摘 要: 本发明公开了一种苎麻腋芽EMS诱变和近红外快速检测饲用苎麻叶片粗蛋白含量的方法，包括用磷酸缓冲液(pH6.5)配制浓度1％(v/v)的EMS溶液；3 6月间，选择长势良好的湘苎三号苎麻，摘除顶芽，用毛笔蘸取配制好的EMS试剂涂抹在腋芽上，间隔24h涂抹1次，连续涂抹7次(D3)；每日傍晚涂抹，处理植株需要避雨处理；诱变处理后，待腋芽长至5～10cm高时，进行扦插、移栽；采用化学测量法检测样品饲用苎麻叶粉中粗蛋白的含量；采用近红外农产品品质测定仪扫描样品饲用苎麻叶粉的吸收光谱数据；选择粗蛋白的光谱预处理方法；利用扫描的吸收光谱数据，结合化学测量法的检测值和光谱预处理方法获得的数据建立光谱分析模型；选取验证饲用苎麻叶粉对光谱分析模型进行校正。
权利要求书
1.苎麻腋芽EMS诱变和近红外快速检测饲用苎麻叶片粗蛋白含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1：用磷酸缓冲液(pH6.5)配制浓度1％(v/v)的EMS溶液；
步骤2：3 6月间，选择长势良好的湘苎三号苎麻，摘除顶芽，用毛笔蘸取配制好的EMS试剂涂抹在腋芽上，间隔24h涂抹1次，连续涂抹7次(D3)；每日傍晚涂抹，处理植株需要避雨处理；
步骤3：诱变处理后，待腋芽长至5～10cm高时，进行扦插、移栽；
步骤4：采用化学测量法检测样品饲用苎麻叶粉中粗蛋白的含量；
步骤5：采用近红外农产品品质测定仪扫描样品饲用苎麻叶粉的吸收光谱数据；
步骤6：选择粗蛋白的光谱预处理方法；步骤7：利用扫描的吸收光谱数据，结合化学测量法的检测值和光谱预处理方法获得的数据建立光谱分析模型；步骤8：选取验证饲用苎麻叶粉对光谱分析模型进行校正。
2.根据权利要求1所述的苎麻腋芽EMS诱变和近红外快速检测饲用苎麻叶片粗蛋白含量的方法，其特征在于，所述步骤4中对粗蛋白含量测定至少重复进行三次。3.根据权利要求1所述的苎麻腋芽EMS诱变和近红外快速检测饲用苎麻叶片粗蛋白含量的方法，其特征在于，在所述步骤5中，对饲用苎麻叶进行多次吸收光谱的扫描，扫描范围为1100nm～2500nm。
4.根据权利要求1所述的苎麻腋芽EMS诱变和近红外快速检测饲用苎麻叶片粗蛋白含量的方法，其特征在于，所述步骤7选择粗蛋白的光谱预处理方法，是选择使光谱分析模型的决定系数和分辨度最大、校正标准差和相对标准差最小的光谱预处理方法。
5.根据权利要求1所述的苎麻腋芽EMS诱变和近红外快速检测饲用苎麻叶片粗蛋白含量的方法，其特征在于，在所述步骤7中，利用CAUNIR近红外定标软件，对样品饲用苎麻叶粉的粗蛋白的含量化学测量值和三次扫描采集的吸收光谱数据分别求平均值，对样品饲用苎麻叶粉的粗蛋白的含量化学测量值和吸收光谱预处理后的数据一一对应进行关联，并采用定量偏最小二乘法(QPLS)法进行建模；选择使光谱分析模型的决定系数和分辨度最大、校正标准差和相对标准差最小的原始光谱数据预处理方法进行数据预处理并建模。
6.根据权利要求1所述的苎麻腋芽EMS诱变和近红外快速检测饲用苎麻叶片粗蛋白含量的方法，其特征在于，所述步骤6饲用苎麻叶粉的粗蛋白采用外部检测法进行光谱预处理，粗蛋白光谱采用极差归一的预处理方法。
7.根据权利要求1所述的苎麻腋芽EMS诱变和近红外快速检测饲用苎麻叶片粗蛋白含量的方法，其特征在于，所述光谱分析模型预测的饲用苎麻叶片中粗蛋白含量与实际测量的饲用苎麻叶片中粗蛋白含量相关系数为：0.9535。
8.根据权利要求1所述的苎麻腋芽EMS诱变和近红外快速检测饲用苎麻叶片粗蛋白含量的方法，其特征在于，所述步骤7利用光谱分析模型预测待测饲用苎麻叶中粗蛋白的含量，是将近红外农产品品质测定仪采集的待测饲用苎麻叶粉的吸收光谱数据平均值输入至光谱分析模型，经过光谱数据预处理、模型计算预测获得该成份的预测值，即可预测得到该饲用苎麻叶中粗蛋白的含量。
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种苎麻腋芽EMS诱变及近红外快速检测叶片粗蛋白含量的方法。
背景技术
国内外研究发现饲用苎麻嫩茎叶中富含粗蛋白、粗纤维、微量元素、氨基酸等营养物质，可做优质的蛋白饲料。同时饲用苎麻叶中含有与根相同的成分绿原酸,此外还含有原儿茶酸、野漆树苷、芸香苷等酚酸类等抗氧化活性物质。粗蛋白含量高的饲料不利于动物对营养的消化吸收。具有较高的食品保健和药用开发价值。因此筛选出粗蛋白含量较低、适合做优质的蛋白饲料的饲用苎麻叶种质尤为重要。
目前饲用苎麻的选育的方法有杂交选育法、系谱法和物理诱变法。其中杂交育种是目前使用较多的方法，但由于育种年限较长，在杂交后代中只会出现双亲的性状，可选择的范围小。而诱变育种因其诱变效率较高，能够大幅加速育种进程，因此被广泛运用。EMS诱变技术属于诱变育种的一种，相较于其它育种方法，EMS诱变育种的优势有：第一，成本低廉、操作简单，对实验条件要求低，只需要简单试剂和实验器材即可；第二，突变效率高，变异范围广，能诱变出多种变异类型，为育种提供丰富的变异材料；第三，对材料损伤小，能够产生稳定表型变异，改良作物的某些性状。但是关于诱变后代的鉴定和优良株系的快速选择仍然是难题。相较于其他作物，苎麻是无性繁殖为主，种子繁殖变异大，不稳定。目前关于EMS诱变植物无性繁殖材料的报道较少，关于苎麻腋芽EMS的诱变未见报道。寻找合适且高效的苎麻腋芽EMS诱变方法对苎麻育种有重要作用。
传统测定粗蛋白的方法有高锰酸钾滴定法、氨基安替比林比色法、酒石酸比色法及福林发，这些方法的主要缺点是操作复杂、耗时长且不能大批量进行。高效液相色谱法测定粗蛋白虽然结果准确，但需要使用高效液相色谱仪、气相色谱仪或者离子色谱法等仪器，设备昂贵。因此寻找一种粗蛋白含量快速、准确、高效、价格低廉的测定方法显得尤为重要。
近红外光谱分析技术具有快速、准确、无污染等优点，因此建立快速准确的检测饲用苎麻叶中粗蛋白近红外预测模型，缩短时间、减少成本，不仅可为饲用苎麻作为饲料的品质评价提供参考，也可以为饲料型饲用苎麻种质提供快速筛选技术。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明旨在于提供一种苎麻腋芽EMS诱变及近红外快速检测叶片粗蛋白含量的方法，以实现快速、高效的诱变苎麻腋芽并检测诱变后代苎麻麻叶粗蛋白含量，准确评价饲用苎麻饲料的品质，为饲料型饲用苎麻种质的诱变及筛选提供技术。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
苎麻腋芽EMS诱变和近红外快速检测饲用苎麻叶片粗蛋白含量的方法，包括如下步骤：
步骤1：用磷酸缓冲液(pH6.5)配制浓度1％(v/v)的EMS溶液。
步骤2：3 6月间，选择长势良好的湘苎三号苎麻，摘除顶芽，用毛笔蘸取配制好的EMS试剂涂抹在腋芽上，间隔24h涂抹1次，连续涂抹7次(D3)。每日傍晚涂抹，处理植株需要避雨处理。
步骤3：诱变处理后，待腋芽长至5～10cm高时，进行扦插、移栽。
步骤4：采用化学测量法检测样品饲用苎麻叶粉中粗蛋白的含量；
步骤5：采用近红外农产品品质测定仪扫描样品饲用苎麻叶粉的吸收光谱数据；
步骤6：选择粗蛋白的光谱预处理方法；
步骤7：利用扫描的吸收光谱数据，结合化学测量法的检测值和光谱预处理方法获得的数据建立光谱分析模型；
步骤8：选取验证饲用苎麻叶粉对光谱分析模型进行校正；
进一步的，所述步骤4中对粗蛋白含量测定至少重复进行三次。
进一步的，所述步骤5采用S400型近红外农产品品质测定仪进行吸收光谱的采集，扫描范围为4000nm～9090nm。
进一步的，所述步骤5中，对饲用苎麻叶进行多次吸收光谱的扫描；所述步骤7是利用多次扫描的吸收光谱数据的平均值建立红外光谱分析模型。
进一步的，所述步骤7选择粗蛋白的光谱预处理方法，是选择使光谱分析模型的决定系数和分辨度最大、校正标准差和相对标准差最小的光谱预处理方法。
进一步的，所述步骤7建立光谱分析模型的过程如下：利用CAUNIR近红外定标软件，对样品饲用苎麻叶粉的粗蛋白的含量化学测量值和三次扫描采集的吸收光谱数据分别求平均值，对样品饲用苎麻叶粉的粗蛋白的含量化学测量值和吸收光谱预处理后的数据一一对应进行关联，并采用定量偏最小二乘法(QPLS)法进行建模。选择使光谱分析模型的决定系数和分辨度最大、校正标准差和相对标准差最小的原始光谱数据预处理方法进行数据预处理并建模。
进一步的，所述步骤6饲用苎麻叶粉的粗蛋白采用外部检测法进行光谱预处理，粗蛋白光谱采用极差归一的预处理方法效果最佳
进一步的，所述光谱分析模型预测的饲用苎麻叶片中粗蛋白含量与实际测量的饲用苎麻叶片中粗蛋白含量相关系数为：0.9535。
进一步的，所述步骤7利用光谱分析模型预测待测饲用苎麻叶中粗蛋白的含量，是将近红外农产品品质测定仪采集的待测饲用苎麻叶粉的吸收光谱数据平均值输入至光谱分析模型，经过光谱数据预处理、模型计算预测获得该成份的预测值，即可预测得到该饲用苎麻叶中粗蛋白的含量。
本发明的有益效果是，苎麻腋芽EMS诱变的个体出现性状差异，利于育种选择。通过收获EMS处理后植株的种子，进行育苗、移栽得到的M1代表现出与野生型不同的性状。近红外快速检测饲用苎麻叶片粗蛋白含量的方法，通过利用测定到的样品饲用苎麻叶片粗蛋白成分含量，建立光谱分析模型，以实现快速、高效且准确的检测麻叶粉中的粗蛋白成分含量，成本低，为饲料型饲用苎麻种质提供快速筛选技术。
附图说明
图1是饲用苎麻叶样品原始光谱图；
图1
图2是饲用苎麻粗蛋白测定值与预测值相关图；
图2
图3是用CAUNIR软件构建的模型构建，校正后的预测值和测定值之间的线性关系。
图3
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
苎麻腋芽EMS诱变和近红外快速检测饲用苎麻叶片粗蛋白含量的方法，包括如下步骤：
步骤1：用磷酸缓冲液(pH6.5)配制浓度1％(v/v)的EMS溶液。磷酸缓冲液(pH6.5)配制方法是先配置1/15M磷酸氢二钠溶液(1000mL中含Na2HPO4·2H2O11.878g)和1/15M磷酸二氢钾溶液(1000mL中含KH2PO49.078g)，然后31.8ml1/15M磷酸氢二钠溶液68.2ml1/15M磷酸二氢钾溶液混合均匀即成。取99ml的磷酸缓冲液(pH6.5)混和1ml的EMS溶液即配成1％(v/v)的EMS溶液。
步骤2：3 6月间，选择长势良好的湘苎三号苎麻，摘除顶芽，用毛笔蘸取配制好的EMS试剂涂抹在腋芽上，间隔24h涂抹1次，连续涂抹7次(D3)。每日傍晚涂抹，处理植株需要避雨处理。
步骤3：诱变处理后，待腋芽长至5～10cm高侧枝时，进行扦插、移栽。
步骤4：采用化学测量法检测样品饲用苎麻叶粉中粗蛋白的含量；
步骤5：采用近红外农产品品质测定仪扫描样品饲用苎麻叶粉的吸收光谱数据；
步骤6：选择粗蛋白的光谱预处理方法；
步骤7：利用扫描的吸收光谱数据，结合化学测量法的检测值和光谱预处理方法获得的数据建立光谱分析模型；
步骤8：选取验证饲用苎麻叶粉对光谱分析模型进行校正；
进一步的，所述步骤4中对粗蛋白含量测定至少重复进行三次。
进一步的，所述步骤5采用S400型近红外农产品品质测定仪进行吸收光谱的采集，扫描范围为4000nm～9090nm。
进一步的，所述步骤5中，对饲用苎麻叶进行多次吸收光谱的扫描；所述步骤7是利用多次扫描的吸收光谱数据的平均值建立红外光谱分析模型。
进一步的，所述步骤7选择粗蛋白的光谱预处理方法，是选择使光谱分析模型的决定系数和分辨度最大、校正标准差和相对标准差最小的光谱预处理方法。
进一步的，所述步骤7建立光谱分析模型的过程如下：利用CAUNIR近红外定标软件，对样品饲用苎麻叶粉的粗蛋白的含量化学测量值和三次扫描采集的吸收光谱数据分别求平均值，对样品饲用苎麻叶粉的粗蛋白的含量化学测量值和吸收光谱预处理后的数据一一对应进行关联，并采用定量偏最小二乘法(QPLS)法进行建模。选择使光谱分析模型的决定系数和分辨度最大、校正标准差和相对标准差最小的原始光谱数据预处理方法进行数据预处理并建模。
进一步的，所述步骤6饲用苎麻叶粉的粗蛋白采用外部检测法进行光谱预处理，粗蛋白光谱采用极差归一的预处理方法效果最佳。
进一步的，所述光谱分析模型预测的饲用苎麻叶片中粗蛋白含量与实际测量的饲用苎麻叶片中粗蛋白含量相关系数为：0.9535。
进一步的，所述步骤7利用光谱分析模型预测待测饲用苎麻叶中粗蛋白的含量，是将近红外农产品品质测定仪采集的待测饲用苎麻叶粉的吸收光谱数据平均值输入至光谱分析模型，经过光谱数据预处理、模型计算预测获得该成份的预测值，即可预测得到该饲用苎麻叶中粗蛋白的含量。
实施例
苎麻腋芽EMS诱变：
(1)EMS浓度及处理方法
用磷酸缓冲液(pH6.5)配制浓度分别为0.5％，1％，1.5％(v/v)的EMS溶液。在3 6月，选择长势良好的湘苎三号苎麻，摘除顶芽，用毛笔蘸取配制好的EMS试剂涂抹在腋芽上，设置3个处理，分别是①只涂抹1次(D1)；②间隔24h涂抹1次，连续涂抹3次(D2)；③间隔24h涂抹1次，连续涂抹7次(D3)。每日傍晚涂抹，每个处理做6株，每株处理5个芽，共计30个芽，重复2次。对照组为湘苎三号苎麻植株去除顶芽后不做涂抹处理。诱变处理后，待腋芽长至5～10cm高时，进行扦插、移栽，对移栽后的苎麻进行农艺性状的测量(M0代).
经不同浓度EMS溶液处理后，对其致死率统计发现，随EMS试剂浓度增加和处理时间延长，苎麻腋芽致死率逐渐增大，且不同的浓度梯度和处理时间腋芽成活率有差异，说明EMS试剂对湘苎三号腋芽萌发有影响。统计剂量与致死率的关系时发现，同一浓度下处理次数越多致死率越高，同一处理时间下，浓度越大，致死率也越高。根据致死率(y)与剂量(x)的回归方程：y＝4.4533x+13.885，理论上在剂量达到8.11mg/mL时，湘苎三号腋芽的致死率达到50％(图1)。从表3 3可知，1％和1.5％EMS溶液处理7次后(D3)，其致死率分别为48.33％和54.54％，接近半致死剂量(致死率)。
表1 不同EMS浓度和时间对湘苎三号腋芽的影响
(2)EMS诱变后代的观察
经诱变处理后植株的数量性状指标存在丰富变异。诱变后株高、茎粗、鲜重、干重、叶重、干叶重范围分别为16 68cm、3.04 8.18mm、6.2 111.9g、1.5 26g、3.5 55.3g和0.6 11.4g，均值分别为41.06cm、5.22mm、41.17g、9.61g、22.25g和5.71g，变异系数分别为0.23、0.18、0.47、0.46、0.46、0.45。变异系数依次为鲜重>干重＝叶重>干叶重>株高>茎粗。变异系数大于0.3的有鲜重、干重、叶重、干叶重，表明其受EMS诱变影响较大，变异类型丰富，以鲜重最高，诱变影响最为突出；变异系数小于0.3的有株高、茎粗，说明其受诱变影响较小(表2)。
表2 EMS处理对湘苎三号M0代数量性状的影响
2、近红外快速检测叶片粗蛋白含量：
供试材料为152份饲用苎麻叶粉，每份材料分为2组，一组用于化学成分测定，另外一组用于近红外光谱采集。近红外光谱样品集分为校正集与检验集，校正集用于建立模型及模型的内部交叉验证，检验集用于模型的外部验证。本实验选取了142份作为校正集，10份作为检验集。
(1)近红外扫描光谱的采集：
使用微型植物粉碎机粉碎，充分混匀经过筛处理，在105℃条件下烘干24小时，样品放于玻璃干燥器内，至温度冷却至室温后，装入小圆型样品杯，将样品刮平、压实，确保装载的样品均匀一致，样品重约为3g。采用S400型近红外农产品品质测定仪进行吸收光谱的采集，扫描范围为1100nm～2500nm(4000 9090.91(1/cm))，为减少仪器波动和装样对光谱扫描的干扰，每个样品重复扫描3次，用光谱处理软件合并成平均光谱用于建模与校验。
(2)粗蛋白含量测定
饲用苎麻叶粗蛋白的近红外模型的校正集和检验集样品数据统计结果见表3。饲用苎麻叶材料校正集粗蛋白含量范围在8.65％～32.25％,平均值是17.84％；验证集粗蛋白含量范围在10.86％～32.25％，平均值是20.44％。样品化学成分含量分布范围较广，差异明显，说明样品具有一定的代表性。
表3 饲用苎麻叶粗蛋白含量的测定
(3)原始光谱的采集
图2所示为饲用苎麻叶样品在1100nm～2500nm(4000 9090.91(1/cm))nm的近红外漫反射光谱图，全波长范围内存在多个吸收峰。不同样品在近红外光谱区吸收光谱特征基本一致，全光谱呈现高低平缓的趋势，说明样品主要成分基本相同，但各成分相对含量不同，即可利用样品的近红外光谱进行粗蛋白含量的测定。
(4)原始光谱预处理与模型建立：
原始光谱预处理方法有中心化、极差归一、矢量校正、散射校正、一阶导数和二阶导数六种，推荐主成分数方法有外部检测和内部交叉两种。原始光谱预处理方法的选择直接影响着分析模型建立的好坏。采用定量偏最小二乘法(QPLS)法进行建模，构建的近红外预测模型决定系数(R2)、分辨度(RPD)越大，校正标准差(SEC)、相对标准差(RSD)越小，预测模型越准确。通过上述六种预处理方法和两种推荐主成分数方法处理比较分析，结果如表4，发现：饲用饲用苎麻叶粉粗蛋白含量测定采用内部交叉较好，其中极差归一的预处理方法效果最佳，主成分数为13，决定系数为90.90％。
表4 饲用苎麻叶化学成分预处理结果
(5)模型建立：
采用CAUNIR软件进行模型构建，如图3所示，校正后的预测值和测定值存在较好的线性关系。粗蛋白相关系数为0.9535。表明饲用苎麻叶粗蛋白和部分营养成分含量的近红外模型的预测准确度较好，能满足物质品质分析中对准确度的要求。
(6)模型验证：
选取未参与定标10个饲用苎麻叶样品对所建粗蛋白模型进行验证。验证结果如下表5。粗蛋白测量值与预测值平均值接近，分别为20.44％、20.57％，平均差值为0.13％。粗蛋白化学值与预测值最大绝对误差为2.88％，最小绝对误差为0.09％，且平均绝对误差为1.45％。
表5 近红外模型验证结果
预测模型是利用光学数据预测值和化学方法实测的值来建模的，化学方法检测粗蛋白是按照国标来做，费时费力；前期建模需要获得一定数量饲用苎麻的化学值，建好模型后，需要在近红外分析软件中打开，x值为用近红外农产品品质测定仪扫描的吸收光谱数据预测值，y为预测的化学值，利用真实测量值建立预测模型，是为了保证预测值的可靠性。在实际应用中，只需要采用近红外仪扫饲用苎麻叶片粉末，获得光学数据，直接利用模型测得叶片中粗蛋白的含量，而不需要再采用化学法进行测定，简单，快速，高效，省钱省力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
(7)EMS右边后代的粗蛋白快速检测
对经EMS处理后的苎麻M0代与M1代植株叶粗蛋白含量分析后发现，不同浓度和时间处理后的湘苎三号后代粗蛋白含量均值均低于对照。粗蛋白高于CK的单株有96株，其中，T8处理中最少为0株；T1、T3及T7处理中分别有21株、17株及23株，分别占其处理总株数的29.58％、28.33％及27.38％(表6)。
图6 诱变M0代与M1代粗蛋白含量描述统计
对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。
文章摘自国家发明专利，一种苎麻腋芽EMS诱变及近红外快速检测叶片粗蛋白含量的方法，发明人:邢虎成，霍颖怡，邵明宇，揭雨成，申请号，202411193422.5，申请日，2024.08.28。
