摘 要：本发明公开了小分子化合物在提高大麻中大麻二酚的含量中的应用。本发明通过实验验证了RPS?1在较低浓度下即可提高工业大麻中CBD 的含量，在实际生产应用中，可降低CBD的生产成本。RPS?1外源喷施，施用灵活，采用本发明的方法无需改变大麻品种和遗传背景，能够适用于所有品种的大麻。
技术要点
1.选自(1)～(3)任意一项的小分子化合物在提高大麻中大麻二酚的含量中的应用；
(1)式(I)化合物或其盐或酯；
(2)式(I)化合物的光学异构体或其外消旋体；
(3)式(I)化合物的溶剂化物或其前体；
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述大麻为工业大麻。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述工业大麻为国麻1号、汉麻7号和牡麻3 号中的任意一种。
4.选自如下(1)～(3)任意一项在制备提高大麻中大麻二酚含量的制剂中的应用；
(1)式(I)化合物或其盐或酯；
(2)式(I)化合物的光学异构体或其外消旋体；
(3)式(I)化合物的溶剂化物或其前体；
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述大麻为工业大麻。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述制剂还包括表面活性剂、湿润剂、展着剂、黏着剂、防冻剂、增效剂和缓蚀剂中的任意一种或多种。
7.一种提高大麻中大麻二酚含量的方法，其特征在于，在大麻的营养生长阶段、生殖生长阶段中任一阶段或任二阶段一次或多次喷施权利要求1所述的小分子化合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述喷施方式为叶面喷施、根系灌溉中的任意一种。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述小分子化合物的浓度为10～500μM。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，单次喷施的量为1～100L/亩大麻。
技术领域
本发明涉及农业技术领域，特别涉及小分子化合物在提高大麻中大麻二酚含量中的应用。
背景技术
大麻二酚，简称CBD，是药用植物大麻中的主要化学成分，提取自雌性大麻植株，是大麻中的非成瘾性成分，具有抗痉挛、抗焦虑、抗炎等药理作用。CBD不仅可以作用于多种疑难疾病的治疗，还可以有效地消除四氢大麻酚(THC)对人体产生的致幻作用，被称为“反毒品化合物”。但是，近几年种植的品种CBD的含量比较低，在萃取过程中成本比较高，阻碍了大麻的发展进程。传统上多是通过杂交繁育方式提高品种CBD含量，新品种的繁育成功使大麻的种植水平和经济价值得到了大幅度的提升。
然而，新品种的培育往往需要较长的周期，期间花费巨大。此外，培育的新品种由于品种的特殊性，在育苗和种植过程中须用特殊的方法来进行育苗，额外增加培育的成本。此外，通过传统育种、转基因或基因编辑技术对大麻品种进行改良还涉及品种审定及监管，审核周期通常需要数年，花费数千万元。因此，亟需开发一种无需改变大麻品种和遗传背景，可直接作用于现有的工业大麻品种，短期内可提高CBD含量的调节剂，降低生产成本。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出小分子化合物在提高大麻中大麻二酚含量中的应用，通过外施小分子化合物RPS?1，提高了大麻中大麻二酚的含量。
本发明提供了选自(1)～(3)任意一项的小分子化合物在提高大麻中大麻二酚含量中的应用；
(1)式(I)化合物或其盐或酯；
(2)式(I)化合物的光学异构体或其外消旋体；
(3)式(I)化合物的溶剂化物或其前体；
所述小分子化合物命名为RPS?1，本发明通过在大麻的营养生长阶段、生殖生长阶段喷施一次或多次RPS?1通过激活工业大麻自身相关信号通路增加了次生代谢物CBD的积累。
在一些实施方式中，式(I)的小分子化合物可以配制成可流动组合物、可湿性粉剂、微乳剂以及类似剂型。所有剂型适用于土壤、水和/或叶片施用。
在一些实施方式中，所述大麻为工业大麻。
在一些实施方式中，所述工业大麻为国麻1号、汉麻7号和牡麻3号中的任意一种。
本发明还提供选自如下(1)～(3)任意一项在制备提高大麻中大麻二酚含量的制剂中的应用；
(1)式(I)化合物或其盐或酯；
(2)式(I)化合物的光学异构体或其外消旋体；
(3)式(I)化合物的溶剂化物或其前体；
在一些实施方式中，所述大麻为工业大麻。
在一些实施方式中，所述制剂还包括表面活性剂、湿润剂、展着剂、黏着剂、防冻剂、增效剂和缓蚀剂中的任意一种或多种。
在一些实施方式中，所述表面活性剂优选为阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、两性表面活性剂、或非离子型表面活性剂中的任意一种；所述表面活性剂的含量为0.01～10wt％。
在一些实施方式中，所述制剂中可包含除式(I)小分子化合物以外的其他活性成分。例如，可以包含可杀灭真菌的活性成分混用，或包含其他植物生长调节剂成分混用。
本发明还提供一种提高大麻中大麻二酚含量的方法，在大麻的营养生长阶段、生殖生长阶段中任一阶段或任二阶段一次或多次喷施所述小分子化合物。
在一些实施方式中，所述喷施方式为叶面喷施或根系灌溉。
在一些实施方式中，所述小分子化合物的浓度为10～500μM，优选为50～200μM。
在一些实施方式中，单次喷施的量为1～100L/亩大麻，优选为2～50L/亩大麻。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
1、本发明提供了小分子化合物RPS?1在提高大麻中CBD含量的新用途，采用本发明的方法无需改变大麻品种和遗传背景。
2、本发明通过试验验证小分子化合物RPS?1在较低浓度下即可提高工业大麻中CBD的含量，在实际生产应用中，可降低CBD的生产成本。
3、本发明的小分子化合物RPS?1外源喷施，施用灵活，能够适用于所有品种的大麻。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例和对比例CBD含量检测结果；其中，由左到右的处理组1代表实施例1、4、7，在国麻1号、牡麻3号和汉麻7号的营养生长期和生殖生长期间隔20天喷施；由左到右的处理组2代表实施例2、5、8，在三个大麻品种的营养生长期和生殖生长期间隔45天喷施；由左到右的处理组3代表实施例3、6、9，在三个大麻品种的营养生长期和生殖生长期间隔25天喷施；由左到右的对照组分别代表对比例1、2、3。
图1
图2为本发明对比例1、实施例10～14的CBD含量检测结果。
图2
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明通过在大麻的营养生长阶段、生殖生长阶段喷施一次或多次RPS?1通过激活工业大麻自身信号通路，增加了初生和次生代谢物的积累，最终实现CBD含量的增加。根据实施例的结果可知，RPS?1适用于多个工业大麻品种，在低剂量下均可提高CBD的含量。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
材料来源：
国麻1号：哈尔滨市汉博生物科技有限公司；
牡麻3号：哈尔滨市汉博生物科技有限公司；
汉麻7号：哈尔滨市汉博生物科技有限公司；
RPS?1：化合物的制备和鉴定详见专利号ZL201611066259.1。
1、工业大麻的种植管理
选取国麻1号、汉麻7号和牡麻3号三个含麻品种进行田间种植，工业大麻的种植选择土层深厚、土质疏松肥沃的砂壤土最适宜。粘性土壤排水性不良，容易积水导致大麻出苗差、植株烂根、死苗。
生长周期参照黑龙江产区冬季种植季，如表1所示：
表1 工业大麻生长周期(冬季种植季)
2、RPS?1的配制：
将RPS?1溶于有机溶剂(实施例使用为二甲基亚砜(DMSO))配置储存液(如200mM)，随后用水稀释至使用浓度(通常为1～500μM)，加入表面活性剂(实施例使用为0.1％(v/v) 吐温20(Tween?20))。
实施例中制备RPS?1溶液的浓度为50μM。
可使用人工、无人机、其他田间喷施设备喷施，或通过日常滴灌施用。
3、RPS?1溶液处理工业大麻
在工业大麻的营养生长期和生殖生长期(尤以营养生长期为佳)喷施，喷施次数为1到多次。
实施例1
分别在国麻1号营养生长初期和旺盛期向国麻1号的叶面喷施两次50μMRPS?1溶液，喷施面积为1亩，喷施用量为每次每亩喷施30L，间隔20天。
实施例2
分别在营养生长初期和旺盛期向国麻1号的叶面喷施两次50μM RPS?1溶液，喷施面积为1亩，喷施用量为每次每亩喷施30L，间隔45天。
实施例3
分别在营养生长旺盛期和生殖生长初期向国麻1号的叶面喷施两次50μMRPS?1溶液，喷施面积为1亩，喷施用量为每次每亩喷施30L，间隔25天。
实施例4
分别在营养生长初期和旺盛期向牡麻3号品种的叶面喷施两次50μMRPS?1溶液，喷施面积为1亩，喷施用量为每次每亩喷施30L，间隔20天。
实施例5
分别在营养生长初期和旺盛期向牡麻3号品种的叶面喷施两次50μMRPS?1溶液，喷施面积为1亩，喷施用量为每次每亩喷施30L，间隔45天。
实施例6
分别在营养生长旺盛期和生殖生长初期向牡麻3号品种的叶面喷施两次50μMRPS?1溶液，喷施面积为1亩，喷施用量为每次每亩喷施30L，间隔25天。
实施例7
分别在营养生长旺盛期和生殖生长初期向汉麻7号品种的叶面喷施两次50μMRPS?1溶液，喷施面积为1亩，喷施用量为每次每亩喷施30L，间隔20天。
实施例8
分别在营养生长旺盛期和生殖生长初期向汉麻7号品种的叶面喷施两次50μMRPS?1溶液，喷施面积为1亩，喷施用量为每次每亩喷施30L，间隔45天。
实施例9
分别在营养生长旺盛期和生殖生长初期向汉麻7号品种的叶面喷施两次50μMRPS?1溶液，喷施面积为1亩，喷施用量为每次每亩喷施30L，间隔25天。
实施例10
分别在营养生长旺盛期和生殖生长初期向国麻1号品种的叶面喷施两次5μM RPS?1溶液，喷施面积为1亩，喷施用量为每次每亩喷施30L，间隔20天。
实施例11
分别在营养生长旺盛期和生殖生长初期向国麻1号品种的叶面喷施两次25μMRPS?1溶液，喷施面积为1亩，喷施用量为每次每亩喷施30L，间隔20天。
实施例12
分别在营养生长旺盛期和生殖生长初期向国麻1号品种的叶面喷施两次100μMRPS?1溶液，喷施面积为1亩，喷施用量为每次每亩喷施30L，间隔20天。
实施例13
分别在营养生长旺盛期和生殖生长初期向国麻1号品种的叶面喷施两次200μMRPS?1溶液，喷施面积为1亩，喷施用量为每次每亩喷施30L，间隔20天。
实施例14
分别在营养生长旺盛期和生殖生长初期向国麻1号品种的叶面喷施两次400μMRPS?1溶液，喷施面积为1亩，喷施用量为每次每亩喷施30L，间隔20天。
对比例1
分别在营养生长初期和旺盛期向国麻1号的叶面喷施两次含0.1％吐温20 的清水，喷施面积为1亩，喷施用量为每次每亩喷施30L，间隔20天。
对比例2
分别在营养生长初期和旺盛期向牡麻3号品种的叶面喷施两次含0.1％吐温20的清水，喷施面积为1亩，喷施用量为每次每亩喷施30L，间隔20天。
对比例3
分别在营养生长初期和旺盛期向汉麻7号品种的叶面喷施两次含0.1％吐温20的清水，喷施面积为1亩，喷施用量为每次每亩喷施30L，间隔20天。
4、工业大麻的收获
(1)大麻在盛花期正常采收，分别在初花期(取样时间点1)和盛花期(取样时间点2)取样，每个组合取3个样，然后进行CBD的含量检测。
(2)三个处理组的大麻的外观，长势和产量与对照组(CK)相比均没有明显变化。
5、CBD含量的检测
样品制备：
使用液相色谱质谱连用法对CBD进行检测。取5g大麻样品精细研磨，取1g研磨后样品于试管中并加入30mL 80％甲醇溶液。震荡15min，后5000g离心15min。取2mL上清液于针头过滤器中，使用0.2μm滤膜进行过滤。过滤后，取30μL滤液于1.5mL试管中，加入970μL80％甲醇溶液得到1000倍稀释提取液。
液相色谱条件：
层析柱使用Agilent Eclipse Plus C18 column，流动相为水(0.1％甲酸)：乙腈(0.1％甲酸)10：90。流量0.5mL/min，时长15min。柱温保持40℃，注射量20μL。
质谱条件：
使用SCIEX Triple QuadTM 5500三重四极杆质谱检测系统对CBD进行检测。检测模式设置为阳离子模式。喷雾电压4500V，离子源温度600℃。载气使用氮气，气源1、2压力均为50psi。CDB检测参数设置为锥孔电压100V，入口电压10V，碰撞能29V，母离子315.0m/z，子离子193.0m/z。使用外标法对检测结果进行定量。首先使用CBD标准品制备0.2～50ng/mL溶液检测得到相应离子峰强度，制作标准曲线。样品CBD含量由检测结果的离子峰面积根据标准曲线换算得出。
具体含量(％)如表2～3所示：
表2 实施例CBD含量检测结果(％)
表3 对比例的CBD含量检测结果(％)
如图1所示，处理组1代表实施例1、4、7，在国麻1号、牡麻3号和汉麻7号的营养生长期和生殖生长期间隔20天喷施。处理组2代表实施例2、5、8，在三个大麻品种的营养生长期和生殖生长期间隔45天喷施。处理组3代表实施例3、6、9，在三个大麻品种的营养生长期和生殖生长期间隔25天喷施。对照组分别代表对比例1、2、3。实施例1～9的CBD含量均不同程度高于相应的对比例，说明在工业大麻的营养生长期和生殖生长期喷施RPS?1均可提升CBD 含量，其中尤以营养生长期喷施效果更佳。如图2所示，对比例1与实施例10、11、12、13、14对比显示，由5μM到400μM的RPS?1喷施量匀可提升CBD含量，其中以50μM的喷施量对CBD含量的提升最佳。
综上所述，小分子化合物RPS?1在较低浓度下具有促进工业大麻CBD含量的作用，同时不影响大麻的生长。本发明有助于提升工业大麻中的药用有效成分CBD的含量，在实际生产上具有重要意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
文章摘自国家发明专利，小分子化合物在提高大麻中大麻二酚含量中的应用，发明人：崔蓉，胡皓夫，曹民杰，俞劼夫，朱健康，申请号：202411129099.5，申请日：2024.08.16
