摘 要：本发明属于中药活性提取物制备领域，具体涉及一种罗布麻叶提取物及其制备方法和应用，其中，罗布麻叶提取物为罗布麻叶Fr.BuOH部位提取物或者利用40％乙醇(v/v)洗脱Fr.BuOH部位得到的Fr.BuOH-40％部位提取物；其活性组分包括金丝桃苷和异槲皮苷。本发明进一步针对罗布麻叶进行二次开发，通过活性导向的提取分离方法，找到两个活性部位Fr.BuOH和Fr.BuOH-40％，其中金丝桃苷和异槲皮苷的总含量高；基于斑马鱼评价模型，这两个活性部位对盐酸维拉帕米诱导的心脏损伤(心包水肿和静脉淤血)具有显著的改善用，并且相同浓度下，与市售复方丹参滴丸的功效相当。
技术领域
本发明属于中药活性提取物制备领域，具体涉及一种罗布麻叶提取物及其制备方法和应用。
背景技术
罗布麻(Apocynum venetum L.)是夹竹桃科罗布麻属亚灌木，2020版《中国药典》记载，罗布麻叶甘、苦，凉，归肝经，具有“平肝安神，清热利水”之功效，主要用于治疗“肝阳眩晕，心悸失眠，浮肿尿少”，即现代医学用语中的高血压病。现已批准的55个含有罗布麻叶的中成药的主要功效也以降血压为主，对于罗布麻叶及提取物的活血化瘀作用未有相关报道。
《中国药典》规定罗布麻叶的指标成分为金丝桃苷，又名槲皮素?3?O?β?D?吡喃半乳糖苷，具有较广泛的心血管相关活性报道。此外，金丝桃苷的同分异构体异—槲皮苷(槲皮素?3?O?β?D?吡喃葡萄糖苷)，也表现出广泛的心血管活性。金丝桃苷和异槲皮苷二者的母核均为槲皮素，而前者的糖取代基是吡喃半乳糖，后者的糖取代基是吡喃葡萄糖。中国专利CN111150741A公开了金丝桃苷减轻人主动脉内皮细胞损伤的医药用途，提供了金丝桃苷单用或与其他药物联用在制备预防和治疗氧化低密度脂蛋白诱导人主动脉内皮细胞损伤引起的动脉粥样硬化、心绞痛、心力衰竭和高血压疾病的药物中的应用。中国专利CN106474139A公开了一种用于肺源性心脏病缓解期的片剂及其制备方法，其中，片剂主要由珊瑚菜素、中美菊素C、丹参酮、薏苡素、金丝桃苷、岩白菜素、葛根素、甘草甜素、隐黄素、芸香苷、茯苓多糖、岩藻糖、N?乙酰氨基葡萄糖、儿茶素成分组成，针对肺源性心脏病缓解期的治疗能起到预防感染、控制心律失常和心力衰竭的作用，同时可以抵抗诱发因素，增强患者肌体的免疫能力，预防复发，加快患者心肺功能恢复来减缓精神负担。现有研究中，还未有针对罗布麻叶提取物的活血化瘀及心脏保护等方面的研究。
大量文献表明，斑马鱼模型在筛选心脏保护活性成分方面具有独特优势，斑马鱼心脏在结构、功能、信号通路和离子通道方面与人类心脏高度相似；血脂组成、代谢与人类的基本一致；且胚胎及其幼体近乎透明，心血管可视，可活体观察心跳、血管形成和血管病变。
基于此，本发明制备一种罗布麻叶提取物，并采用盐酸维拉帕米诱导斑马鱼心脏损伤模型，验证罗布麻叶提取物及其主要单体化学成分在改善药物引起的心包水肿和静脉淤血方面的作用功效，为其临床应用提供科学依据。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了一种罗布麻叶提取物及其制备方法和应用，进一步针对罗布麻叶进行二次开发，通过活性导向的提取分离方法，找到两个活性部位Fr.BuOH和Fr.BuOH?40％，其中金丝桃苷和异槲皮苷的总含量高；基于斑马鱼评价模型，这两个活性部位对盐酸维拉帕米诱导的心脏损伤(心包水肿和静脉淤血)具有显著的改善作用，与罗布麻叶总提取物的活性要好很多，并且相同浓度下，优于单体一化学成分金丝桃苷或异槲皮苷，且与市售复方丹参滴丸的功效相当。
本发明的技术方案是：
本发明保护罗布麻叶提取物在制备预防和/或改善和/或治疗心脏损伤的药物中的应用。
进一步的，所述应用包括如下任一种或几种：
(1)制备预防和/或改善和/或治疗心包水肿的药物；
(2)制备预防和/或改善和/或治疗静脉淤血的药物；
(3)制备预防和/或改善和/或治疗盐酸维拉帕米诱导的心包水肿或静脉淤血的药物；
(4)制备预防和/或改善和/或治疗盐酸维拉帕米诱导的斑马鱼心脏损伤模型症状 的药物。
本发明还保护所述的罗布麻叶提取物，所述罗布麻叶提取物为罗布麻叶Fr.BuOH部位提取物；其活性组分包括金丝桃苷和异槲皮苷。优选地，所述罗布麻叶提取物为利用40％乙醇(v/v)洗脱Fr.BuOH部位得到的Fr.BuOH-40％部位提取物。
进一步的，所述的罗布麻叶提取物的制备方法，包括如下步骤：
干燥的罗布麻叶粉碎过筛，按照液料比(8～10)：1的比例加入95％乙醇，超声提取2～4次，每次提取50～70min，合并滤液后减压浓缩，得到Fr.95％EtOH提取部位；将Fr.95%EtOH提取部位充分分散于水中，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到Fr.EtOAC部位、Fr.BuOH部位和Fr.H2O部位；利用40％乙醇(v/v)洗脱Fr.BuOH部位，得到Fr.BuOH-40％提取部位。
本发明还保护一种预防和/或改善和/或治疗心脏损伤的中药组合物，其活性成分为所述的罗布麻叶提取物或者采用所述的制备方法制得的罗布麻叶提取物。
本发明还保护所述的罗布麻叶提取物在制备心脏保护药物或者活血祛瘀药物中的应用。
进一步的，所述应用包括如下任一种或几种：
(1)制备活血祛瘀的中药药物；
(2)制备具有心脏保护作用的中药药物。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过活性导向的提取分离方法，发现了罗布麻叶的2个活性部位 Fr.BuOH和Fr.BuOH-40％，并通过斑马鱼评价模型发现，这两个活性部位提取物可以显著改善盐酸维拉帕米诱导的心脏损伤，拓展了罗布麻叶的应用范围。 (2)Fr.BuOH亚部位和Fr.BuOH-40％亚部位中活性成分金丝桃苷和异槲皮苷的总 含量分别为20.41％和36.81％，比95％EtOH部位分别提高了7.21倍和13.01倍，且远高于药典规定的金丝桃苷0.3％的含量标准。
(3)本发明基于斑马鱼评价模型验证了Fr.BuOH和Fr.BuOH-40％两个活性部位对 盐酸维拉帕米诱导的心脏损伤(具体是心包水肿和静脉淤血)具有显著的改善作用，比罗布麻叶95％乙醇总提取物和单一成分金丝桃苷或异槲皮苷的活性要好很多；并且在相同浓度下，本发明罗布麻叶提取物的活性与市售复方丹参滴丸的功效相当，未来可用来开发相关的活血祛瘀类中药新药。
附图说明
图1为罗布麻叶不同极性部位的HPLC色谱图(检测波长为280nm)，其中，部位A：Fr.95% EtOH；部位B：Fr.BuOH部位；C：Fr.BuOH-40％部位；
图1
图2为金丝桃苷标准曲线图；
图2
图3为罗布麻叶Fr.BuOH部位对斑马鱼存活率、心包水肿和静脉淤血面积改善功效评价实验结果；
图3
图4为罗布麻叶Fr.BuOH-40％部位对斑马鱼存活率、心包水肿和静脉淤血面积改善功效评价实验结果；
图4
图5为罗布麻叶Fr.BuOH部位、Fr.BuOH-40％部位、金丝桃苷和异槲皮苷的活性比较。
图5
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本发明，将结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
罗布麻叶提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1) 活性部位的提取制备
罗布麻叶自然晾干，粉碎后过50目筛，取100g干粉用95％乙醇超声提取2次(频率40KHz)，每次60min，液料比为10：1，8：1，合并滤液后，减压浓缩，回收溶剂，得12.02g乙醇提取物(即Fr.95％EtOH部位)，提取率为12.02％。
将上述Fr.95％EtOH部位充分分散于500mL蒸馏水中，依次用乙酸乙酯和正丁醇溶液萃取，减压浓缩，回收溶剂得2.68g乙酸乙酯提取物(即Fr.EtOAC部位)，2.51g正丁醇提取物(即Fr.BuOH部位)。剩余6.7g水提取物(即Fr.H2部位)。
将上述Fr.BuOH部位在HP-20大孔吸附树脂柱上依次用蒸馏水、10％乙醇(v/v)、 20％乙醇(v/v)、30％乙醇(v/v)、40％乙醇(v/v)、60％乙醇(v/v)、80％乙醇(v/v)和100%乙醇(v/v)洗脱，减压浓缩，回收溶剂。最终验证得到40％乙醇(v/v)洗脱后的Fr.BuOH部位(即Fr.BuOH-40％部位)中活性最高，其质量为0.30g。
(2)活性部位的HPLC定性表征
准确称量Fr.95％EtOH部位、Fr.BuOH部位、Fr.BuOH-40％部位的样品各10mg，加入1mL体积的甲醇-水(v/v，60:40)溶解。以上样品均经0 .22μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液，与市售对照品溶液(绿原酸对照品、金丝桃苷对照品和异槲皮苷对照品)，进HPLC进行分析，进样体积为15μL。
设置HPLC色谱条件为：流动相为甲醇(A)和0.1％三氟乙酸水溶液(B)；5％～95%甲醇等梯度洗脱45min；柱温40℃。
如图1所示，HPLC定性表征结果显示，经与市售对照品对比后发现，罗布麻叶Fr.95％EtOH部位以绿原酸、金丝桃苷和异槲皮苷3个成分的相对含量最高，其HPLC保留时间分别为14.70min，23.04min，23.31min。Fr.BuOH部位中三个主成分的相对含量明显增多；而Fr.BuOH-40％部位基本无绿原酸，主要含金丝桃苷和异槲皮苷。
(3)活性部位主要成分定量检测
由于金丝桃苷和异槲皮苷的母核完全一致，仅糖苷部分不同，是一对同分异构体。二者在常规HPLC色谱柱无法有效分离。本部分以金丝桃苷为标准品计算金丝桃苷和异槲皮苷两个主要化学成分的总含量。
首先绘制标准曲线，精密称取金丝桃苷对照品5.00mg，置5m容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀即得1000μg/mL储备液。用甲醇稀释，获得7种浓度样品，分别为50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，300μg/mL，400μg/mL，600μg/mL，800μg/mL，在步骤(2)的HPLC色谱条件下，进样10μL，记录色谱峰面积。以浓度值(μg/mL)为横坐标，以峰面积(mAU)为纵坐 标，绘制金丝桃苷对照品标准曲线。
HPLC定量结果发现：金丝桃苷进样量在0.5～8.0μg范围内有良好的线性关系，回归方程：Y＝28964X-932918，R2＝0.9999。标准曲线见图2。Fr.95％EtOH部位、Fr.BuOH部位、Fr.BuOH-40％部位中金丝桃苷和异槲皮苷总的百分含量分别为：2.83％，20.41％，36.81%(见表1)。
表1罗布麻叶不同提取部位中金丝桃苷的含量
试验例1斑马鱼对Fr.BuOH部位、Fr.BuOH-40％部位、金丝桃苷和异槲皮苷的最大耐受浓度
选取受精2dpf且发育正常的野生型AB品系斑马鱼幼鱼于6孔板，每孔30尾，分别加入用DMSO溶解的样品，其中，Fr.BuOH组的终浓度分别为：2500、2000、1500、1000、500、250、125μg/mL；Fr.BuOH-40％组的终浓度分别为：2000、1750、1000、750、500、250、125μg/mL，金丝桃苷组的终浓度分别为：2000、1500、1000、500、250、125、62.5μg/mL，异槲皮苷组的终浓度分别为：1000、900、800、700、600、500、400μg/mL。以斑马鱼实验用水作为对照组。将加药后的6孔板置于28.5℃培养箱中培养24h，观察并记录斑马鱼状态，统计其死亡率及畸形率 。
如图3A和图4A所示，Fr.BuOH部位、Fr.BuOH-40％部位的半数致死浓度(LC50)分别为：1621 .6μg/mL、937.2μg/mL。显微镜下观察各浓度下斑马鱼表型，Fr.BuOH部位1000μg/mL浓度下无斑马鱼死亡，但是全数斑马鱼头部，卵黄囊部位均出现不同程度的畸形，500μg/mL浓度下部分斑马鱼出现畸形。250μg/mL浓度及以下斑马鱼形态指标均表现正常。斑马鱼在Fr.BuOH-40％部位500μg/mL及以上浓度均出现不同程度的畸形与死亡，250μg/mL浓度及以下斑马鱼形态指标均表现正常。基于上述结果，将Fr.BuOH部位和Fr.BuOH-40％部位的最终给药浓度均控制在500μg/mL以内。同样的，基于上述结果，将试验例2和试验例3中Fr.BuOH部位和Fr.BuOH-40％部位的最终给药浓度均控制在500μg/mL以内。
在考察金丝桃苷和异槲皮苷的最大耐受浓度时，发现当金丝桃苷的给药浓度达到1500μg/mL，异槲皮苷的给药浓度达到800μg/mL时，6孔板中会出现药物析晶，但在此浓度下，金丝桃苷和异槲皮苷组的斑马鱼形态指标均表现正常。因此，在试验例2和试验例3中，将金丝桃苷和异槲皮苷的最终给药浓度需分别控制在1500μg/mL和800μg/mL以内。
试验例2 Fr.BuOH部位、Fr.BuOH-40％部位对斑马鱼心包水肿面积和静脉淤血面积的改善作用
设置两组独立实验，分别评价Fr.BuOH部位、Fr.BuOH-40％部位对斑马鱼心脏损伤的保护作用。选取受精2dpf且发育正常的野生型AB品系斑马鱼于6孔板，每孔30尾，每孔用实验用水定容至3mL。设置正常组、模型组、阳性药组，以及不同浓度的给药组。正常组仅用实验用水处理，模型组用20μg/mL盐酸维拉帕米处理20min，阳性药组首先用复方丹参滴丸水溶液(保持终浓度与给药组最大剂量一致)给药处理4h，然后加盐酸维拉帕米处理20min。给药组分别加入100μg/mL、50μg/mL浓度的Fr.BuOH部位和125μg/mL、62.5μg/mL浓度的 Fr.BuOH-40％部位，给药处理4h；除正常组外，再分别给各组加入盐酸维拉帕米处理20min。每组随机选取10尾斑马鱼，用甲基纤维素固定于载玻片上，调整为侧卧位使心房、心室充分暴露，在体视显微镜下进行白光拍照记录(放大倍数为5倍)。采用Image J软件分析斑马鱼心包水肿面积和静脉淤血面积。
如图3B和3C所示，与正常对照组相比，模型对照组斑马鱼的心包水肿和静脉淤血面积显著降低(P＜0.001，P＜0.001)，表明盐酸维拉帕米成功诱导斑马鱼心脏损伤。与模型组相比，Fr.BuOH部位在100μg/mL(P<0.05，P<0.05)和50μg/mL(P<0.01，P<0.05)浓度下对斑马鱼心包水肿面积和静脉淤血面积的改善效果显著，具有统计学差异。100μg/mL浓度的Fr.BuOH部位改善斑马鱼静脉淤血面积的作用效果优于同浓度下的阳性药复方丹参滴丸(P ＜0.05)，改善斑马鱼心包水肿面积的作用效果与同浓度的复方丹参滴丸相当(P＜0.05)。
如图4B和4C所示，与正常对照组相比，模型对照组斑马鱼的心包水肿和静脉淤血面积显著降低(P＜0.001，P＜0.001)，表明盐酸维拉帕米成功诱导斑马鱼心脏损伤。与模型组相比，Fr.BuOH-40％部位在125μg/mL(P<0.05，P<0 .05)和62.5μg/mL(P<0.01，P<0 .01)浓度下对斑马鱼心包水肿面积和静脉淤血面积的改善效果具有显著的统计学差异。125μg/mL浓度的BuOH-40％部位与同浓度下复方丹参滴丸作用相当；62.5μg/mL浓度的BuOH-40％部位对斑马鱼心脏损伤的作用效果明显优于125μg/mL浓度的阳性药复方丹参滴丸(P＜0.01， P＜0.01)。
试验例3 Fr.BuOH部位、Fr.BuOH-40％部位与单体化学成分金丝桃苷、异槲皮苷的活性差异
再设置1组独立实验，评价相同给药浓度下，Fr.BuOH部位、Fr.BuOH-40％部位与单体化学成分金丝桃苷、异槲皮苷改善斑马鱼心脏损伤作用效果的差异。
选取受精2dpf且发育正常的野生型AB品系斑马鱼于6孔板，每孔30尾，每孔用实验用水定容至3mL。设置正常组、模型组、阳性药组，以及不同浓度的给药组。正常组仅用实验用水处理；模型组用20μg/mL盐酸维拉帕米处理20min；阳性药组首先用100μg/mL的复方丹参滴丸水溶液给药处理4h，然后加盐酸维拉帕米处理20min；给药组分别加入100μg/mL浓度的Fr.BuOH部位、Fr.BuOH-40％部位、金丝桃苷和异槲皮苷，给药处理4h；除正常组外，再分别给各组加入盐酸维拉帕米处理20min。每组随机选取10尾斑马鱼，用甲基纤维素固定于载玻片上，调整为侧卧位使心房、心室充分暴露，在体视显微镜下进行白光拍照记录(放大倍数为5倍)。采用Image J软件分析斑马鱼心包水肿面积和静脉淤血面积。
如图5A和5B所示，与正常对照组相比，模型对照组斑马鱼的心包水肿和静脉淤血面积显著降低(P＜0.01，P＜0.001)，表明盐酸维拉帕米成功诱导斑马鱼心脏损伤。与模型组相比，100μg/mL浓度的Fr.BuOH部位(P＜0.05，P＜0.01)、Fr.BuOH-40％部位(P＜0.01，P ＜0.01)、金丝桃苷(P＜0.05)和异槲皮苷(P＜0.01，P＜0.01)对斑马鱼心包水肿面积和静 脉淤血面积的改善作用效果显著，除金丝桃苷组外均具有统计学意义。其中，Fr.BuOH部位、Fr.BuOH-40％部位的作用效果均显著优于金丝桃苷，且略强于异槲皮苷。以上实验结果表明，同浓度下，Fr.BuOH部位和Fr.BuOH-40％部位对盐酸维拉帕米诱导的斑马鱼心脏损伤的作用效果要优于单一化学成分金丝桃苷和异槲皮苷。
上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。
文章摘自国家发明专利，一种罗布麻叶提取物及其制备方法和应用，发明人：绪扩，付先军，谢文丽，任夏，申请号：202410126668.4，申请日：2024.01.30
