报,2023,42(05):568?576.公开报道，本发明实验样品均取自国家毒品实验室，且在公安局备案；
抗ADB?BUTINACA的单克隆抗体：由国家禁毒委员会办公室中国药科大学禁毒关键技术联合实验室提供，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：ENVLTQSPAIISASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQRSSTSPKLWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSMEAEDVATYYCFQGSGYPLTFGSGTKLEIKQVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYSFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGDGSTKYNEKFKGKTTLTAD KSSSTAYMLLSSLTSEDSAIYFCVGYYRYDRYHFDYWGQGTTLTVSS，由生物公司直接合成；
吲唑酰胺类合成大麻素ADB?BUTINACA包被抗原(制备方法参考中国专利CN118063385A，包被抗原BSA?H08)，浓度为0.8mg/mL。
实施例1
(1)AuNPs的制备：
在磁力搅拌下，加热100mL 0.3mM的氯金酸溶液至100℃，向其加入4mL柠檬酸钠(1％)还原溶液。反应体系颜色在1?2min内变成酒红色，待颜色稳定，继续反应10min，即得 AuNPs溶液，浓度为50μg/mL，用铝箔覆盖于反应瓶口并冷却至室温，置于4℃备用。如图2所示，为AuNPs的透射电镜图，表明合成的AuNPs为均匀分散的球形颗粒，无明显的聚集现象，颗粒粒径为18?20nm；如图4所示，为AuNPs的紫外可见吸收光谱图，其表面等离子共振吸收峰为521nm。
(2)AuNPs标记的检测探针：
取抗ADB?BUTINACA的单克隆抗体1mg加入1mL磷酸缓冲盐溶液配成浓度为1mg/mL 的抗ADB?BUTINACA的单克隆抗体溶液，备用。
制备AuNPs标记的识别ADB?BUTINACA的检测探针(即胶体金标记检测探针)：取50μ g/mL步骤(1)制备的AuNPs溶液1mL，用0.1M的碳酸钾调节pH至8，加入10μL含有10μg抗ADBBUTINACA的单克隆抗体的磷酸缓冲盐溶液共孵育1h，然后在室温下旋转混匀1h，再加入100μL，10％的牛血清白蛋白溶液封闭未反应的位点，离心13000rpm，10min，将所得到的1mg沉淀物重新分散于含10％蔗糖和1％血清白蛋白的1mL磷酸缓冲盐溶液，得到AuNPs标记的检测探针，浓度为1mg/mL，于4℃保存备用。
(3)免疫层析试纸条的制备：
LFIA试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸收垫三个部分。将吸水纸剪裁为宽20mm 吸收垫，吸收垫不需进一步处理，将聚酯膜剪裁为宽20mm，并经含3％蔗糖、0.05％曲拉通100、0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(pH 8.0)、磷酸缓冲盐溶液(pH 7.4)浸泡2h，然后于37℃下烘干1h，即为样品垫；如图1所示，将硝酸纤维素膜2黏贴到聚氯乙烯平板6背衬底板中间位置，聚氯乙烯平板6背衬底板的两端一端设置有样品垫1，另一端设置有吸收垫 5，样品垫1和吸收垫5各自的一端黏贴在聚氯乙烯平板6背衬底板上，另一端黏贴在硝酸纤维素膜上，分别与硝酸纤维素膜2重叠2mm，硝酸纤维素膜2的表面还设置一条检测线3以及一条质控线4，其中检测线3靠近样品垫1设置，质控线4靠近吸收垫5设置。将吲唑酰胺类合成大麻素ADB?BUTINACA包被抗原配置成0.8mg/mL喷涂液，以1μL/cm的包被量喷涂到硝酸纤维素膜上形成检测线3，将二抗配成浓度为1.0mg/mL的喷涂液，以1μL/cm的包被量喷涂到硝酸纤维素膜上形成质控线4，与检测线3的距离为4mm，与硝酸纤维素膜2末端的距离为6mm。
(4)免疫层析试纸条的检测方法：取60μL待测样品(ADB?BUTINACA，浓度为0～ 1000ng/mL)，加入步骤(2)制得的检测探针12μL，混匀，静置10min，再将混合溶液滴加到步骤(3)制备的试纸条的样品垫上，样品液在毛细管力的作用下往硝酸纤维素膜迁移，未与目标物结合的检测探针与检测线上的包被抗原进行特异性抗原抗体识别，将胶体金聚集于检测线，多余探针聚集于质控线；10min后，用Color Picker软件测定比色试纸检测线(T线)的 RGB值，与标准曲线对比，进行待测样品中目标物浓度的定量分析。如图6所示，为基于胶体金的比色免疫层析试纸条检测吲唑酰胺类合成大麻素ADB?BUTINACA的显色结果，对于浓度大于等于20ng/mL的样品，检测后试纸条检测线显色与阴性有明显差异，检测限为20ng/mL；对于浓度小于20ng/mL的样品，检测后试纸条检测线显色与阴性无明显差异。如图8所示，为基于胶体金的比色免疫层析试纸条检测吲唑酰胺类合成大麻素ADB?BUTINACA的标准曲线图，表明该检测平台检测ADB?BUTINACA具有良好的线性，线性范围为1?1000ng/mL，R2＝0.9932。
实施例2
(1)荧光微球标记的检测探针：
取抗ADB?BUTINACA的单克隆抗体(同实施例1)1mg加入1mL磷酸缓冲盐溶液配成浓度为1mg/mL的抗ADB?BUTINACA的单克隆抗体溶液，备用。
制备荧光微球标记的识别ADB?BUTINACA的检测探针：
S1、制备荧光微球：取1mL苯乙烯单体(上海麦克林生化科技股份有限公司，货号：S817904，CAS号：100?42?5)，11mL 3％过硫酸钾水溶液，16mL无水乙醇在1200rpm搅拌下混合均匀，并加入1mL稀土配合物(上海麦克林生化科技股份有限公司，货号：E808866，CAS号：1308?96?9)。在N2保护下，加热到75℃，反应8h，即得荧光微球颗粒。
S2、将S1制备的荧光微球配置为浓度为10mg/mL溶液，(取100μL荧光微球用磷酸盐缓冲液稀释得10mg/mL)，如图3所示，为荧光微球的透射电镜图，表明荧光微球为均匀分散的球形颗粒，无明显的聚集现象，颗粒粒径为200?210nm。如图5所示，为荧光微球的荧光光谱图，在365nm的激发下，于615nm处有明显的发射峰，并且在紫外手电照射下呈现出明显红色荧光。取10mg/mL的荧光微球溶液40μL，加入960μL含1?(3?二甲基氨基丙基)?3?乙基碳二亚胺/N?羟基琥珀酰亚胺(浓度为10mg/mL)的磷酸盐缓冲液，避光反应2h，再滴加40μL含有 20μg抗ADB?BUTINACA的单克隆抗体的磷酸缓冲盐溶液共孵育，在室温下将混合溶液避光搅拌4h，再加入100μL，10％的牛血清白蛋白溶液封闭未反应的位点，离心13000rpm，10min，即得荧光微球标记的检测探针，浓度为1mg/mL。将所得到的1mg沉淀物用含10％蔗糖和1％血清白蛋白的1mL磷酸缓冲盐溶液中，4℃保存备用，即得荧光微球标记的检测探针，浓度为1mg/mL。
(2)免疫层析试纸条的制备：
LFIA试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸收垫三个部分。将吸水纸剪裁为宽22mm 吸收垫，吸收垫不需进一步处理，将聚酯膜剪裁为宽25mm样品垫，并经4％蔗糖、0.08％曲拉通?100、0.08mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(pH 8.0)、磷酸缓冲盐溶液浸泡2.5h，然后于37℃下烘干2h，即为样品垫；如图1所示，将硝酸纤维素膜2黏贴到聚氯乙烯平板6背衬底板中间位置，聚氯乙烯平板6背衬底板的两端一端设置有样品垫1，另一端设置有吸收垫5，样品垫1和吸收垫5各自的一端黏贴在聚氯乙烯平板6背衬底板上，另一端黏贴在硝酸纤维素膜上，分别与硝酸纤维素膜2重叠2mm，硝酸纤维素膜2的表面还设置一条检测线3以及一条质控线4，其中检测线3靠近样品垫1设置，质控线4靠近吸收垫5设置。待检测物吲唑酰胺类合成大麻素ADB?BUTINACA包被抗原配置成1.0mg/mL喷涂液，以1μL/cm的包被量喷涂到硝酸纤维素膜上形成检测线，将二抗配成浓度为1.0mg/mL的喷涂液，以1μL/cm的包被量喷涂到硝酸纤维素膜上形成质控线。
(3)免疫层析试纸条的检测方法：取70μL待测样品(ADB?BUTINACA，0?500ng/mL)，加入步骤(1)制得的检测探针12μL，混匀，静置10min，再将混合溶液滴加到试纸条的样品垫上，样品液在毛细管力的作用下往硝酸纤维素膜迁移，一段时间后，在紫外手电照射下，用智能手机对检测结果图拍照，经ImageJ软件分析检测线的灰度值，与标准曲线对比，进行待测样品中目标物浓度的定量分析。如图7所示，为基于荧光微球的荧光免疫层析试纸条检测吲唑酰胺类合成大麻素ADB?BUTINACA的显色结果，对于浓度大于等于5ng/mL的样品，检测后试纸条检测线荧光与阴性有明显差异，检测限为5ng/mL；对于浓度小于5ng/mL的样品，检测后试纸条检测线荧光与阴性无明显差异。相较于胶体金的比色信号，灵敏度提高了4倍。如图9所示，为基于荧光微球的荧光免疫层析试纸条检测吲唑酰胺类合成大麻素ADBBUTINACA的标准曲线图，表明该检测平台检测ADB?BUTINACA具有良好的线性，线性范围为0.5?20ng/mL，R2＝0.9721。
实施例3
将实施例1制备的比色免疫层析试纸条(CM?LFIA)、实施例2制备的荧光免疫层析试纸条(TRF?LFIA)在检测平台进行检测对比，如表1所示，采用实施例1或实施例2中步骤 (3)试纸条检测方法检测，检测人工尿液中的吲唑酰胺类合成大麻素ADB?BUTINACA含量的结果，回收率分别为92.26?109.6％、93.6?109.1％，相对标准偏差分别为3.01?6.3％、2.01?3.15％，表明比色、荧光两种方法用于检测人工尿液中的吲唑酰胺类合成大麻素ADB?BUTINACA的准确性高，检测结果可靠。
基于胶体金的比色信号免疫层析试纸条用于合成大麻素的现场检测，能裸眼读出比色检测信号，实现对目标物的快速定性；而基于荧光微球的荧光信号免疫层析试纸能进一步提高胶体金检测的灵敏度，实现对目标物的准确定量，两种试纸极大地满足了合成大麻素的不同检测需求。两者结合使用，既能满足一线民警对毒品快筛的定性检测需求，同时也能实现毒品的现场半定量检测，为犯罪人员的定罪提供一定参考。
表1 两种层析试纸检测人工尿液中的目标物含量的结果表
实施例4
为获得最佳的检测性能，系统地优化了几个对免疫层析试纸条至关重要的参数，按照实施例1和2的方法，仅改变需要优化的参数，其他条件保持不变，优化参数有：1.改变T 线上ADB?BSA的喷涂浓度，以探究T线上抗原浓度的影响；2.改变检测探针的加入体积，以探究不同量的探针对检测结果的影响；3.改变待测样本的加入量，以探究样本溶液体积对层析试纸条的影响。通过以上参数的优化，最后得出最佳检测条件。分别以ADB?BUTINACA标准溶液的浓度为50ng/mL或100ng/mL作为TRF?LFIA和CM?LFIA的阳性组，以PBS作为阴性对照，以阳性组(T)与阴性组(T0)的T线信号差值作为判断标准，对两种试纸的检测参数进行优化。
首先，对T线上包被抗原的喷涂浓度进行优化，若喷涂浓度过小，无法捕获到纳米探针，从而无条带显色；若浓度过大，灵敏度会降低。改变TRF?LFIA的T线抗原浓度分别为 0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL，改变CM?LFIA的T线抗原浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.0mg/mL。结果如图10A、D所示，TRF?LFIA在T线上抗原浓度为1.0mg/mL时T0?T最大，CM?LFIA在T线为 0.8mg/mL时T?T0最大。因此分别选择1.0mg/mL、0.8mg/mL作为TRF?LFIA、CM?LFIA最佳的T线包被抗原浓度。其次，分别将6、8、10、12和14μL的Eu?CM?Ab(荧光微球标记的检测探针)/ AuNPs?Ab(AuNPs标记的检测探针)与待测样本共孵育。随着Eu?CM?Ab用量增加，T0?T值在14 μL时达到最大，但与12μL差异并不明显，考虑到成本原因，选择体积为12μL的探针进行后续实验(图10B)；随着Au NPs?Ab用量增加，T?T0同样在12μL时达到最大(图10E)；最后，优化待测样本的加入量对检测结果的影响，TRF?LFIA在加入的样本体积为70μL时T0?T最大(图 10C)，CM?LFIA在加入的样本体积为60μL时T?T0最大(图10F)。因此，分别选择70μL、60μL作为TRF?LFIA、CM?LFIA的样本体积。表1总结了TRF?LFIA、CM?LFIA的三个最佳检测参数的检测结果，T线(检测线)上包被抗原的喷涂浓度分别为1.0mg/mL和0.8mg/mL、Eu?CM?Ab/ AuNPs?Ab探针的体积均为12μL以及样本的体积分别为70μL和60μL。如图10所示，TRF?LFIA 中(A)T线ADB?BSA喷涂浓度、(B)探针加入体积、(C)样本加入体积的优化；CM?LFIA中(D)T线ADB?BSA喷涂浓度、(E)探针加入体积、(F)样本加入体积的优化。
文章摘自国家发明专利，一种合成大麻素的检测系统及其应用，发明人：鞠艳敏，戴建君，曾思琪，狄斌，李伟，申请号：202411149453.0，申请日：2024.08.21
