摘 要:本发明公开一种耐受甲醇的高产α-亚麻酸的毕赤酵母工程菌及其构建方法和应用，属于生物技术领域。本发明在毕赤酵母中筛选了膜磷脂相关基因，利用代谢工程和组学分析技术，构建并优化磷脂酰胆碱合成的途径，并过表达三酰甘油脂肪酶TAG基因，得到耐受甲醇的高产α-亚麻酸的毕赤酵母工程菌株。在发酵罐水平添加5%的初始甲醇浓度，对高产α-亚麻酸的毕赤酵母工程菌进行非灭菌发酵；其中,工程菌34在58h的OD600达到最高108.28，最高α-亚麻酸的含量可以达到72.72g/L。本发明得到的高产α-亚麻酸的毕赤酵母工程菌株具有重要的理论和实际意义，具有广泛的应用前景。
权利要求书
1.一种耐受甲醇的高产α 亚麻酸的毕赤酵母工程菌，其特征在于：是对毕赤酵母出发菌株进行以下操作后得到：
(a)过表达磷脂酰乙醇胺N 甲基转移酶PET2基因、二酰基甘油 丝氨酸磷脂酰转移酶PSA基因、PAS_chr1 4_0178基因和PAS_chr2 2_0267基因中的至少一种；和，
(b)过表达三酰甘油脂肪酶TAG基因；其中，所述基因都是毕赤酵母(K.phaffii)的内源基因。
2.根据权利要求1所述的耐受甲醇的高产α 亚麻酸的毕赤酵母工程菌，其特征在于：
磷脂酰乙醇胺N 甲基转移酶PET2的GenBank号为XP_002493092.1；
二酰基甘油 丝氨酸磷脂酰转移酶PSA的GenBank号为XP_002490079.1；
PAS_chr1 4_0178的GenBank号为XP_002490293.1；PAS_chr2 2_0267的GenBank号为XP_002491926.1；
三酰甘油脂肪酶TAG的GenBank号为XP_002491374.1。
3.根据权利要求2所述的耐受甲醇的高产α 亚麻酸的毕赤酵母工程菌，其特征在于：
磷脂酰乙醇胺N 甲基转移酶PET2基因的GenBank号为XM_002493047.1；
二酰基甘油 丝氨酸磷脂酰转移酶PSA基因的GenBank号为XM_002490034.1；PAS_chr1 4_0178基因的GenBank号为XM_002490248.1；
PAS_chr2 2_0267基因的GenBank号为XM_002491881.1；
三酰甘油脂肪酶TAG基因的GenBank号为XM_002491329.1。
4.根据权利要求1所述的耐受甲醇的高产α 亚麻酸的毕赤酵母工程菌，其特征在于：
所述基因利用启动子AOX1或GAP构建基因表达盒；
所述启动子AOX1或GAP为来源于毕赤酵母的启动子AOX1或GAP；
所述PAS_chr1 4_0178基因用中性位点PNSI 2进行整合，所述PAS_chr2 2_0267基因用中性位点PNSII 5进行整合，所述TAG基因用中性位点PNSI 6进行整合。
5.根据权利要求4所述的耐受甲醇的高产α 亚麻酸的毕赤酵母工程菌，其特征在于：
PET2基因、PAS_chr1 4_0178基因、PAS_chr2 2_0267基因或TAG基因均利用启动子AOX1构建基因表达盒；
所述PSA基因利用启动子GAP构建基因表达盒；在中性位点PNSI 2、PNSII 5或PNSI 6整合时，利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行整合。
6.根据权利要求1～5任一项所述的耐受甲醇的高产α 亚麻酸的毕赤酵母工程菌，其特征在于：所述毕赤酵母出发菌株为毕赤酵母(K.phaffii)GS115。
7.权利要求1～6任一项所述的耐受甲醇的高产α 亚麻酸的毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)将磷脂酰乙醇胺N 甲基转移酶PET2基因和/或二酰基甘油 丝氨酸磷脂酰转移酶PSA基因连接至表达载体上，得到重组表达载体；(2)将步骤(1)获得的重组表达载体线性化，转化至毕赤酵母出发菌株中，得到毕赤酵母工程菌；
(3)在步骤(2)的毕赤酵母工程菌的基础上，将PAS_chr1 4_0178基因和/或PAS_chr22_0267基因，以及，三酰甘油脂肪酶TAG基因分别整合至毕赤酵母基因组中性位点PNSI 2、PNSII 5或PNSI 6，利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，构建得到耐受甲醇的高产α 亚麻酸的毕赤酵母工程菌。
8.权利要求1～6任一项所述的耐受甲醇的高产α 亚麻酸的毕赤酵母工程菌在高产α亚麻酸中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述耐受甲醇的高产α 亚麻酸的毕赤酵母工程菌在高浓度甲醇发酵生产α 亚麻酸中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述耐受甲醇的高产α 亚麻酸的毕赤酵母工程菌在高浓度甲醇非灭菌发酵生产α 亚麻酸中的应用。
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种耐受甲醇的高产α 亚麻酸的毕赤酵母工程菌及其构建方法和在高浓度甲醇非灭菌发酵生产α 亚麻酸中的应用。
背景技术
α 亚麻酸(α Linolenicacid，α LA，ALA)是一种多不饱和脂肪酸。它是一种重要的脂肪酸，属于ω 3系列脂肪酸，是人体无法自行合成的必需脂肪酸之一，必须通过饮食获取。α 亚麻酸在人体内转化为长链ω 3多不饱和脂肪酸，例如二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，这些脂肪酸对心血管健康、神经系统功能、炎症反应和免疫系统等起到重要作用。
巴斯德毕赤酵母(Komagataellaphaffii，K.phaffii)(简称毕赤酵母)能够利用甲醇作为唯一的碳源，具有较成熟的蛋白分泌表达系统和较高的生物合成能力。通过代谢工程改造，可以将合成α 亚麻酸的合成途径引入毕赤酵母中，使其作为细胞工厂合成α 亚麻酸，为人类获得重要的ω 3脂肪酸提供了一种替代途径，在食品、医药和保健品等领域具有良好的应用前景。
微生物培养采用非灭菌发酵技术，可以省去消毒设备和灭菌过程，操作复杂性降低，发酵过程更为简便，降低能耗和生产周期，提升了生产效率，从而降低生产成本。并且，非灭菌发酵过程易于放大，有利于大规模生产，推动低碳绿色制造。这些优势使得非灭菌发酵在亚麻酸等高附加值化合物的微生物法生产中具有广阔的应用前景。当前，Cordovaetal(2018年)等用解脂耶氏酵母用分批补料发酵的方式生产α 亚麻酸最高产量为1.4g/L；Gaoetal(2022年)等用多形汉逊酵母用分批补料发酵的方式生产游离脂肪酸最高产量为15.9g/L。而以甲醇为碳源用非灭菌发酵的生产α 亚麻酸目前没有报道。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种耐受甲醇的高产α亚麻酸的毕赤酵母工程菌及其构建方法和在高浓度甲醇非灭菌发酵生产α 亚麻酸中的应用。
本发明先构建高耐受甲醇菌株GS115 PET2 PSA 0178 0267(S33)，再以此为底盘，通过引入α 亚麻酸合成的途径，构建高产α 亚麻酸的细胞工厂，最终实现高浓度甲醇非灭菌发酵生产α 亚麻酸。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明为了提高毕赤酵母甲醇耐受能力，在毕赤酵母中筛选了膜磷脂相关基因，构建并优化磷脂酰胆碱合成的途径，并整合了甲醇耐受的膜相关关键基因。得到可利用高甲醇的多株工程菌株，选择在高甲醇浓度培养基中生存能力佳的工程菌(如S33)作为底盘菌株进一步构建，来生产α 亚麻酸。
一种耐受甲醇的高产α 亚麻酸的毕赤酵母工程菌，是对毕赤酵母出发菌株进行以下操作后得到：
(a)过表达磷脂酰乙醇胺N 甲基转移酶PET2基因、二酰基甘油 丝氨酸磷脂酰转移酶PSA基因、PAS_chr1 4_0178基因和PAS_chr2 2_0267基因中的至少一种；和，
(b)过表达三酰甘油脂肪酶TAG基因。
其中，上述基因都是毕赤酵母(K.phaffii)GS115的内源基因；
磷脂酰乙醇胺N 甲基转移酶PET2的GenBank号为XP_002493092.1，其编码基因的GenBank号为XM_002493047.1；
二酰基甘油 丝氨酸磷脂酰转移酶PSA的GenBank号为XP_002490079.1，其编码基因的GenBank号为XM_002490034.1；
PAS_chr1 4_0178的GenBank号为XP_002490293.1，其编码基因的GenBank号为XM_002490248.1；
PAS_chr2 2_0267的GenBank号为XP_002491926.1，其编码基因的GenBank号为XM_002491881.1；
三酰甘油脂肪酶TAG的GenBank号为XP_002491374.1，其编码基因的GenBank号为XM_002491329.1。
进一步的，所述毕赤酵母出发菌株为毕赤酵母(K.phaffii)GS115。[0019]进一步的，上述基因利用启动子AOX1或GAP构建基因表达盒；具体的，PET2基因、PAS_chr1 4_0178基因、PAS_chr2 2_0267基因、TAG基因均由启动子AOX1诱导表达；PSA基因由启动子GAP调控表达。
其中，所述启动子AOX1或GAP为来源于毕赤酵母的启动子AOX1或GAP；
进一步的，所述PAS_chr1 4_0178基因用中性位点PNSI 2进行整合，所述PAS_chr2 2_0267基因用中性位点PNSII 5进行整合，所述TAG基因用中性位点PNSI 6进行整合。
在本发明的一种实施例方式中，在中性位点PNSI 2、PNSII 5或PNSI 6整合时，利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行整合。
上述耐受甲醇的高产α 亚麻酸的毕赤酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)将磷脂酰乙醇胺N 甲基转移酶PET2基因和/或二酰基甘油 丝氨酸磷脂酰转移酶PSA基因连接至表达载体上，得到重组表达载体；
(2)将步骤(1)获得的重组表达载体线性化，转化至毕赤酵母出发菌株中，得到毕赤酵母工程菌；
(3)在步骤(2)的毕赤酵母工程菌的基础上，将PAS_chr1 4_0178基因和/或PAS_chr2 2_0267基因，以及，三酰甘油脂肪酶TAG基因分别整合至毕赤酵母基因组中性位点PNSI 2、PNSII 5或PNSI 6，利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，构建得到耐受甲醇的高产α亚麻酸的毕赤酵母工程菌。
进一步的，所述的毕赤酵母基因组中性位点PNSI 2、PNSII 5或PNSI 6在文献“Peng C,Xingpeng D,Xiaoyan W,et al.Recombination machinery engineering facilitates metabolic engineering of the industrial yeast Pichiapastoris[J].Nucleic Acids Research(13):13.DOI:https://doi.org/10.1093/nar/gkab535.”中公开；
进一步的，所述PET2基因、PAS_chr1 4_0178基因、PAS_chr2 2_0267基因或TAG基因均利用启动子AOX1构建基因表达盒；所述PSA基因利用启动子GAP构建基因表达盒。
进一步的，步骤(1)中，表达载体为毕赤酵母表达载体，包括但不限于pPICZA,B,C载体、pGAPZA,B,C载体等。
进一步的，步骤(2)中，毕赤酵母出发菌株为毕赤酵母(K.phaffii)GS115，但不限于此。
上述耐受甲醇的高产α 亚麻酸的毕赤酵母工程菌在高产α 亚麻酸中的应用；
进一步的，所述耐受甲醇的高产α 亚麻酸的毕赤酵母工程菌在高浓度甲醇发酵生产α 亚麻酸中的应用。
更进一步的，所述耐受甲醇的高产α 亚麻酸的毕赤酵母工程菌在高浓度甲醇非灭菌发酵生产α 亚麻酸中的应用。
优选的，所述高浓度甲醇为5～8％初始甲醇浓度；进一步优选为5％初始甲醇浓度。
非灭菌发酵的培养基为BSM改良发酵培养基：0.5％(w/v)酵母提取物，1％(w/v)蛋白胨，磷酸26.7g/L，二水合硫酸钙0.93g/L，硫酸钾18.2g/L，七水硫酸镁14.9g/L，氢氧化钾4.13g/L，甘油40.0g/L，5％(v/v)甲醇，加入4.35mL/L已除菌过滤的PTM1微量元素溶液。
PTM1微量盐溶液(PTM1TraceSalts)：五水硫酸铜6.0g/L，碘化钠0.08g/L，一水硫酸锰3.0g/L，二水钼酸钠0.2g/L，硼酸0.02g/L，氯化钴0.5g/L，氯化锌20.0g/L，七水硫酸亚铁65.0g/L，生物素0.2g/L，硫酸5.0mL/L，用纯水定容，过滤除菌，常温保存。
补料所用的诱导培养基：50％(v/v)甘油，5％(v/v)甲醇，添加12mL/LPTM1。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明在毕赤酵母中筛选了膜磷脂相关基因，利用代谢工程和组学分析技术，构建并优化磷脂酰胆碱合成的途径，并过表达三酰甘油脂肪酶TAG基因，得到耐受甲醇的高产α 亚麻酸的毕赤酵母工程菌株。本发明得到的高产α 亚麻酸的毕赤酵母工程菌株具有重要的理论和实际意义，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为α 亚麻酸(ALA)代谢途径的示意图。
图1
图2为非灭菌发酵下摇瓶水平(液体或平板)的杂菌情况。
图2
图3为工程菌S12，S31 S33在6％、8％、10％甲醇浓度的BMMY液体培养基中的生长状态。
图3
图4为工程菌34在ALA非灭菌发酵发酵过程中的产量和生物量。
图4
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。为了使本发明的目的、技术方案及效果更加清晰，下面结合附图和具体的实施例对本发明进行详细说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应当视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。
α 亚麻酸(ALA)代谢途径的示意图如图1所示。
实施例一
高耐甲醇毕赤酵母底盘菌株的构建
双表达核：pPICZA PET2 PSA；
(1)PSA和PET2基因片段来源于K.phaffiiGS115，其中，PSA基因的GenBank号为XM_002490034.1，PET2基因的GenBank号为XM_002493047.1；上述基因使用引物如下：
PSA F：5' ATGGCTTCTAAGAGGACCTCA 3'；
PSA R：5' TCAAGGTTTAGGTATTTTGAGAC 3'；
PET2 F：5' ATGGCTGATCGACTTGTTTC 3'；
PET2 R：5' CTACAAACTCTTTTTCTTCTTTT 3'；
用于构建组成型单表达核克隆载体PSA和PET2带同源臂基因片段所用特异引物分别为：
P PSA F：5' aacaactatttcgaaacgaggaattcATGGCTTCTAAGAGGACCTCA 3'；
P PSA R：5' tttttgttcgggcccaagctggcggccgcTCAAGGTTTAGGTATTTTG 3'；P PET2 F：5' aactaattattcgaaacgaggaattcATGGCTGATCGACTTGTTTC 3'；
P PET2 R：5' tttttgttcgggcccaagctggcggccgcCTACAAACTCTTTTTCTTCT 3'；其中，下划线部分gaattc为EcoRI酶切位点，下划线部分gcggccgc为NotI酶切位点。
(2)重组质粒pGAPZA PSA和pPICZA PET2的构建：pPICZA和pGAPZA载体分别用EcoRI和NotI于37℃双酶切2h，酶切胶回收产物分别与PSA和PET2带同源臂基因片段用同源重组酶在50℃金属浴中连接15min，分别将连接产物转化至EscherichiacoliTOP10F’感受态细胞中，涂布在30ng/mL博莱霉素抗性平板上，待长出单菌落后筛选正确的转化子提质粒并测序，所构重组质粒命名为pGAPZA PSA和pPICZA PET2。
(3)重组质粒pPICZA PET2 PSA的构建：
1)PGAP PSA TAOX1基因片段的扩增及回收：用引物GAP F/AOX R，分别获得PGAP PSATAOX1基因片段，并利用琼脂糖凝胶试剂盒进行纯化回收。
GAP F：5' TTTTTGTAGAAATGTCTTGGTG 3'；
AOX R：5' TCTCACTTAATCTTCTGTACTCT 3'。
2)pPICZA PET2载体用BglII于37℃单酶切2h，酶切胶回收产物与PGAP PSA TAOX1用同源重组酶在50℃金属浴中连接30min，将连接产物转化至E.coliTOP10F’感受态细胞中，涂布在30ng/mL博莱霉素抗性平板上，待长出单菌落后筛选正确的转化子提质粒并测序，所构重组质粒命名为pPICZA PET2 PSA。
(4)工程菌S12的构建及验证：将所构建的质粒pPICZA PET2 PSA，用PmeI(gtttaaac)酶37℃线性化1h后，将线性化产物电转到毕赤酵母GS115中，涂布在100ng/mL博莱霉素的YPD平板上于30℃培养，待长出单菌落后用引物2 YZ PSA F/YZ PET2 R筛选转化子，所得琼脂糖凝胶电泳条带大小为2043bp，与理论一致，表明PET2、PSA基因成功过表达。
2 YZ PSA F：5' GCCGATCTGATTTCATTTGG 3'；
YZ PET2 R：5' GTATCTGAACACTGGATCAG 3'。
(5)在S12菌株中过表达基因PAS_chr2 2_0267(GenBank号为XM_002491881.1)和/或PAS_chr1 4_0178(GenBank号为XM_002490248.1)，GS115 PET2 PSA 0178(S31)，GS115PET2 PSA 0267(S32)，GS115 PET2 PSA 0267 0178(S33)。
工程菌S31(GS115 PET2 PSA 0178)、S32(GS115 PET2 PSA 0267)的构建及验证：将S12菌株做成感受态细胞，参考Cai等人方法(本载体系统相关信息已经发表，Peng C,Xingpeng D,Xiaoyan W,et al.Recombination machin ery engineering facilitates metabolic engineering of the industrial yeast Pichiapa storis[J].Nucleic Acids Research(13):13.DOI:https://doi.org/10.1093/nar/gkab535.)，构建含有GS115基因组中性位点PNSI 2(GGTTGGTACTATGTCCAACACGG)的上下游同源臂各1kb的质粒pPICZA PNSI 2up PNSI 2down(命名为质粒PNSI 2 HA，出发质粒为pPICZA；其中，上游同源臂1kb插入至ori元件与AOX1启动子之间，下游同源臂1kb插入至AOX1terminator与TEF1promoter之间)，同理，构建含有GS115基因组中性位点PNSII 5(AACTTTGAAACAAAAGAAGGAGG)的上下游同源臂各1kb的质粒pPICZA PNSII 5up PNSII 5down(命名为质粒PNSII 5 HA，出发质粒是pPICZA；其中，上游同源臂1kb插入至ori元件与AOX启动子之间，下游同源臂1kb插入至AOX1terminator与TEF1promoter之间)；将质粒PNSI 2 HA和质粒PNSII 5 HA分别用EcoRI和NotI于37℃双酶切2h，酶切胶回收产物与PAS_chr1 4_0178和PAS_chr2 2_0267带同源臂基因片段(PAS_chr1 4_0178带同源臂基因片段是以毕赤酵母GS115基因组为模板，利用P 0178 F/P 0178 R获得的；PAS_chr2 2_0267基因片段是以毕赤酵母GS115基因组为模板，利用P 0267 F/P 0267 R获得的)用同源重组酶在50℃金属浴中连接15min，分别将连接产物转化至EscherichiacoliTOP10F’感受态细胞中，涂布在30ng/mL博莱霉素抗性平板上，待长出单菌落后筛选正确的转化子提质粒并测序，所构重组质粒分别命名为PNSI 2 HA 0178和PNSII 5 HA 0267，通过PCR获得PNSI 2up PAOX1 0178TAOX1 PNSI 2down盒和PNSII 5up PAOX1 0267 TAOX1 PNSII 5down盒。将1500ngCas9 gRNACRISPR Cas9质粒(即pPICZ Cas9 gPNSI 2质粒或pPICZ Cas9 gPNSII 5质粒)与3000ngDonor：PNSI 2up PAOX1 0178 TAOX1 PNSI 2down盒或PNSII 5up PAOX1 0267 TAOX1 PNSII5down盒通过电击转化，在S12菌株中进行基因组整合。将转化菌在含抗生素(遗传霉素)的YPD平板上培养3天，待长出单菌落后用引物YZ PNSI_2 F/YZ 0178 R筛选转化子，所得琼脂糖凝胶电泳条带大小为1971bp，与理论一致，表明PAS_chr1 4_0178基因成功过表达，即工程菌S31构建成功。待长出单菌落后用引物YZ PNSII_5 F/YZ 0267 R筛选转化子，所得琼脂糖凝胶电泳条带大小为2146bp，与理论一致，表明PAS_chr2 2_0267基因成功过表达，即工程菌S32构建成功。
YZ PNSI_2 F：5' TGGACGCTTATAGCTGTAC 3'；
YZ 0178 R：5' TATTGTACTGTTGTTGCGACTGG 3'；
YZ PNSII_5 F：5' CCATGGCAGAACCGATAGTCA 3'；
YZ 0267 R：5' TTTATCAAATCCAGGAGGCAG 3'；
P 0178 F：5' caactaattattcgaaacgaggaattcATGGCTAGCATATATTTAAACAA 3'；
P 0178 R：5' tttttgttcgggcccaagctggcggccgcCTAATTCTTTCTGGCAGCAGGCG 3'；
P 0267 F：5' aaaaacaactaattattcgaaacgaggaattcATGGAAAGACTTTCACAACTAAGA3'；
P 0267 R：5' tttttgttcgggcccaagctggcggccgcCTATTCTCTAGCAAACACTGCTG 3'。
其中，pPICZ Cas9 gPNSI 2质粒在文献“Peng C,Xingpeng D,Xiaoyan W,et al.Recombination machinery engineering facilitates metabolic engineering of the industrial yeast Pichiapastoris[J].Nucleic Acids Research(13):13.DOI:https://doi.org/10.1093/nar/gkab535.”中公开。
pPICZ Cas9 gPNSII 5质粒是根据文献“Peng C,Xingpeng D,Xiaoyan W,etal.Recombination machinery engineering facilitates metabolic engineering of the industrial yeast Pichiapastoris[J].Nucleic Acids Research(13):13.DOI:https://doi.org/10.1093/nar/gkab535.”中pPICZ Cas9 gPNSI 2质粒的构建方法构建得到。
工程菌S33(GS115 PET2 PSA 0178 0267)的构建及验证：将S31菌株做成感受态细胞，将1500ngCas9 gRNACRISPR Cas9质粒(即pPICZ Cas9 gPNSII 5质粒)与3000ngDonor：PNSII 5up PAOX1 0267 TAOX1 PNSII 5down盒通过电击转化，在S31菌株中进行基因组整合。将转化菌在含抗生素(遗传霉素)的YPD平板上培养3天，待长出单菌落后用引物YZPNSII_5 F/YZ 0267 R筛选转化子，所得琼脂糖凝胶电泳条带大小为2146bp，与理论一致，表明PAS_chr2 2_0267基因成功过表达，即工程菌S33构建成功。
实施例二
工程菌S12，S31 S33的甲醇耐受性验证
分别取工程菌S12，S31 S33一个单克隆接种至YPD培养基中，30℃，200r/m震荡培养72h。取YPD液体培养基活化后的菌液，离心(5000rpm，5min)，去上清液，并用无菌生理盐水洗涤两次，离心(5000rpm，5min)，收集菌体，以巴斯德毕赤酵母GS115作为对照；工程菌S12，S31 S33的菌体分别接种在6％、8％、10％甲醇浓度的BMMY液体培养基中30℃，200r/m震荡培养(初始OD600＝1)，在菌株培养的过程中，取样检测菌株的生长情况即OD600。采用比色法进行测定，取1mL发酵液于1.5mL离心管中，离心(5000rpm，5min)，去上清液，用生理盐水洗涤后，重悬酵母细胞，稀释适当的倍数后，采用紫外分光光度计在600nm下用0.5cm光径的比色皿测定吸光度，再乘以相应的稀释倍数即为酵母的OD600，测定GS115，S12，S31 S33在6％、8％、10％甲醇浓度的BMMY液体培养基的生长状态，结果见图3；GS115，S12，S31 S33的最高OD600分别为0.96，7.18，15.34，17.15，18.4；0.96，7.05，8.34，11.49，14.24；0.97，8.08，11.65，11.07，14.93。可见，工程菌S12，S31 S33在6％、8％、10％甲醇浓度条件下的BMMY液体培养基的生长状态明显优于GS115，在高甲醇浓度培养基中均具有比较好的生存能力，其中工程菌S33的生存能力最佳。
实施例三
α 亚麻酸(ALA)代谢途径构建过程：
由于工程菌S33的生存能力最佳，以S33菌株为例，作为底盘菌株构建α 亚麻酸工程菌(GS115 PET2 PSA 0178 0267 TAG)(以工程菌S12，S31和S32分别作为底盘菌株构建α亚麻酸工程菌的构建方式同理)：
将S33菌株做成感受态细胞，构建含有GS115基因组中性位点PNSI 6(GACCCCGTAATAATCGACGT)的上下游同源臂各1kb的质粒pPICZA PNSI 6up PNSI 6down(命名为质粒PNSI 6 HA，出发质粒是pPICZA；其中，上游同源臂1kb插入至ori元件与AOX启动子之间，下游同源臂1kb插入至AOX1terminator与TEF1promoter之间)，将质粒PNSI 6 HA用EcoRI和NotI于37℃双酶切2h，酶切胶回收产物与TAG带同源臂基因片段(TAG带同源臂基因片段是以毕赤酵母GS115基因组为模板，利用P TAG F/P TAG R获得的)用同源重组酶在50℃金属浴中连接15min，分别将连接产物转化至EscherichiacoliTOP10F’感受态细胞中，涂布在30ng/mL博莱霉素抗性平板上，待长出单菌落后筛选正确的转化子提质粒并测序，所构重组质粒命名为PNSI 6 HA TAG，通过PCR获得PNSI 6up PAOX1 TAG TAOX1 PNSI 6down盒。将1500ngCas9 gRNACRISPR Cas9质粒(即pPICZ Cas9 gPNSI 6质粒)与3000ngDonor：PNSI 6up PAOX1 TAG TAOX1 PNSI 6down盒通过电击转化，在S33菌株中进行基因组整合。将转化菌在含抗生素(遗传霉素)的YPD平板上培养3天，待长出单菌落后用引物YZ PNSI 6 F/YZTAG R筛选转化子，所得琼脂糖凝胶电泳条带大小为2484bp，与理论一致，表明TAG基因成功过表达，即α 亚麻酸工程菌构建成功，即GS115 PET2 PSA 0178 0267 TAG，并将GS115PET2 PSA 0178 0267 TAG记为工程菌S34。
YZ PNSI 6 F：5' TGGTTTTTCCCCTTGAACCTGTTGG 3'；
YZ TAG R：5' ATTGTCTTCACTTGCCAGTATG 3'；
P TAG F：5' aactaattattcgaaacgaggaattcATGAACTTATTTGGAGCAGTCACAG 3'；
P TAG R：5' ttttgttcgggcccaagctggcggccgcTTATTTATGATTCTTGGGACCC 3'；其中，pPICZ Cas9 gPNSI 6质粒在文献“Peng C,Xingpeng D,Xiaoyan W,et al.Recombination machinery engineering facilitates metabolic engineeringof the industrial yeast Pichiapastoris[J].Nucleic Acids Research(13):13.DOI:https://doi.org/10.1093/nar/gkab535.”中公开。
实施例四
α 亚麻酸工程菌非灭菌发酵
α 亚麻酸工程菌S34通过摇瓶水平确定非灭菌发酵的最低初始甲醇浓度。在2％，3％，4％，5％(v/v)初始甲醇浓度下的BMMY培养基中培养α 亚麻酸工程菌S34。根据发酵结果发现，在发酵的24h，甲醇初始浓度为5％时，没有染杂菌，并且细胞可以正常生长(图2)。因此，通过摇瓶水平确定了非灭菌工艺中抑菌甲醇浓度为5％。
由于工程菌S12，S31和S32其可以在6％ 8％甲醇浓度下生长，因此同样可作为底盘菌株构建α 亚麻酸工程菌，即GS115 PET2 PSA TAG、GS115 PET2 PSA 0178 TAG、GS115PET2 PSA 0267 TAG，其同样可以在甲醇浓度为5％条件下的非灭菌工艺中进行摇瓶发酵，没有杂菌并细胞可正常生长。
在发酵罐水平添加5％的初始甲醇浓度，对α 亚麻酸工程菌进行非灭菌发酵。挑取YPD平板中生长良好且验证正确的毕赤酵母单菌落，接种于YPD培养基中进行菌种活化，30℃、250rpm培养24 48h后，按5％(v/v)接种量转接于YPD培养基(500mL锥形瓶中放50mL培养基)，30℃、250rpm培养20h后获得的二级种子液进行5L发酵罐非灭菌发酵。将二级种子液以10％接种量接种到发酵罐中，初始控制条件为：温度为30℃，pH5.5，通气量4L/min，转速400r/min。适应期后，采用溶氧转速联动控制使溶氧维持在30 40％，转速范围400 1200r/min。为避免底料中甘油消耗殆尽及甲醇挥发，发酵至30h，开始补料。控制条件为温度30℃、pH5.5、通气量4 8L/min、转速400 1200r/min，匀速补料8g/h，控制溶氧在20 30％以上；发酵48h，提升补料速度至9g/h。发酵72h后，由于产物十分粘稠且伴随氧化，即可结束发酵。其中，工程菌34在58h的OD600达到最高108.28，最高α 亚麻酸的含量可以达到72.72g/L(图4)。
发酵罐非灭菌发酵所用的培养基为BSM改良发酵培养基：0.5％(w/v)酵母提取物，1％(w/v)蛋白胨，磷酸26.7g/L，二水合硫酸钙0.93g/L，硫酸钾18.2g/L，七水硫酸镁14.9g/L，氢氧化钾4.13g/L，甘油40.0g/L，5％(v/v)甲醇，加入4.35mL/L已除菌过滤的PTM1微量元素溶液。PTM1微量盐溶液(PTM1TraceSalts)：五水硫酸铜6.0g/L，碘化钠0.08g/L，一水硫酸锰3.0g/L，二水钼酸钠0.2g/L，硼酸0.02g/L，氯化钴0.5g/L，氯化锌20.0g/L，七水硫酸亚铁65.0g/L，生物素0.2g/L，硫酸5.0mL/L，用纯水定容，过滤除菌，常温保存。
补料所用的诱导培养基：50％(v/v)甘油，5％(v/v)甲醇，添加12mL/LPTM1。其中，发酵液中α 亚麻酸的含量采用高效液相色谱进行检测，检测条件如下：谱柱：WastersBEH C8,2.1×0mm,1.7μm，柱温：40℃，流动相：A水(0.1％甲酸+5mM乙酸铵)+B乙腈[45+55，体积比]，流速：0.4mL/min，进样量：5μL，自动进样器温度/TEM：15℃。质谱采集参数：离子源类型：ESI，模式：SIMm/z＝277.2极性：负，离子源温度：350℃，雾化气流速、压力：10L/min，45psi，毛细管电压：3500V，Fragmentor：140V。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
文章摘自国家发明专利，一种耐受甲醇的高产α-亚麻酸的毕赤酵母工程菌及其构建方法和应用，韩双艳，王帅，滕飞，林影，梁书利，郑穗平，申请号，202410884232.1，申请日，2024.07.03。
