摘 要：本发明涉及一种米根霉发酵火麻籽超微粉的制备方法，包括以下步骤：将米根霉发酵火麻籽后的混合物超微粉碎；所述米根霉发酵火麻籽采用以下方法制备：利用米根霉发酵火麻籽，米根霉接种量2％-10％、含水量8％-43％、发酵温度20-35℃、发酵时间4-20h；所述超微粉碎包括以下方法：将米根霉发酵火麻籽后的混合物与水溶性淀粉混合，粉碎，之后加水混合，均质,均质条件为60Mpa，过滤，将过滤物冻干，超微粉碎，得到米根霉发酵火麻籽超微粉。采用上述方法制备的米根霉发酵火麻籽超微粉可以用于制备降血脂产品、降血糖产品、抗氧化等产品，具有药效更强、自由基清除效果更好、更利于生产应用等优点。
技术要点
1.一种米根霉发酵火麻籽超微粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将米根霉发酵火麻籽后的混合物超微粉碎；所述米根霉发酵火麻籽采用以下方法制备：利用米根霉发酵火麻籽，米根霉接种量2％-10％、含水量8％-43％、发酵温度20-35℃、发酵时间4-20h；所述超微粉碎包括以下方法：将米根霉发酵火麻籽后的混合物与水溶性淀粉混合，粉碎，之后加水混合，均质,均质条件为60Mpa，过滤，将过滤物冻干，超微粉碎，得到米根霉发酵火麻籽超微粉。
2.根据权利要求1所述一种米根霉发酵火麻籽超微粉的制备方法，其特征在于，米根霉发酵火麻籽后的混合物与水溶性淀粉以质量比4:6的比例混合，粉碎时间为5min，取出后加水以质量比1:20的比例混合，均质，均质时间为20min，采用450目的滤网过滤，将过滤物冻干48h去除水分，采用振动式药物超微粉机粉碎，温度10℃，粉碎时间15min，得到米根霉发酵火麻籽超微粉。
3.根据权利要求1或2所述一种米根霉发酵火麻籽超微粉的制备方法，其特征在于，米根霉接种量2％-10％、含水量8％-43％、发酵温度20-35℃、发酵时间4-20h。
4.根据权利要求3所述一种米根霉发酵火麻籽超微粉的制备方法，其特征在于，米根霉接种量6％-8％、含水量15％-36％、发酵温度30-35℃、发酵时间8-16h。
5.根据权利要求4所述一种米根霉发酵火麻籽超微粉的制备方法，其特征在于，米根霉接种量6.9-7％、含水量17％、发酵温度34.66-35℃发酵时间12h。
6.根据权利要求1或2所述一种米根霉发酵火麻籽超微粉的制备方法，其特征在于，其特征在于，在发酵之前还包括对火麻籽灭菌处理的步骤。
7.一种米根霉发酵火麻籽超微粉，其特征在于，采用权利要求1-6任一项所述方法制备。
8.权利要求7所述米根霉发酵火麻籽超微粉在制备降血脂产品、降血糖产品、抗氧化、预防肥胖、预防肠道癌产品中的一种或几种的应用。
技术领域
本发明属于加工技术领域，尤其涉及一种米根霉发酵火麻籽超微粉的制备方法。
背景技术
火麻籽(Cannabis sativa L.)是桑科植物大麻的成熟种子，它富含优质的不饱和脂肪酸、蛋白质、氨基酸、糖类、不溶性纤维、维生素和营养矿物质。火麻籽既能润燥，又能补虚，在临床上对消渴、肠燥便秘、痢疾、疥疮、风痹、热淋、癫痫、月经不调等症状都有治疗效果。经过本草文献的考证，历代医、药文献均认为，火麻籽是一味补益、健身、养颜等药食两用药物。火麻籽具有巨大应用潜力，富含脂肪酸、蛋白质、碳水化合物类、天然抗氧化剂(植物甾醇、三烯醇、胡萝卜素、磷脂、多酚类)等营养成分。在所有的油籽类型作物中，只有火麻籽含有这种长链多不饱和脂肪酸，其脂肪酸含量在25％-45％之间，亚油酸和亚麻酸的比例约为3:1，被WHO认定的最好的ω-3与ω-6必需脂肪酸的动态平衡，是机体代谢需要的最好的比例。火麻蛋白中富含各种必需氨基酸，特别是精氨酸，符合WHO关于婴儿所需氨基酸的要求。
米根霉(Rhizopus oryzae Went et Pr.Geer l.)是一种广泛存在于土壤、空气等环境中的真菌，属于毛霉目毛霉科根霉属，米根霉一般在30-35℃下能正常生长，并且最适宜生长的温度是37℃。
但是，目前尚未有将米根霉用于火麻籽的发酵的报道。另外，由于工艺设置不合理等，存在功效需进一步提高、其理化性质不适合进一步生产等问题，限制了火麻籽的进一步应用。
发明内容
鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种发酵火麻籽的方法及其应用，进一步提高发酵火麻籽及其超微粉的功效及理化性质。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种发酵火麻籽的方法，包括以下步骤：利用米根霉发酵火麻籽。
采取上述技术方案的有益效果包括：米根霉发酵剂是不影响身体健康的安全菌种制剂，在发酵过程中，米根霉会使火麻籽中的淀粉、蛋白质、脂类等发生水解，并且酶系发达的米根霉会使大分子物质转化为小分子。本发明通过米根霉发酵火麻籽的方法，达到增强药效和促进成分转化的效果。
进一步，发酵条件包括以下任一项或任几项：米根霉接种量2％-10％，含水量8％-43％，发酵温度20-35℃，发酵时间4-20h；
优选地，米根霉接种量6-8％，含水量15-36％，发酵温度30-35℃，发酵时间8-16h；
最优地，米根霉接种量6.9-7％，含水量17％，发酵温度34.66-35℃，发酵时间12h。
进一步，在发酵之前还包括对火麻籽灭菌处理的步骤。
采取上述技术方案的有益效果包括：
本发明以火麻籽作为原材料，采用米根霉对其进行发酵，通过优化工艺，发现采用上述工艺制备的发酵产物可以显著提高甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠的结合率。经过米根霉发酵后，火麻籽黄酮、火麻籽多糖、火麻籽总脂肪酸、火麻籽总氨基酸、火麻籽低聚肽等含量均显著提高。发酵后的产物在降血脂、降血糖、抗氧化功效均高于未发酵火麻籽。有利于制备药品、食品、保健品等，提高了火麻籽的附加值。
本发明提供一种米根霉发酵火麻籽超微粉的制备方法，包括以下步骤：将米根霉发酵火麻籽后的混合物超微粉碎。
进一步的，超微粉碎包括以下步骤：将米根霉发酵火麻籽后的混合物与水溶性淀粉混合，粉碎，之后加水混合，均质后过滤，将过滤物冻干，超微粉碎，得到米根霉发酵火麻籽超微粉。
均质条件可以为60Mpa。
采取上述技术方案的有益效果包括：加入水溶性淀粉可以增加发酵产物超微粉的分散性以及水溶性。
具体的，可以包括以下步骤：将米根霉发酵火麻籽后的混合物与水溶性淀粉以质量比4:6的比例混合，粉碎5min，取出后加水以质量比1:20的比例混合，用高压均质机均质20min后用450目的滤网过滤，将过滤物冻干48h去除水分，后用振动式药物超微粉机粉碎15min，温度10℃，得到米根霉发酵火麻籽超微粉。采取上述技术方案的有益效果包括：采取上述方法制备的米根霉发酵火麻籽超微粉，其理化特性得到提高和改善，与普通粉相比，超微粉颗粒的组织结构破碎程度比较大，得到的粒径明显更小；同时与普通粉相比，超微粉的润湿性、持水力、水溶性、膨胀力均得到了显著的提高。通过测量休止角和滑动摩擦角，发现超微粉的流动性也变好，可以满足生产的基本需求，另外超微粉的松装密度和振实密度也较好，高于普通粉，更有利于人体吸收。超微粉碎处理在很大程度上提高了超微粉体的生产适应性。同时，超微粉碎处理也显著提高了降血脂、降血糖和抗氧化等功效。有利于火麻籽的深加工及功能性的产品开发。
本发明提供一种发酵火麻籽，发酵火麻籽可以采用上述方法制备。
本发明提供上述发酵火麻籽在制备降血脂产品、降血糖产品、抗氧化、预防肥胖、预防肠道癌产品中的一种或几种的应用。
本发明提供一种米根霉发酵火麻籽超微粉，米根霉发酵火麻籽超微粉可以采用上述方法制备。
本发明提供上述米根霉发酵火麻籽超微粉在制备降血脂产品、降血糖产品、抗氧化、预防肥胖、预防肠道癌产品中的一种或几种的应用。
上述中，所述产品可以为药物制剂、食品、保健品、化妆品等等。发酵火麻籽或其超微粉可以单独应用或者与其他组分联合应用。
采取上述技术方案的有益效果包括：相比未发酵的火麻籽，发酵火麻籽及其超微粉在降血脂、降血糖、抗氧化等功效方面显著提高。可以用于制备具有相关功能的产品，广泛应用于医药、食品、保健品、化妆品等领域。
附图说明
图1为米根霉接种量对胆酸盐结合率的影响的实验结果，每组中由左到右依次为甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠的实验结果。
图1
图2为发酵时间对胆酸盐结合率的影响的实验结果，每组中由左到右依次为甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠的实验结果。
图2
图3为含水量对胆酸盐结合率的影响的实验结果，每组中由左到右依次为甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠的实验结果。
图3
图4为发酵温度对胆酸盐结合率的影响的实验结果，每组中由左到右依次为甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠的实验结果。
图4
图5为甘氨胆酸钠结合率显著因素图。
图5
图6为牛磺胆酸钠结合率显著因素图。
图6
图7为因素A和因素B交互作用的响应面和等高线图。
图7
图8为未发酵火麻籽和发酵火麻籽胆酸盐结合率对比图。
图8
图9为米根霉发酵火麻籽普通粉成品图。
图9
图10为米根霉发酵火麻籽超微粉成品图。
图10
图11为超微粉粒径检测图。
图11
图12超微粉稳定性检测电位图。
图12
图13为未发酵火麻籽、米根霉发酵火麻籽和超微粉对胆酸钠的结合率的实验结果。
图13
图14为未发酵火麻籽、米根霉发酵火麻籽和超微粉对胰脂肪酶活性的抑制效果。
图14
图15为未发酵火麻籽、米根霉发酵火麻籽和超微粉对胶束溶解度的抑制效果。
图15
图16为未发酵火麻籽、米根霉发酵火麻籽和超微粉的IC50值。
图16
图17为阿卡波糖、未发酵火麻籽、米根霉发酵火麻籽和超微粉对α-葡萄糖苷酶的抑制效果。
图17
图18为阿卡波糖、未发酵火麻籽、米根霉发酵火麻籽和超微粉对α-淀粉酶的抑制效果。
图18
图19为Vc对照液、未发酵火麻籽、米根霉发酵火麻籽和超微粉对DPPH自由基的清除效果。
图19
图20为Vc对照液、未发酵火麻籽、米根霉发酵火麻籽和超微粉对ABTS+自由基的清除效果。
图20
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明通过利用米根霉进行发酵火麻籽，以胆酸盐结合率为指标进行发酵工艺的优化，将得到的产物的主要成分与未发酵的火麻籽进行对比，之后进行超微粉的制备和性质检测，最后进行体外降血脂、降血糖、抗氧化的功效研究，主要内容包括：
(1)优化了米根霉发酵火麻籽的工艺，并以发酵物体外降血脂为指标(甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠结合率)，通过单因素试验研究米根霉接种量、发酵时间、发酵温度和含水量这4个影响因素。再通过Plackett-Burman实验筛选出米根霉接种量、含水量和发酵温度作为下一步响应面试验设计的三个因素。在此基础上，进行响应面优化实验，并进行验证实验，得到最佳提取工艺条件为：米根霉接种量6.9％，含水量17％，发酵温度34.66℃，发酵时间12h。在此最佳条件下，得到平均甘氨胆酸钠结合率实际值为75.64％±2.33％，牛磺胆酸钠结合率实际值为65.77％±3.45％。跟未发酵的火麻籽相比，发酵后的火麻籽甘氨胆酸钠结合率提高了约37.60％，牛磺胆酸钠结合率提高了约37.25％。
(2)对发酵前后的火麻籽进行成分含量测定，得到发酵火麻籽黄酮、多糖、氨基酸、脂肪酸、低聚肽含量提高，蛋白质含量下降。其中变化最大的是多糖和黄酮，提高了约62.69％和45.56％，氨基酸含量提高了约7.14％，脂肪酸含量提高了约11.94％，低聚肽含量提高了约7.84％，另外蛋白质含量下降了约4.54％。
(3)利用超微粉碎技术，将发酵后火麻籽产物制备成发酵火麻籽的超微粉，测得超微粉的粒径837.1nm；超微粉润湿时间18.76s±1.82s；超微粉的水分1.55％±0.05％；持水性4.25±0.18(g/g)；膨胀力5.61±0.27(mL/g)和水溶性77.02％±0.25％；超微粉的休止角38.71°和滑动摩擦角50.24°；超微粉的松装密度0.51±0.23(g/cm3)和真实密度0.60±0.12(g/cm3)。电位检测证明其在水中分散性好；说明超微粉的粒径更小，润湿性、持水性、水溶性、膨胀力等水合性质更好，粉体的流动性也变得更好。上述指标均优于普通粉体，证明超微粉在剂型方面的优势。
(4)检测体外降血脂指标包括胆酸钠结合率、胰脂肪酶抑制率、胆固醇胶束溶解度抑制率。胰脂肪酶活性抑制实验结果表明，未发酵火麻籽的IC50值为8.054mg/mL，米根霉发酵火麻籽的IC50值为1.255mg/mL，超微粉的IC50值为0.605mg/mL。胆固醇胶束溶解度抑制活性实验结果表明，未发酵火麻籽的IC50值为11.758mg/mL，米根霉发酵火麻籽的IC50值为7.436mg/mL，超微粉的IC50值为3.171mg/mL。由此可知，血脂抑制活性的强弱为：超微粉＞米根霉发酵火麻籽＞未发酵火麻籽。
(5)研究发酵后火麻籽超微粉体外降血糖，抗氧化能力较好。超微粉对α-葡萄糖苷酶的活性抑制率达到87.53％±2.20％，对α-淀粉酶的活性抑制率可以达到67.70％±2.12％，超微粉对DPPH的清除率率达到90.05％±1.85％，对ABTS+的清除率可以达到97.13％±1.99％。
综上所述，本发明研究确定了火麻籽的最佳发酵工艺，研究其营养成分的变化，并制备成超微粉，通过理化指标证明超微粉具有水溶性好，降血脂，降血糖，抗氧化的优点，有利于火麻籽的进一步应用。
下面通过具体实施例进行介绍。各实施例中所使用的实验方法若未经特殊说明均为本领域的常规实验方法。所用材料、试剂、仪器，若未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂和仪器，可通过商业渠道获得或常规方法制备。
紫外分光光度计(型号CARY-100)购自美国VARIAN公司；凯氏定氮仪(型号Kje ltec8400)购自丹麦FOSS公司；氨基酸自动分析仪(型号S433D)购自德国Sykam公司；振动式药物超微粉碎机(型号GYB40-10S)购自济南龙微制药设备有限公司；水分测定仪(型号HB43-S)购自上海仪电分析仪器有限公司；速冻箱(型号SSF 12)购自德国SIGMA公司；多功能粉碎机(型号LX-07A)购自上海江信科技有限公司；电热恒温鼓风干燥箱(型号DHG-9240A)苏州德沃斯烘箱制造有限公司；智能粉体特性测试仪(型号BT-1001)、激光粒度分布仪(型号BT-2001)购自丹东百特仪器有限公司；高压均质机(型号GYB40-10S)购自广州市东征化有限公司。
火麻籽采购于云南汉盟股份有限公司；米根霉购于烟台德健生物科技有限公司；月桂酸4-硝基苯脂、胰蛋白酶、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠均购自上海化学试剂公司；DPPH、Vc、ABTS、油酸、醋酸钠、胃蛋白酶、磷酸盐缓冲液均购自国药集团化学试剂有限公司；芦丁标准品、葡萄糖对照品、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、色氨酸均购自上海源叶生物科技有限公司；石油醚、茚三酮、柠檬酸钠、水溶性淀粉均购自天津市科密欧化学试剂有限公司；α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖、胆固醇、曲拉通X-100、牛磺胆酸钠、胰脂肪酶均购自上海麦克林生物技术有限责任公司；实验用去离子水购自娃哈哈集团。上述各试剂均为分析纯。
实施例1米根霉发酵火麻籽的工艺优化
1.1实验方法
(1)火麻籽灭菌处理：分别称取火麻籽各10g，将它们分别装在一个锥形瓶里，用一层封口膜将它们密封起来，再将它们在高温下，121℃下灭菌30分钟，灭菌结束后放入洁净工作台放凉，等待接种。
(2)制作标准曲线：
取不同浓度的甘氨胆酸钠标准溶液0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30、0.36、0.42、0.48mmol/L各2mL于容量瓶中，再加入60％的硫酸6mL，在温度70℃中水浴20min后冰浴5min，紫外分光光度计在387nm波长处测定其吸光度值。以胆酸盐含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制甘氨胆酸钠标准曲线。
取不同浓度的牛磺胆酸钠标准溶液0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30，0.35、0.40、0.45mmol/L各2mL于容量瓶中，加入60％的硫酸6mL，在温度70℃中水浴20min后冰浴5min，紫外分光光度计在387nm波长处测定其吸光度值。以胆酸盐含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制牛磺胆酸钠标准曲线。
(3)测定胆酸盐含量：取0.5g发酵后的粗粉于容量瓶中，加入10mg/mL的胃蛋白酶(溶于pH6.5的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液)3mL，0.01mol/L的盐酸1mL，在37℃的温度下，将样品置于恒温水浴中，并持续一小时进行振荡消化，模拟胃部消化的作用。之后用0.1mol/L的NaOH溶液调节溶液的pH至6.3，后加入10mg/mL的胰蛋白酶(溶于pH6.5的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液)4mL，在37℃的温度下，将样品置于恒温水浴中，并持续一小时进行振荡消化，模拟肠道消化的作用。最后向样品中加入0.4mmol/L甘氨胆酸钠4mL，0.5mmol/L牛磺胆酸钠4mL，在37℃的温度下，将样品置于恒温水浴中持续一小时振荡消化，将混合溶液转移至离心管中，10000r/min下离心20min，取上清液用0.45um的水性针式滤器过滤，紫外分光光度计在387nm波长处测定吸光度值，计算甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠的含量。胆酸盐结合率计算方法如下：
(4)米根霉发酵火麻籽单因素试验设计：以甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠结合率为指标，依次研究了米根霉接种量(发酵体系包括米根霉、火麻籽和水，接种量分别为发酵体系的2％、4％、6％、8％、10％，均为质量百分比)、发酵时间(4h、8h、12h、16h、20h)、发酵温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)、发酵体系的含水量(8％、15％、22％、36％、43％)对试验指标的影响。
(5)Plackett-Burman试验设计：在单因素试验的基础上，以甘氨胆酸钠结合率和牛磺胆酸钠结合率为指标，选取因素米根霉接种量、发酵温度、发酵时间和含水量为自变量，设计Plackett-Burman试验，通过对结果的分析，筛选出影响最显著的因素。
(6)响应面试验设计：在Plackett-Burman试验的基础上，以甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠结合率为响应值，自变量A、B、C为影响因素，设计出3因素3水平的响应面试验，Box-Behnken试验因素与水平见表1、试验设计方案见表2。
表1发酵工艺优化Box-Behnken试验因素与水平表
表2响应面试验设计方案
1.2实验结果与分析
(1)甘氨胆酸钠标准曲线：甘氨胆酸钠的标准曲线方程式为y＝2.6642x+0.0561，R2＝0.9968，其中，x为甘氨胆酸钠含量(mmol/L)，y为吸光度。
(2)牛磺胆酸钠标准曲线：牛磺胆酸钠的标准曲线方程式为y＝2.4524x+0.0367，R2＝0.9985，其中，x为牛磺胆酸钠含量(mmol/L)，y为吸光度。
(3)单因素试验结果与分析
①米根霉接种量：由图1可知，在其他条件相同的情况下(即发酵时间10h、发酵温度30℃、含水量15％)，米根霉接种量为2％-8％时，甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠的结合率都在不断提高，当米根霉接种量为8％时，甘氨胆酸钠结合率为65.91％±1.22％，牛磺胆酸钠结合率为64.40％±1.41％，此时两种胆酸盐的结合率都是最好的，当米根霉接种量为10％时，甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠结合率都开始下降，因此选择米根霉接种量为8％进行下一步的发酵试验。
②发酵时间：由图2可知，在其他条件相同的情况下(即接种量8％、发酵温度30℃、含水量15％)，发酵时间为4-12h时，甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠的结合率都在持续提高，当发酵时间为12h时，甘氨胆酸钠结合率为70.13％±2.01％，牛磺胆酸钠结合率为65.86％±1.74％，此时两种胆酸盐的结合率都是最好的，当发酵时间为12-20h时，甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠结合率开始下降，所以选定发酵时间为12h进行试验。
③含水量：由图3可知，在其他条件相同的情况下(发酵时间12h、发酵温度30℃、接种量8％)，含水量为8％-22％时，甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠的结合率都在不断提高，当含水量为22％时，甘氨胆酸钠结合率为71.54％±1.91％，牛磺胆酸钠结合率为77.4％±2.11％，此时两种胆酸盐的结合率都是最好的，当含水量为22％-43％时，甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠结合率不断下降，所以选定含水量为22％进行发酵。
④发酵温度：由图4可知，在其他条件相同的情况下(即发酵时间12h、接种量8％，含水量22％)，发酵温度为20℃-35℃时，甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠的结合率都在持续提高，当发酵温度为35℃时，甘氨胆酸钠结合率为71.92％±1.42％，牛磺胆酸钠结合率为72.65％±2.06％，此时两种胆酸盐的结合率都是最好的，当发酵温度为35℃ 45℃时，甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠结合率不断下降，所以选定发酵温度为35℃进行发酵。
(4)发酵工艺优化Plackett-Burman试验结果与分析
根据单因素试验结果，以甘氨胆酸钠结合率和牛磺胆酸钠结合率为实验的响应值，设计Plackett-Burman试验，试验设计方法及结果见表3，筛选出的显著因素结果见图5和图6。
表3 Plackett-Burman试验设计的因素水平和结果
由图5可知，对甘氨胆酸钠结合率影响最明显的前三个因素分别是含水量(C)、米根霉接种量(A)和发酵温度(D)，由图6可知，对牛磺胆酸钠结合率影响最明显的前三个因素是发酵温度(D)、含水量(C)、米根霉接种量(A)。可以看到，这三个因素对牛磺胆酸钠结合率的影响更显著一些，因此选取米根霉接种量(A)、含水量(C)和发酵温度(D)作为下一步响应面试验设计的三个因素。
(5)发酵工艺优化响应面试验结果与分析
①响应面Box-Behnken试验设计
以Plackett-Burman试验结果为基本依据，以甘氨胆酸钠结合率(Y1)和牛磺胆酸钠结合率(Y2)为响应值，选取因素米根霉接种量(A)、含水量(B)、发酵温度(C)为自变量，利用Design-Expert11进行3因素3水平响应面试验设计，Box-Behnken试验结果见表4。
表4响应面试验设计及结果表
②响应面交互作用分析
以甘氨胆酸钠结合率(Y1)为响应值，经二次多项回归拟合得到方程为：Y1＝63.69-9.48A-11.86B-2.84C+0.8950AB-0.8600AC+2.05BC-2.95A2-8.56B2-17.37C2。
由表5可知，该模型是显著的(P＜0.05，并且失拟项是不显著的(P＝0.3892>0.05)，可以说明该模型的拟合度情况较好，能比较好地反映出甘氨胆酸钠结合率与各因素的变化规律。此外该模型的决定系数R2＝0.9305，表明该回归方程对此试验的模拟情况较好，试验的误差比较小，校正决定系数R2adj＝0.8410，可以看出，软件的预测值与试验的实际值之间是相关的，并且相关性很高。另外得到变异系数C.V.为12.48％，说明试验的变异性是12.48％，可以用于该模型对米根霉发酵火麻籽工艺进行接下来的分析和预测。由P值可以得到，方程的一次项A和B，二次项B2对甘氨胆酸钠的结合率影响较为显著(P＜0.05)，其他因素影响不显著(P＞0.05)。因此可以用该回归方程对不同发酵条件下的甘氨胆酸钠结合率进行预测。
表5回归模型方差分析表
注：*表示差异显著(P＜0.05)；**表示差异极显著(P＜0.01)；变异系数C.V.＝12.48％，R2＝0.9305，R2adj＝0.8410。
以牛磺胆酸钠结合率(Y2)为响应值，经二次多项回归拟合得到方程为：Y2＝64.67+1.99A-11.89B-1.57C+4.71AB-2.08AC+0.1475BC-4.53A2-15.66B2-9.20C2。由表6可知，该模型是显著的(P，失拟项是不显著的(P＝0.7558>0.05)可以说明该模型的拟合度情况较好，能较好地反映牛磺胆酸钠结合率与各因素的变化规律。可以看出该模型的决定系数R2＝0.9895，这说明该线性回归方程对所做试验的模拟情况好，得到的试验结果误差较小，校正决定系数R2adj＝0.9759，从中可以看出，软件的预测值与试验的实际值之间是相关的，并且相关性很高。另外变异系数C.V.为4.13％，说明试验的变异性是4.13％，可以用于该模型对米根霉发酵火麻籽工艺进行接下来的分析和预测。由P值可知，方程的一次项A对牛磺胆酸钠结合率影响显著(P，方程的一次项B，交互项AB，方程的二次项A2、B2、C2对牛磺胆酸钠结合率得影响极显著(P其他因素影响不显著(P＞0.05)。由F值可知，各因素对牛磺胆酸钠结合率影响顺序为含水量＞米根霉接种量＞发酵温度。因此可用该回归方程对不同发酵条件下的牛磺胆酸钠结合率进行预测。
表6回归模型方差分析
注：*表示差异显著(P＜0.05)；**表示差异极显著(P＜0.01)；变异系数C.V.＝4.13％，R2＝0.9895，R2adj＝0.9759。
由图7可知，米根霉接种量和含水量交互作用的等高线图是椭圆形状的，证明其交互作用是显著的，符合回归模型方差结果。在3D响应面图中，可以形象的看出牛磺胆酸钠结合率随着米根霉接种量和含水量的增加呈先上升后下降的趋势。
③最优工艺条件及验证实验
利用Design-Expert11软件，通过优化得到预测最佳发酵条件为：米根霉接种量6.9％，含水量17％，发酵温度34.66℃，发酵时间12h。在此最佳的发酵条件之下，软件对甘氨胆酸钠结合率的预测值为72.44％，对牛磺胆酸钠结合率的预测值为65.39％。从实际出发最佳发酵条件为：米根霉接种量6.9％，含水量17％，发酵温度35℃，发酵时间12h。按此发酵工艺条件进行3次平行验证试验，得到平均甘氨胆酸钠结合率实际值为75.64％±2.33％，牛磺胆酸钠结合率实际值为65.77％±3.45％，甘氨胆酸钠结合率与模型预测值相差5％以内，牛磺胆酸钠结合率与模型预测值相差1％以内，与模型的预测基本一致，说明该方程与实际的试验结果有很好的拟合，通过试验得出的最优参数具有较好的稳定性和可靠性，说明该模型有效可行。
(6)未发酵火麻籽的胆酸盐结合率结果：如图8所示，经实验测得未发酵火麻籽对甘氨胆酸钠的结合率为34.84％±3.59％，而米根霉发酵火麻籽对甘氨胆酸钠的结合率为75.64％±2.33％；未发酵火麻籽对牛磺胆酸钠的结合率为28.52％±2.38％，而米根霉发酵火麻籽对甘氨胆酸钠的结合率为65.77％±3.45％。可以看出，经过米根霉发酵后，对甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠的结合率显著提高。
综上所述，本实施例通过甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠结合率为指标，以米根霉接种量，发酵时间，含水量，发酵温度为单因素进行发酵工艺的优化。米根霉接种量：2％、4％、6％、8％、10％，得到8％的接种量胆酸盐结合率最高，甘氨胆酸钠结合率为65.91％±1.22％，牛磺胆酸钠结合率为64.4％±1.41％。发酵时间：4h、8h、12h、16h、20h，得到12h胆酸盐结合率最高，甘氨胆酸钠结合率为70.13％±2.01％，牛磺胆酸钠结合率为65.86％±121.74％。含水量：8％、15％、22％、29％、36％、43％，得到22％的含水量胆酸盐结合率最高，甘氨胆酸钠结合率为71.54％±1.91％，牛磺胆酸钠结合率为77.4％±2.11％。发酵温度：20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，得到35℃的含水量胆酸盐结合率最高，甘氨胆酸钠结合率为71.92％±1.42％，牛磺胆酸钠结合率为72.65％±2.06％。
通过Plackett-Burman试验，得到米根霉接种量，含水量，发酵温度为三个显著因素，以此设计3因素3水平响应面试验。经过响应面实验后优化条件为：通过优化得到最佳发酵条件为米根霉接种量6.9％，含水量17％，发酵温度34.66℃，发酵时间12h。在此最佳条件下，得到平均甘氨胆酸钠结合率实际值为75.64％±2.33％，牛磺胆酸钠结合率实际值为65.77％±3.45％。
在响应面设计中，同时选取了甘氨胆酸钠结合率和牛磺胆酸钠结合率两个指标作为响应值进行工艺优化，无法同时满足两个指标取得最值。又因为甘氨胆酸钠结合率在胆固醇结合中更为重要，因此在响应面实验结果中选取了甘氨胆酸钠结合率最高的参数，此时牛磺胆酸钠结合率低于单因素试验的最大值。
通过对比实验测得未发酵火麻籽对甘氨胆酸钠的结合率为34.84％±3.59％，米根霉发酵火麻籽对甘氨胆酸钠的结合率为72.44％±2.33％；未发酵火麻籽对牛磺胆酸钠的结合率为28.52％±2.38％，米根霉发酵火麻籽对甘氨胆酸钠的结合率为65.77％±3.45％。得出结论：米根霉发酵火麻籽显著提高了甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠的结合率。
实施例2米根霉发酵火麻籽前后各组分含量的测定
本实施例针对火麻籽中丰富的营养物质，并且有可能对降血脂有作用的一些成分进行米根霉发酵前后的含量测定，米根霉发酵条件为：接种量7％、含水量17％、发酵温度35℃、发酵时间12h；进行对比分析，研究影响火麻籽降血脂功效的成分，以有利于火麻籽的进一步应用。
2.1实验方法
(1)测定黄酮含量：通过采用亚硝酸钠-氯化铝络合分光光度法，测定火麻籽中的总黄酮含量。当溶液中有亚硝酸钠存在下，当溶液酸碱度在中性或弱碱性的情况下，黄酮类化合物会与含有的铝盐形成螯合物，在加入NaOH后，溶液会呈现出红橙色，在一定的浓度范围之间，黄酮的含量与吸光度值成正比关系。
①配制芦丁标准储备液：准确称取5mg的芦丁标准品，用60％乙醇溶液溶解定容至100mL。配制成浓度为50mg/L的标准储备液，放在4℃的冰箱中避光保存。
②制作标准曲线：准确吸取一定量芦丁标准溶液分别置于10mL容量瓶中，配制成2mg/mL，4mg/mL，6mg/mL，8mg/mL，10mg/mL，12mg/mL的标准系列，加入乙醇溶液，使溶液的至总体积为5mL，再加亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀后静置8min，加入氯化铝溶液0.3mL，摇匀，静置10min，加氢氧化钠溶液4mL，用乙醇溶液定容至刻度，摇匀，静置10min。在510nm处测定其吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
③制备试样：各称取发酵前和发酵后的火麻籽试样5g分别置于50mL容量瓶中，加入60％的乙醇溶液30mL，在280V，60℃下进行超声90min，用60％乙醇进行定容，再离心至澄清，过滤后待用。
④试样溶液的测定：各吸取发酵前和发酵后待测液1mL于容量瓶中，加入乙醇溶液至总体积为5mL，加亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀后静置8min，再加入氯化铝溶液0.3mL，摇匀后静置10min，加氢氧化钠溶液4mL，用乙醇溶液定容至刻度，摇匀后静置10min。在510nm处测定吸光度，根据标准曲线计算样品中总黄酮的浓度。
⑤总黄酮含量计算
式中：X—火麻籽中总黄酮的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；
c—通过计算得出的样品溶液的总黄酮浓度(mg/L)；
10—待测液稀释倍数；
m—火麻籽样品的质量，单位为克(g)；
0.05—火麻籽样品的提取液总体积，单位为(L)；
H—火麻籽中水分的质量分数(％)。
(2)测定多糖含量
①制备葡萄糖标准溶液：精密称取10mg无水葡萄糖置于烧杯中，用蒸馏水溶解后，转移至100mL容量瓶中定容，配制成浓度为0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液。
②制作标准曲线：分别精密吸取一定量葡萄糖标准溶液置于10mL容量瓶中，各加水补齐至1.0mL后，分别加入5％苯酚溶液1mL和硫酸3mL，配制成浓度为0.01mg/mL，0.02mg/mL，0.03mg/mL，0.04mg/mL，0.05mg/mL，0.06mg/mL的标准系列，振荡混匀后，置100℃水浴锅中加热10min，以葡萄糖溶液的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。
③样品测定：
分别制备未发酵火麻籽粉末和米根霉发酵火麻籽粉末。制备方法为冷冻干燥，前冻干-55℃12h，后冻干35℃8h。取未发酵火麻籽粉末和米根霉发酵火麻籽粉末各1.0g，分别置于容量瓶中，按1g:30mL的物料比加入无水乙醇，用超声提取器在280V、46℃条件提取40min，之后在8000r/min下离心15min，保留上清液，剩余残渣加50mL的水，再超声提取3次，每次30min，每次于离心机中以4000r/min离心10min，合并三次的上清液，混匀后吸取1mL到25mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得样品测定液。然后准确吸取样品测定液1mL于容量瓶中，分别加入5％的苯酚溶液1mL和80％硫酸溶液3mL，振荡混匀后，置100℃水浴锅中加热10min，冷却至室温后测定吸光度。
④多糖含量的计算
式中：W—火麻籽中的多糖含量，单位为克每百克(g/100g)；
P—计算得出的样品溶液的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；
V1—样品测定液的体积，单位为毫升(mL)；
V2—样品提取液的体积，单位为毫升(mL)；
V3—配制样品测定液所用的样品提取液的体积，单位为毫升(mL)；
m—样品质量，单位为克(g)；
0.9—葡萄糖换算成为葡聚糖的校正系数。
(3)测定蛋白质含量：通过凯氏定氮法测定蛋白质含量，精密称定发酵前和发酵后的火麻籽样品各0.149g于消化管中，向管中分别加入硫酸8mL，硫酸钾3g，硫酸铜0.3g，置420℃的消化炉上消化1h，消化完毕后取出，待冷却后将其安装在凯式定氮仪上进行滴定，结束后测定蛋白质的含量。
(4)测定脂肪酸含量：分别称取2g发酵前和米根霉发酵火麻籽样品，将两种待测样品分别放在脱脂滤纸包内，利用索氏提取装置，以石油醚为萃取剂，萃取4小时，之后将滤纸包放入105℃烘箱内烘干至恒重。
(5)测定氨基酸含量：
①制备混合氨基酸标准储备液：混合氨基酸标准储备液制备(1umol/mL)：分别准确称取单个氨基酸标准品(精确至0.00001g)于同一个50mL的烧杯中，吸取6mol/L盐酸溶液8.3mL进行溶解,之后转移至250mL容量瓶中，用水稀释定容至刻度，混匀。
②制备混合氨基酸标准工作液：混合氨基酸标准工作液制备(100nmol/mL)：准确吸取混合氨基酸标准储备液1.0mL于10mL容量瓶中，再加入pH2.2的柠檬酸钠缓冲溶液定容至刻度，混匀，为标准上机液。
③测定试样：精确地称量发酵前和发酵后的火麻籽样品于水解管中，将样品中的蛋白质含量控制在10-20mg之间，再加入6mol/L的盐酸溶液12mL。用致冷剂将水解管冻结5min，并用真空泵抽真空(接近0Pa)后注入氮气，在经过三次抽真空、注入氮气之后氮气充满，封口后将水解管放在电热鼓风恒温箱中，在温度110℃±1℃下进行水解22h后拿出，冷却至室温。打开水解管滤出至50mL容量瓶中，再加水定容至刻度，摇匀即可。将1.0mL的滤液精确地抽取到25mL的试管中，在50℃的高温条件下，用试管浓缩仪进行减压干燥，后用2mL的水将其溶解，然后在减压下进行脱水，最终蒸干。用1.0mL-2.0mL,pH2.2的柠檬酸钠缓冲溶液溶解，振荡混匀，用0.22μm滤膜过滤后放入仪器的进样瓶中，即为样品测定液。在检测波长570nm和440nm下，将混合氨基酸标准工作液和样品测定液分别以相同容量注入到氨基酸分析仪中，采用外标法，利用峰面积来计算样品测定液中氨基酸的浓度。样品测定液中各氨基酸的含量按下列公式计算:
式中：Ci—样品测定液氨基酸i的含量，单位为纳摩尔每毫升(nmol/mL)；
Ai—试样测定液氨基酸i的峰面积；
As—氨基酸标准工作液氨基酸s的峰面积；
cs—氨基酸标准工作液氨基酸s的含量，单位为纳摩尔每毫升(nmol/mL)。
(6)测定低聚肽含量
①测定酸溶蛋白质含量：准确称取未发酵和米根霉发酵火麻籽各1.0g于容量瓶中，分别加入15％的三氯乙酸溶液，溶解并定容至50mL，混匀后静置10min，将两种样品溶液在9000r/min下离心25min，分别取两种样品离心液10mL用凯氏定氮法测定其中的蛋白质含量，计算出两种样品中酸溶蛋白的含量，蛋白质的换算系数为6.25。
②测定油离氨基酸：准称取未发酵和米根霉发酵的火麻籽1.0g于容量瓶中，分别用5％的三氯乙酸溶液20mL溶解均匀，将两种样品溶液分别转移至100mL容量瓶中，再用0.002mol/L盐酸溶液定容，之后将两种样品溶液在9000r/min下离心15min，取上清液。
③结果计算
低聚肽含量X1按下列公式计算：
式中：X1—样品中低聚肽的含量，单位为克每百克(g/100g)；
C2—样品中酸溶蛋白的含量，单位为克每百克(g/100g)；
C3—样品中油离氨基酸的含量，克每百克(g/100g)；
w—样品中水分，克每百克(g/100g)。
2.2实验结果与分析
(1)黄酮、多糖、蛋白质含量的结果与分析
①葡萄糖含量标准曲线：葡萄糖的标准曲线方程为y＝8.8534x+0.0397，R2＝0.9962，其中，x为葡萄糖浓度(mg/mL),y为吸光度。
②黄酮含量标准曲线：黄酮的标准曲线方程为y＝0.0067x-0.0056，R2＝0.9994，其中，x为mg/mL,y为AU。
如表7所示，米根霉发酵后火麻籽的多糖显著上升，可能是由于米根霉是一种酶系发达的酶，在发酵过程中可能将淀粉转化为多糖，所以发酵后的火麻籽多糖含量增加；米根霉发酵后的火麻籽黄酮含量也显著增加，可能是因为在发酵过程中破坏了抗氧化活性物质与基质的结合，导致黄酮的含量增加；米根霉发酵火麻籽后蛋白质含量有所减少，可能是由于在发酵过程中通过酶的催化作用，一些大分子的蛋白质转化为了小分子的氨基酸。蛋白质的营养价值除了与其总蛋白质的质量有关外，还与其所含氨基酸的含量及组成有关。
表7黄酮、多糖、蛋白质的含量
(2)脂肪酸含量的结果与分析
通过实验测定，没有进行发酵火麻籽和米根霉发酵火麻籽中的脂肪酸的含量见表8。火麻籽中含有大量的脂肪酸，由表8中可以看出，总脂肪酸含量占比40％左右，在这些脂肪酸中，亚油酸的含量是最多的，它在整个脂肪酸中所占的比重超过了50％以上，具有抗血栓和抗心律失调的作用；亚麻酸是火麻籽中仅次于亚油酸的脂肪酸，占比低于20％，然后是油酸，占比低于15％，棕榈酸、硬脂酸所占的比例最小，约为5％和3％左右。通过表8发现，米根霉发酵火麻籽中油酸和亚油酸的含量有所增加，亚麻酸、硬脂酸、棕榈酸含量则减少，亚油酸与亚麻酸之比值在3:1左右，这个比值是人体所需的最佳比例，充分说明了米根霉发酵后的火麻籽各类脂肪酸组成有所改变，说明米根霉发酵后可以影响脂肪酸的含量。
表8脂肪酸的含量
(3)氨基酸含量的结果与分析
通过实验测定，没有进行发酵火麻籽和米根霉发酵火麻籽中的氨基酸的含量见表9。从表9中可以看出，氨基酸的总量占火麻籽的大约30％，这些氨基酸分为很多种类，所以蛋白质中的营养价值除了总含量外，还取决于这些氨基酸的构成。16种氨基酸中谷氨酸的含量是最高的(6.43-6.81g/100g)，还含有大量的精氨酸(3.74-4.18g/100g)和天门冬氨酸(3.27-3.65g/100g)，对神经中心和大脑皮层来说，谷氨酸是一种很好的补充物质，可以起到延缓能量物质的消耗，从而发挥促进剧烈运动后的体能恢复作用，精氨酸能促进儿童的生长发育能力，火麻籽是一种很好的用来补充精氨酸的食物，而天门冬氨酸在人体内能够转化为谷氨酸，可以进一步增强火麻籽的抗疲劳作用。亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸含量也比稍高一些，这三种物质共同作用，可以修复肌肉，降低血糖，增强身体的能量，也可以促进儿童的生长发育。火麻籽中富含苏氨酸和异亮氨酸，对消瘦体质的修复和生长好的作用。火麻籽的氨基酸含量与大豆相似，但是它同时也拥有着大豆所不具备的其他优势，比如：因为火麻蛋白质中不含色氨酸的抑制因素，所以对蛋白质的吸收也不会有任何的影响，而且火麻籽中没有大豆中的很多寡聚糖，不会导致胃胀和恶心。通过表9可以看出，米根霉发酵后的火麻籽中的氨基酸总量提高，并且大部分氨基酸的含量均显著的提高，充分说明了米根霉发酵后的火麻籽氨基酸含量提高，可能的原因是经过发酵后，火麻籽中的蛋白质等大分子物质经过转化，变为了小分子的氨基酸。
表9 16种氨基酸的含量
(4)低聚肽的结果与分析
通过各实验测定，得到酸溶蛋白的含量和油离氨基酸的含量，通过公式计算得到低聚肽的含量，通过表10可以看出，米根霉发酵火麻籽中低聚肽含量比发酵前提高了约7.8％。最近的研究表明，在消化道中，蛋白在酶水解过程中，以低聚肽的形态被人体吸收，其在肠道中的作用远大于完全的游离氨基酸，因此，其在肠道中的作用越来越受到关注。因此，米根霉发酵火麻籽中低聚肽含量提高可能是由于米根霉中含有大量的酶，在发酵的过程中通过酶水解使得火麻籽中的蛋白质转化为了低聚肽，所以米根霉发酵火麻籽可能更容易被我们机体吸收。
表10 酸溶蛋白、游离氨基酸和低聚肽的含量
本实施例通过测定发酵前火麻籽和米根霉发酵火麻籽中的黄酮、多糖、蛋白质、五种脂肪酸、十六种氨基酸、低聚肽成分，通过发酵前后的含量变化，分析比较，得到以下结论：米根霉发酵后火麻籽黄酮含量提高了350.4mg/kg，提高了约45.6％；米根霉发酵后火麻籽多糖含量提高了0.42g/100g，提高了约62.7％；米根霉发酵后火麻籽蛋白质含量降低了1.45％；米根霉发酵后火麻籽总脂肪酸含量提高了4.37g/100g，提高了约11.94％；在不同种类脂肪酸中，亚麻酸、硬脂酸和棕榈酸含量降低，另外油酸和亚油酸含量提高；米根霉发酵后火麻籽总氨基酸含量提高了2.1g/100g，提高了7.14％。除蛋氨酸、脯氨酸外，其它种类氨基酸的含量都有不同程度的增加；米根霉发酵后火麻籽低聚肽含量提高0.08g/100g，提高了约7.84％。根据上述实施例可知，米根霉发酵火麻籽的发酵物的降血脂能力高于未发酵的火麻籽。结合米根霉发酵后火麻籽黄酮和多糖的大幅提高，可已说明发酵物中的黄酮和多糖的增加对其降血脂能力的增强有着促进作用。
实施例3米根霉发酵火麻籽超微粉的制备及理化特性研究
本实施例将米根霉发酵后的火麻籽通过一定的处理，制备成超微粉，之后对制成的超微粉进行粒径大小、润湿性、粉体水分、持水性、水溶性、膨胀力、休止角与滑动摩擦角、松装密度与振实密度的理化指标测定，来探究制成的超微粉性质是否优良，以便之后进行更深的研究。
本实施例涉及的米根霉发酵火麻籽后的产物是采用下面的发酵条件制备：接种量7％，含水量17％，发酵温度35℃，发酵时间12h。
本实施例涉及的普通粉，制备方法包括：用中药粉碎机粉碎3次，每次15s过100目筛。
3.1实验方法
(1)米根霉发酵火麻籽超微粉的制备工艺，包括以下步骤：取米根霉发酵火麻籽后的混合物与水溶性淀粉以质量比4:6的比例混合，置于粉碎机中粉碎5min，取出后加水，粉碎的粉末与水的质量比为1:20，混合，用高压均质机在60Mpa条件均质20min后用450目的滤网过滤，将过滤物冻干48h去除水分，后用振动式药物超微粉机粉碎(温度10℃、粉碎时间15min)，得到米根霉发酵火麻籽超微粉，以没有经过振动式药物超微粉机粉碎的粉末为普通粉，对两者分别进行理化指标的测定。
(2)超微粉理化指标的测定
①粒径大小的测定：利用激光粒度分布仪，分别对普通粉和超微粉的粒径进行了湿法测定，以比表面积和跨度值来评价粒径大小。
②润湿性的测定：首先向培养皿中加蒸馏水50mL，然后分别加入1.0g普通粉和超微粉，测定两种粉体被水完全浸湿所需要的时间(s)，每个样品平行测定3次。
③粉体水分测定：精确称取普通粉与超微粉1.0g，并将它们分别平铺在已进行恒定重量的称量瓶中放入105℃的干燥箱中进行恒重烘干，从而计算出他的水分含量。
④持水性的测定：分别精密称取0.50g的普通粉和超微粉置于50mL的离心管中，称量后的质量为m1，向离心管中加入蒸馏水50mL再摇匀，在离心机中5000r/min下离心15min，弃去上清液，称量剩余沉淀物的重量为m2，每个样品分别平行测定3次，按下列公式进行计算：
⑤水溶性的测定：分别精密称取质量为1.0g的普通粉和超微粉，各均匀分散在50mL蒸馏水中，在80℃水浴中振荡30min使充分溶解，在离心机中6000r/min离心10min，取上清液置于105℃干燥箱中烘干至恒重，称其质量。水溶性计算公式如下:
⑥膨胀力的测定：分别精密称取1.0g普通粉和超微粉，装入50mL的量筒里，体积记为V1，加入蒸馏水50mL，搅拌均匀后在室温下静置24h，记普通粉和超微粉的体积为V2，每个样品平行测定3次，按下列公式进行计算：
⑦休止角的测定：采用BT1001智能粉体特性测试仪，将一漏斗固定在距离水平面一定距离处，分别取普通粉和超微粉适量，粉末先经过滤网，流到出料口，落到样品台上慢慢地变成一个锥形，一直到粉末在样品台上堆积成一个对称的锥形，最高处达到了漏斗的最下端停止送料，进料完成后，自动测量，每个样品平行测量3次，计算休止角。
⑧滑动摩擦角测定：采用BT1001智能粉体特性测试仪，分别称取3g的普通粉和超微粉放入玻璃板的中心位置，然后将玻璃板的一端轻轻地抬起，直至90％的粉末都掉落下来，这样就会自动地测量提起的玻璃板与水平桌面之间的角度，也就是样本的滑动摩擦角，每一个样本平行地测量3次，最后计算出滑动摩擦角。
⑨松装密度的测定：将待测普通粉和超微粉自由散落，分别装入10mL(V)量筒中，直到加满，准确称量两种粉体的质量(m)，每个样品平行测定3次。按照下列公式进行计算：
⑩振实密度的测定：使用BT1001型智能粉体性能测试仪，选用了固定体积的方法，将100mL的空烧杯置于电子天平上称重，并读出空杯的质量；将100mL的空杯与100mL的延长筒相连，组成一个振动密度组合件，然后向该组件中分别添加适量的普通粉和超微粉，达到一半以上，开始振实，直到延长筒中的粉体表面不再有任何下降才停止振实，用刮刀将100mL容器口刮平，读取满杯的质量。粉体堆密度(ρ)系指粉体质量(m)和粉体所占容积的体积(V)之比，即ρ＝m/V。当粉体质量一定的情况下，粉体的堆密度随着粒径的减小而减小。
3.2实验结果与分析
(1)米根霉发酵火麻籽普通粉和超微粉图片
普通粉：由图9可以看出，普通粉粉碎的强度小，粉体较粗，容易结成块状。超微粉：由图10可以看出，超微粉粉碎强度大，粉体细腻，分散度高。
(2)粉体粒径大小的结果分析
由图11可知，超微粉的粒径大小为837.1nm，粒径较小，与一般的颗粒相比，比表面积更大，具有溶解性好，生物利用度高的优势。由图12可以看出，散点与点位曲线拟合好，说明超微粉在水溶液中的分散性和稳定性都比较好。
(3)粉体润湿性的结果与分析
润湿性是衡量粉末性质的一项重要指标，一般是指一定量的粉末全部浸没在水中所需要的时间。一般来说，润湿所需时间越短，粉体的润湿性就会越强。由于具有较高的湿润度，粉末中的组分更易于消化和吸收，所以在各种药物中得到了广泛的使用。经检测，普通粉的润湿时间是27.41s±1.64s，超微粉的润湿时间是18.76s±1.82s，超微粉的润湿时间短于普通粉，说明其润湿性强于普通粉，可以更快速度的被溶解，在制作药品方面更具有剂型优势。除此之外，粉末的粒径越小，润湿性则越强，这表明，润湿性与粒径大小成反向变化，这可能是因为超微粉碎技术使得粉末的破壁率高，从而露出更多的水溶性物质，它可以很快地和水融合，并且在水里溶解，从而减少了溶解的时间，提高了粉体的润湿性。
(4)粉体的水合性质结果与分析
粉体的水合性质包括粉体的水分、水溶性(WS I)、持水性(WHC)及膨胀力(SC)。如表11所示，粉体水分与粉体的含水量率有关，普通粉末与超微粉的含水量都很低；粉体的持水力是其亲水性的一个重要参数，反映了其与水分的结合性能，在粉体原料的贮存、制粒等过程中起着非常关键的作用。从表11中可以看出，普通粉的持水量比超微粉要少，这表明，超微粉碎能够明显地提升粉体的持水性，出现这种现象的原因，很可能是因为超微粉碎较强的机械力，使粉体颗粒的表面能得到了有效的提升，同时，在粉末颗粒的表面上，还会有更多的活化点，这会大大加快颗粒表面的亲水性基团，例如羟基，与水分子发生相互作用。在这个过程中，因为有很强的机械力，所以超微粉的破壁率比较高，粉末中的蛋白质、多糖、纤维素等大分子物质，会与水产生相互作用，形成一个紧密的网络结构，将水分子牢牢地锁在其中，减少了水分的流失。而普通的粉体，使用的是传统的粉碎方法，因此，破碎的程度相对较低，而且粉体的颗粒较大，与水的结合力也较弱，因此，造成了持水性较低。
粉体的水溶性也反应了它的性质，由表11可以看出，随着粉末的破碎程度越来越高，颗粒直径也越来越小，粉末的水溶性也越来越大，这表明粉末的水溶性与粒径大小呈负相关，在这两种粉末中，超微粉的水溶性达到77.02％±0.25％，而普通粉的水溶性达到68.49％±0.18％，与普通粉比较，超微粉的水溶性提高了大约1.73倍，表明超微粉的水溶性明显好于普通粉。这是因为超细粉的表面积接触变大，增加了粉体表面部分亲水性基团的暴露，增加了与水的接触，所以增加了粉体的水溶性；此外，在超微粉碎时产生强大的压力和剪切力，使得粉体亲水性基团暴露更多，与水的接触面积增大，从而提高了粉体的水溶性；另外，在超微粉碎过程中，由于超微粉碎产生的巨大压力和剪切力，使粉体中的一些不溶于水的组分，例如纤维素等组分，产生了局部的链断裂，并产生了熔融的现象，进而转变成了可溶性组分，因此，超微粉的水溶性变得更大。
膨胀力代表着粉体吸水膨胀的能力，它是粉体的一个重要参数。从表11中可以看出，超微粉的膨胀力显著地比普通粉要高，这可能是因为在经过了超微粉碎之后，粉体的一些有亲水能力的基团和部分大分子暴露了更多，导致粉体与水的接触部位和接触面积都增加，在溶于水之后，分子的空间结构发生了膨胀和延伸，所以膨胀力也随之增加。一般而言，膨胀力较大的粉末，其悬浮性能较好，溶于水后的稳定性较好；而且，由于具有较大的膨胀力，在胃里消化时会产生饱腹感，从而对其它物质的消化吸收产生不利的作用，因此对肥胖、肠道癌等疾病有一定的预防作用。
表11普通粉和超微粉水分、持水性、水溶性、膨胀力的水合性质
(5)粉体的休止角和滑动摩擦角的结果分析
休止角和滑动摩擦角是反映超微粉流动性能的指标，大小在于粉末的颗粒尺寸和表面性能，休止角变大时，粉体的摩擦力也变大，粉体的流动性就会变得较差。通常情况下，当休止角＜30°时，它的流动性非常好，当休止角＞45°时，它的流动性便会非常差。但是在实际生产操作中，当休止角＜40°时，便可以满足对流动性的需求。由表12可以看出，随着颗粒尺寸的变小，休止角和滑动摩擦角都有显著的增大，其中，休止角从普通粉的47.44°减少到超微粉的38.71°，滑动摩擦角从普通粉的45.82°增大到超微粉的50.24°，表明超微粉的流动性明显好于普通粉。超微粉休止角小于40°，便能够满足日常生产的要求，粉末在经过强机械力的破碎后，其比表面积增大，颗粒间的静电吸附作用增大，从而使其表面聚合力增大，摩擦系数增大，所以粉体的滑动摩擦性较大。但是，通过增大粉体的休止角和滑动摩擦角，提高了粉体的吸附性，制作成产品后的质量会更加稳定，更重要的是在混合均匀后通常不会出现分层的现象。
表12普通粉和超微粉的休止角和滑动摩擦角
(6)粉体松装密度和振实密度的结果分析
松装密度和振实密度对粉体填充胶囊剂和片剂很重要，是评价粉体充填效果的两个重要指标，与粉体的粒径和微观结构紧密相关。松散密度、振实密度愈小，则说明粉体愈松散；松装密度和振实密度大则对填充效果更有利。在同等的体积下，粉体具有更小的粒径和更小的间距，则密度较大，质量较大；松装密度较高，振实密度较高，则对人体更有利于消化吸收。从表13可以看出，超微粉的松装密度、振实密度都比普通粉要大得多，这表明超微粉可以有效地减小粒径、增加粒子之间的空隙，从而改善了它的填充性能，在人体中更有利吸收。
表13 普通粉和超微粉的松装密度和振实密度
本实施例对米根霉发酵后的火麻籽进行了超微粉的制备，之后对超微粉的理化指标进行了检测，可以看出超微粉碎技术对米根霉发酵后火麻籽的理化特性具有一定的提高改善作用，与普通粉相比，超微粉颗粒的组织结构破碎程度比较大，得到的粒径明显更小；同时与普通粉相比，超微粉的润湿性、持水力、水溶性、膨胀力均得到了显著的提高。通过测量休止角和滑动摩擦角，发现超微粉的流动性也变好，可以满足生产的基本需求，另外超微粉的松装密度和振实密度也较好，高于普通粉，更有利于人体吸收。因此，超微粉碎处理在很大程度上提高了超微粉体的生产适应性，对火麻籽的深加工及功能性的产品开发具有很重要的作用。
实施例4降血脂作用
本实施例主要探讨体外降血脂，包括胆酸钠结合率、胰脂肪酶抑制率和胆固醇胶束溶解度抑制率的情况，通过未发酵火麻籽、米根霉发酵火麻籽和超微粉对这三项指标的作用比较情况，进而得出对体外降血脂最有效的一种。
本实施例涉及的米根霉发酵火麻籽后的产物采用以下发酵条件制备：接种量7％，含水量17％，发酵温度35℃，发酵时间12h。超微粉以米根霉发酵火麻籽后的产物为原料参照实施例3的方法制备。
4.1实验方法
(1)胆酸钠结合率的测定方法
标准曲线的制作：取不同浓度的胆酸钠标准溶液0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30mmol/L各2mL于容量瓶中，加入60％的硫酸6mL，于70℃水浴中20min后冰浴5min，紫外分光光度计在387nm波长处测定吸光度值。以胆酸盐含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘得胆酸钠的标准曲线。用同实施例1的方法计算出胆酸钠的结合率。
(2)胰脂肪酶活性抑制率的测定方法
主要溶液的配制：0.08％(w/v)月桂酸4-硝基苯脂(p-PNL)溶液：称取0.4g p-PNL,加到含1％的曲拉通X-100的醋酸钠溶液(醋酸钠的浓度是5mmol/L)中，沸水浴1min助其溶解，冷却至室温，用5mmol/L的醋酸钠溶液定容至50mL，在4℃冰箱中保存。分别吸取PH7.4的磷酸盐缓冲液3mL和0.08％的月桂酸4-硝基苯脂溶液3mL，1.0mg/mL胰脂肪酶溶液3mL，和一定量的发酵前、发酵后的火麻籽混合均匀，样品质量分别为4.5mg，9.0mg，18mg，27mg，54mg，72mg，90mg，配制成浓度为0.5、1、2、4、6、8、10mg/mL的样品溶液，在37℃恒温水浴中30min，后于410nm处测定吸光度值记为A。同时以不加样品在410nm处的吸光度为A1，加样品不加胰脂肪酶溶液(以磷酸盐缓冲液代替)在410nm处的吸光值为A0，按公式计算胰脂肪酶抑制率：
式中，C—胰脂肪酶抑制率，％；
A—样品组吸光度值；
A1—空白组吸光度值；
A0—对照组吸光度值。
(3)胆固醇胶束溶解度的抑制率测定
制作10mL的胆固醇胶束溶液，取胆固醇7.7mg，牛磺胆酸钠53.8mg，氯化钠77.1mg，油酸14.1mg，0.02mol的PH7.4的磷酸盐缓冲液7.5mL，使得1mL溶液中包含2mmol/L胆固醇、10mmol/L牛磺胆酸钠、132mmol/L氯化钠、5mmol/L油酸和15mmol/L的磷酸缓冲液，之后在160W下进行50min的超声均质，于37℃环境中放置一晚。将一定量的未发酵火麻籽粉末和发酵火麻籽粉末分别配制成浓度为1、2、4、6、8、10、12mg/mL的样品溶液，取一定量添加到胶束溶液中，再将混合均匀后的溶液在37℃下振荡培养2h，在14000r/min下离心20min，收集上清液，用胆固醇测定试剂盒来测定胶束中的胆固醇含量，样品溶液的胆固醇溶解度为A，不加样品溶液的胆固醇溶解度为A0，作为对照组，抑制率计算公式如下：
式中，A—样品溶液吸光度值；
A0—对照组吸光度值。
(4)IC50值得计算：IC50值是指样品抑制效果达到一半时的浓度，将胰脂肪酶和胆固醇胶束溶解度抑制率测定得到的实验结果与各浓度未发酵火麻籽溶液、米根霉发酵火麻籽溶液和超微粉溶液，分别将其输入IC50计算器软件中，对其进行计算，从而得到未发酵火麻籽溶液、米根霉发酵火麻籽溶液和超微粉溶液的IC50值。
4.2实验结果与分析
(1)体外结合胆酸钠效果评价
①胆酸钠标准曲线
胆酸钠标准曲线方程为y＝2.9861+0.0193，R2＝0.9994，其中，x为胆酸钠浓度mmol/L，y为吸光度。
②胆酸钠结合率结果分析：如图13所示，未发酵火麻籽的胆酸钠结合率为22.45％±2.21％，米根霉发酵火麻籽胆酸钠的结合率为65.83％±1.97％，超微粉胆酸钠的结合率为70.15％±2.32％。证明米根霉发酵火麻籽优化工艺能提高胆酸盐的结合率，提高其降血脂的功效。
(2)胰脂肪酶活性抑制率的效果分析
由图14可以看出，未发酵火麻籽、米根霉发酵火麻籽和超微粉均对胰脂肪酶的抑制作用呈浓度依赖关系，且随浓度增加而加强。未发酵火麻籽溶液浓度在小于8mg/mL时，其对胰脂肪酶活性的抑制效果随浓度增加，增长很快，8mg/mL以后抑制效果对浓度的依赖性减弱,在10mg/mL时，抑制率达到65.75％±1.94％，米根霉发酵火麻籽对胰脂肪酶的抑制效果明显更强，并且也呈现出剂量关系，在4mg/mL以后逐渐出现平台期，浓度在10mg/mL时其抑制率为93.16％±2.17％，超微粉对胰脂肪酶活性的抑制效果最好，在浓度达到8mg/mL的时候，抑制率达到99.46％±1.39％，证明了米根霉发酵火麻籽确实提高了胰脂肪酶活性抑制效果，而超微粉使药效更强。强弱为：超微粉>米根霉发酵火麻籽>未发酵火麻籽。可能是由于米根霉发酵后，火麻籽的一些大分子物质转化为了小分子物质，作用效果更强。
(3)胆固醇胶束溶解度抑制率的效果分析
本实验体外模拟人体小肠条件，比较了未发酵火麻籽、米根霉发酵火麻籽和超微粉与胆固醇的结合能力。图15中可以看出，三种样品对胆固醇的结合能力是不同的，并且随着浓度的不断增大对胆固醇的溶解度不断降低。说明这三种样品都能够降低胆固醇在胶束溶液中的溶解度，将它们与胆固醇的结合能力进行对比后发现，超微粉与胆固醇的结合能力是最强的，浓度为12mg/mL时抑制率达到85.95％±2.03％，米根霉发酵火麻籽与胆固醇结合力比未发酵火麻籽强，浓度12mg/mL时达到69.51％±1.48％，由图15中可以看出发酵前火麻籽的结合力最弱，浓度12mg/mL时对胆固醇胶束的溶解度抑制率56.31％±2.12％。强弱为：超微粉>米根霉发酵火麻籽>未发酵火麻籽。
(4)IC50值计算结果与分析
如图16所示，经过IC50值计算器的计算，在胰脂肪酶活性抑制实验中，未发酵火麻籽的IC50值为8.054mg/mL，米根霉发酵火麻籽的IC50值为1.255mg/mL，超微粉的IC50值为0.605mg/mL。在胆固醇胶束溶解度抑制活性实验中，未发酵火麻籽的IC50值为11.758mg/mL，米根霉发酵火麻籽的IC50值为7.436mg/mL，超微粉的IC50值为3.171mg/mL。由此可知，抑制活性的强弱为：超微粉＞米根霉发酵火麻籽＞未发酵火麻籽。
本实施例主要做的是体外降血脂实验，因为之前做过甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠的结合率实验，所以本实施例节只针对剩下的一种胆酸盐进行研究，得到未发酵火麻籽的胆酸钠结合率为22.45％±2.21％，米根霉发酵火麻籽胆酸钠的结合率为65.83％±1.97％，超微粉胆酸钠的结合率为70.15％±2.32％，说明超微粉对胆酸钠的结合率最好。超微粉对胰脂肪酶的抑制率浓度在8mg/mL时，抑制率达到99.46％±1.39％，米根霉发酵火麻籽浓度在10mg/mL时，抑制率是93.16％±2.17％，而未发酵火麻籽浓度在10mg/mL时，抑制率是65.75％±1.94％。对胆固醇胶束溶解度的抑制作用，超微粉溶液浓度在10mg/mL时，最高可以达到85.95％±2.03％，而未发酵火麻籽抑制率是56.32％±2.12％，米根霉发酵火麻籽抑制率是69.51％±1.48％。实验结果证明米根霉发酵火麻籽对胰脂肪酶和胆固胶束抑制作用都提高，从而提高降血脂的能力。由于超微粉使粉体的颗粒更小，更加容易被人体消化吸收，所以降血脂效果更好一些。
实施例5降血糖和抗氧化作用
本实施例重点探讨未发酵火麻籽、米根霉发酵火麻籽和超微粉三种对体外降血糖和体外抗氧化活性的能力。体外降血糖主要包括对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制，通过与降血糖药物阿卡波糖形成对照，研究三种物质对降血糖能力的强弱。体外抗氧化能力通过与传统的抗氧化剂Vc进行比较，探究三种物质对DPPH和ABTS+自由基清除能力的强弱，为之后进一步的开发利用火麻籽提供参考。
本实施例涉及的米根霉发酵火麻籽采用以下发酵条件制备：接种量7％，含水量17％，发酵温度35℃，发酵时间12h。超微粉以米根霉发酵火麻籽后的产物为原料参照实施例3的方法制备。
5.1实验方法
5.1.1体外降血糖活性研究
(1)抑制α-葡萄糖苷酶的活性测定
将0.5mL不同质量浓度(1、5、10、15、20mg/mL)未发酵火麻籽、米根霉发酵火麻籽、超微粉溶液分别与0.5mL的0.1U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液(溶于25mmol/L的pH6.8的磷酸盐缓冲液中)均匀混合，于37℃水浴中混合反应10min，再加入5mmol/L的p-NPG溶液(溶于0.1mol/LpH6.8的磷酸盐缓冲液中)0.5mL，在37℃水浴中反应15min，再加入0.1mol/L的碳酸钠溶液1mL终止反应。紫外分光光度计在405nm处测定吸光度值，用阿卡波糖做阳性对照，等体积0.1mol/L的pH6.8的磷酸盐缓冲液代替α-葡萄糖苷酶做对照组。抑制率公式如下：
式中，A—样品组吸光度；
A0—对照组吸光度；
A1—PBS缓冲液和p NPG溶液与酶溶液混合反应的吸光度；
A2—PBS缓冲液和p NPG溶液混合反应的吸光度。
(2)抑制α-淀粉酶的活性测定
将1mL不同质量浓度(1、5、10、15、20mg/mL)未发酵火麻籽、米根霉发酵火麻籽、超微粉溶液分别与2mL的1U/mL的α-淀粉酶溶液(溶于pH6.8的磷酸盐缓冲液中)在37℃水浴中混合反应10min，再加入1％的可溶性淀粉溶液1mL，于37℃水浴中混合反应10min，之后加入1mL的DNS试剂，沸水浴加热5min终止反应，定容至10mL。待冷却至室温后在540nm处测定其吸光度值，用阿卡波糖做阳性对照，等体积0.1mol/L的pH6.8的磷酸盐缓冲液代替α-淀粉酶做对照组。抑制率公式如下：
式中，A—样品组吸光度；
A0—对照组吸光度。
5.1.2体外抗氧化活性研究
(1)DPPH体外抗氧化实验
①DPPH试液的制备：精密称取3.94mgDPPH放入100mL的容量瓶，然后用无水乙醇进行定容，得到0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液。
②Vc对照实验：精密称取25mg的Vc于10mL的容量瓶中，用去离子水定容，制备成2.5mg/mL的Vc对照品溶液；然后依次用去离子水稀释成0.0625mg/mL，0.125mg/mL，0.25mg/mL，0.5mg/mL，1.0mg/mL的对照品溶液。
③样品溶液的制备：将样品制成0.0625mg/mL，1.0mg/mL，10mg/mL，20mg/mL，40mg/mL，60mg/mL，80mg/mL的溶液，以1:25的料液比加入70％的乙醇溶液溶解，在280W，45℃条件下超声提取1h，后8000r/min离心20min，取上清液备用。
④DPPH清除能力的测定：分别吸取2mL各浓度Vc对照溶液、未发酵火麻籽溶液、米根霉发酵火麻籽溶液以及超微粉溶液，加入2mL的DPPH溶液，充分混和均匀后，密封且避光放置30min，在517nm处测定各样品的吸光度值，得到的结果带入DPPH清除率公式，计算出各浓度的Vc对照溶液、未发酵火麻籽溶液、米根霉发酵火麻籽溶液和超微粉溶液的清除率。清除率计算公式如下：
式中，A0—2mLDPPH溶液和2mL无水乙醇的吸光度；
A1—2mL样品溶液和2mL无水乙醇的吸光度；
A2—2mLDPPH溶液和2mL样品溶液的吸光度。
(2)ABTS+体外抗氧化实验
①ABTS+试液的制备：精密称取过硫酸钾6.62mg和ABTS+38.4mg于10mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容，配制成ABTS+母液。在室温下避光反应16h后，用1mmol/L的pH 7.4的PBS缓冲液稀释ABTS+母液的吸光度值在734nm波长处为0.70+0.02左右，即得到ABTS+试液。
②Vc对照实验：精密称取25mg的Vc于10mL的容量瓶中，用去离子水进行定容，制备成2.5mg/mL的Vc对照品溶液；然后依次用去离子水稀释成0.0625mg/mL，0.125mg/mL，0.25mg/mL，0.5mg/mL，1.0mg/mL的对照品溶液。
③样品溶液的制备：将样品制成0.0625mg/mL，1.0mg/mL，10mg/mL，20mg/mL，40mg/mL，60mg/mL，80mg/mL的溶液，以1:25的料液比加入70％的乙醇溶液溶解，在280W，45℃条件下超声提取1h，后8000r/min离心20min，取上清液备用。
④ABTS+清除能力的测定：用移液枪吸取4.8mLABTS+试液，分别加入0.2mL各浓度Vc对照溶液、未发酵火麻籽溶液、米根霉发酵火麻籽溶液以及超微粉的样品溶液，之后所有液体超声振荡30s，密封避光处理，反应6min后利用紫外分光光度计在734nm波长下检测各试样的吸光度，吸光度值记为A，空白用1mmol/LpH值为7.4的磷酸盐缓冲液调零，结果带入ABTS+清除率公式，计算各浓度的Vc对照溶液，未发酵火麻籽溶液、米根霉发酵火麻籽溶液和超微粉溶液的清除率，清除率计算公式如下：
(3)IC50值的计算
IC50值是指样品清除自由基达到一半时的浓度，将α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制能力、DPPH和ABTS+清除能力测定得到的实验结果与各样品的不同浓度，分别输入到IC50值计算器软件中，对其进行计算，以得到阿卡波糖对照溶液、Vc对照溶液、未发酵火麻籽溶液、米根霉发酵火麻籽溶液和超微粉溶液对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制能力、DPPH和ABTS+清除能力的IC50值。
5.2实验结果与分析
(1)α-葡萄糖苷酶活性抑制效果评价
由图17可以看出，四种溶液对α-葡萄糖苷酶均有不同的抑制效果，且对剂量有依赖关系。随着溶液质量浓度的增大，阿卡波糖、未发酵火麻籽、米根霉发酵火麻籽、超微粉对α-葡萄糖苷酶的抑制率均不断上升。在浓度为1mg/mL，5mg/mL，10mg/mL，15mg/mL，20mg/mL不同浓度下，未发酵火麻籽对α-葡萄糖苷酶的抑制率分别为20.06％±1.96％，46.38％±2.21％，50.35％±2.15％，56.25％±2.18％，66.08％±1.76％，米根霉发酵火麻籽对α-葡萄糖苷酶的抑制率分别为31.91％±1.69％，54.48％±2.09％，61.58％±1.57％，71.41％±2.27％，75.46％±1.59％；超微粉对α-葡萄糖苷酶的抑制率分别为27.94％±2.36％，44.71％±2.35％，47.85％±2.39％，71.05％±2.21％，87.53％±2.20％，阿卡波糖在浓度为0.1mg/mL，0.25mg/mL，0.5mg/mL，0.75mg/mL，1.0mg/mL下，对α-葡萄糖苷酶的抑制率分别为38.75％±2.16％，62.84％±2.53％，78.81％±2.12％，86.52％±1.67％，95.08％±3.14％。因此，在α-葡萄糖苷酶活性抑制效果实验中，抑制率的强弱为：阿卡波糖＞超微粉＞米根霉发酵火麻籽＞未发酵火麻籽。
阿卡波糖是一种降糖药，作为药品有着明确的禁忌症和多种注意事项，存在不良反应。但是，超微粉与米根霉发酵火麻籽以药食同源的火麻籽为原料制备而成，安全性更好、无不良反应，除了降血糖功效外，还具有降血脂、抗氧化、预防肥胖、预防肠道癌等功效，在食品、保健品等领域更有优势。
(2)α-淀粉酶活性抑制效果评价
由图18可以看出，4种溶液对α-淀粉酶均有不同的抑制效果，且对剂量有依赖关系。随着溶液质量浓度的增大，未发酵火麻籽、米根霉发酵火麻籽、超微粉和阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制率均不断上升。在浓度为1mg/mL，5mg/mL，10mg/mL，15mg/mL，20mg/mL不同浓度下，未发酵火麻籽对α-淀粉酶的抑制率分别为3.23％±0.14％，10.13％±1.02％，20.04％±1.27％，31.94％±2.03％，40.76％±2.12％，米根霉发酵火麻籽对α-淀粉酶的抑制率分别为10.80％±1.04％，14.93％±1.26％，31.60％±1.52％，44.60％±2.20％，53.13％±2.07％；超微粉对α-淀粉酶的抑制率分别为14.61％±0.64％，24.25％±1.08％，40.88％±1.16％，55.13％±2.13％，67.70％±2.12％，阿卡波糖在浓度为0.1mg/mL，0.25mg/mL，0.5mg/mL，0.75mg/mL下，对α-淀粉酶的抑制率分别为34.88％±2.35％，48.99％±2.28％，62.61％±2.45％，74.18％±2.31％，80.42％±1.88％。因此，在α-淀粉酶活性抑制效果实验中，抑制率的强弱为：阿卡波糖＞超微粉＞米根霉发酵火麻籽＞未发酵火麻籽。
(3)DPPH体外抗氧化实验结果与分析
实验结果如图19所示，5个浓度的Vc溶液的清除率分别为35.78％±2.15％，42.31％±2.14％，58.60％±1.88％，74.36％±1.86％，90.68％±1.63％，可以看出随着Vc溶液浓度升高，对DPPH自由基的清除力不断增强；未发酵火麻籽7个浓度的清除率分别是0.21％±0.06％，8.24％±0.21％，37.06％±1.18％，41.32％±2.30％，52.24％±2.32％，62.35％±2.40％，63.92％±1.69％，可以看出对DPPH自由基的清除力比较弱；米根霉发酵火麻籽7个浓度的清除率分别是0.23％±0.06％，8.31％±0.44％，32.96％±1.15％，41.41％±1.85％，54.46％±2.08％，62.94％±2.43％，70.70％±1.96％，当浓度达到80mg/mL时的清除率达到了70％以上，对DPPH自由基的清除率明显高于未发酵的火麻籽；超微粉7个浓度的清除率分别是9.67±0.69％，26.84±1.01％，47.75±1.40％，55.53±1.98％，73.53％±2.11％，79.76％±1.77％，90.05％±1.85％，在浓度较低的时候，超微粉的清除能力低于Vc溶液，但是随着浓度的不断增加，超微粉具有与Vc溶液相似的清除能力，说明超微粉对DPPH的清除能力比较好。因此，在DPPH体外抗氧化实验中，清除自由基能力的强弱为：Vc＞超微粉＞米根霉发酵火麻籽＞未发酵火麻籽。在评价抗氧化活性时，以Vc为对照是最常用的实验方法，本发明以Vc为对照可以证明超微粉、米根霉发酵火麻籽具备抗氧化性。除了抗氧化活性外，米根霉发酵火麻籽和超微粉还有其他营养成分与功效，是Vc所不具备的。例如：超微粉与米根霉发酵火麻籽还含有黄酮、多糖以及小分子肽等活性成分，除了抗氧化外还兼具降血糖、降血脂预防肥胖、预防肠道癌等功效。
(4)ABTS+体外抗氧化实验结果与分析
实验结果如图20所示，5种浓度的Vc溶液的清除率分别为31.40±1.19％，59.21％±2.23％，95.74％±1.87％，99.78％±2.11％，99.91％±1.85％，可以看出随着Vc溶液浓度不断升高，其对ABTS+自由基的清除能力不断增强，Vc溶液对ABTS+自由基有很强的清除力；未发酵火麻籽7个浓度的清除率分别是0.14％±0.01％，9.06％±0.61％，44.84％±1.91％，65.08％±2.45％，79.68％±2.11％，84.71％±2.26％，84.94％±2.03％，可以看出在低浓度是其对ABTS+自由基的清除能力较弱，随着浓度升高清除率也逐渐升高，说明其对ABTS+自由基具有一定的清除能力；米根霉发酵火麻籽7个浓度的清除率分别是0.47％±0.13％，13.51％±1.76％，48.28％±2.07％，65.36％±2.14％，81.38％±1.88％，92.48％±2.06％，97.03％±1.72％；超微粉7个浓度的清除率分别是9.61％±0.62％，31.75％±1.71％，47.13％±1.95％，65.63％±1.91％，82.25％±2.07％，92.92％±2.35％，97.13％±1.99％，可以看出，米根霉发酵火麻籽和超微粉对ABTS+的清除能力明显提高，具有与Vc溶液相似的清除能力，说明米根霉发酵火麻籽和超微粉对ABTS+的清除能力比较好。因此，在ABTS+体外抗氧化实验中，清除自由基能力的强弱为：Vc＞超微粉＞米根霉发酵火麻籽＞未发酵火麻籽。
(5)IC50值计算结果与分析
如表14所示，通过α-葡萄糖苷酶活性抑制实验，经过IC50值计算器的计算，得到阿卡波糖的IC50值为0.158mg/mL，未发酵火麻籽的IC50值为8.255mg/mL，米根霉发酵火麻籽的IC50值为23.646mg/mL，超微粉的IC50值为4.620mg/mL。在α-淀粉酶活性抑制实验中，阿卡波糖的IC50值为0.231mg/mL，未发酵火麻籽的IC50值为34.594mg/mL，米根霉发酵火麻籽的IC50值为24.080mg/mL，超微粉的IC50值为12.241mg/mL。由此可知，降血糖活性抑制能力的强弱为：阿卡波糖＞超微粉＞米根霉发酵火麻籽＞未发酵火麻籽。
表14阿卡波糖、未发酵火麻籽、米根霉发酵火麻籽和超微粉对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性抑制的IC50值
如表15所示，经过IC50值计算器的计算，在DPPH体外抗氧化实验中，Vc的IC50值为0.145mg/mL，未发酵火麻籽的IC50值为29.882mg/mL，米根霉发酵火麻籽的IC50值为27.926mg/mL，超微粉的IC50值为5.554mg/mL。在ABTS+体外抗氧化实验中，Vc的IC50值为0.089mg/mL，未发酵火麻籽的IC50值为12.827mg/mL，米根霉发酵火麻籽的IC50值为7.346mg/mL，超微粉的IC50值为2.870mg/mL。由此可知，去除自由基能力的强弱为：Vc＞超微粉＞米根霉发酵火麻籽＞未发酵火麻籽。
表15Vc对照液、未发酵火麻籽、米根霉发酵火麻籽和超微粉的IC50值
体外降血糖实验的结果表明，对α 葡萄糖苷酶和α 淀粉酶的活性抑制强弱如下：阿卡波糖＞超微粉＞米根霉发酵火麻籽＞未发酵火麻籽。超微粉对α 葡萄糖苷酶的活性抑制率达到87.53％±2.20％，对α-淀粉酶的活性抑制率可以达到67.70％±2.12％，说明米根霉发酵火麻籽超微粉具有较好的降血糖功效；体外抗氧化实验的结果表明，对DPPH和ABTS+的清除能力强弱如下：Vc＞超微粉＞米根霉发酵火麻籽＞未发酵火麻籽。超微粉对DPPH的清除率率达到90.05％±1.25％，对ABTS+的清除率可以达到97.13％±1.99％，说明米根霉发酵火麻籽超微粉具有较好的抗氧化活性功效。
综上所述，本发明以火麻籽为原材料，采用米根霉菌种进行发酵，找到与胆酸盐结合率最高的发酵条件，之后将发酵后的产物制成超微粉，通过一些粉体性质的测定，来发掘超微粉这种剂型的优势所在；并且通过发酵前后的组分含量变化，确定发酵对哪些成分有影响，以便之后对火麻籽的进一步研究提供参考；之后进行降血脂、降血糖抗氧化的初步研究。
(1)将发酵后的产物进行胆酸盐结合率的研究，以甘氨胆酸钠结合率和牛磺胆酸钠结合率为指标，首先进行单因素试验，分别以米根霉接种量、发酵时间、含水量、发酵温度作为影响因素，找到了最佳的发酵条件为米根霉接种量为8％，发酵时间为12h，含水量为22％，发酵温度为35℃；之后进行的Plackett-Burman试验，得到与甘氨胆酸钠牛磺胆酸钠结合率最高的三个显著影响因素：米根霉接种量、含水量、发酵温度；然后进行3因素3水平响应面试验，最终得到发酵火麻籽对甘氨胆酸钠的结合率为75.64％±2.77％，牛磺胆酸钠结合率为65.77％±3.45％。跟未发酵火麻籽相比，发酵后的火麻籽甘氨胆酸钠结合率提高了约37.60％，牛磺胆酸钠结合率提高了约37.25％。说明火麻籽本身具体降血脂的作用，但是米根霉发酵后显著提高了其降血脂的功效。
(2)对米根霉发酵前后的组分进行含量测定，进行比较，发现米根霉发酵后黄酮、多糖、氨基酸、脂肪酸、低聚肽都有一定程度的增加，其中变化最大的是多糖和黄酮，提高了约62.69％和45.56％，氨基酸含量提高了约7.14％，脂肪酸含量提高了约11.94％，低聚肽含量提高了约7.84％，另外蛋白质含量下降了约4.54％。米根霉是一种酶系发达的霉菌，可以催化火麻籽中的组分，从而进行成分的转化。结合米根霉发酵火麻籽的发酵物的降血脂能力高于未发酵的火麻籽，说明米根霉发酵火麻籽黄酮和多糖的大幅提高，可以说明发酵物中的黄酮和多糖的增加对其降血脂能力的增强有着促进作用。
(3)将米根霉发酵火麻籽进行超微粉碎，测得超微粉的粒径837.1nm；超微粉润湿时间18.76s±1.82s；超微粉的水分1.55％±0.05％；持水性4.25±0.18(g/g)；膨胀力5.61±0.27(mL/g)和水溶性77.02％±0.25％；超微粉的休止角38.71°和滑动摩擦角50.24°；超微粉的松装密度0.51±0.23(g/cm3)和真实密度0.60±0.12(g/cm3)。使粉体的粒径更小，润湿性、持水性、水溶性、膨胀力等水合性质更好，粉体的流动性也变得更好，在人体内更有利于吸收，可以增强药效，在之后的生产中可以被应用在食品和药品行业。上述指标均优于普通粉体，证明超微粉在剂型方面的优势。
(4)对体外降血脂进行初步研究，本发明主要研究胆酸钠的结合率，胰脂肪酶的抑制率和胆固醇胶束溶解度的抑制率，发现体外降血脂的强弱顺序为：超微粉＞米根霉发酵火麻籽＞未发酵火麻籽，这与之前制备超微粉提高药效的初衷一致，证明了通过超微粉碎技术，增大了粉体表面积，更有利于提高药效。
(5)对体外降血糖和体外抗氧化做了初步研究，发现降血糖的效果较好，超微粉对α-葡萄糖苷酶的活性抑制率达到87.53％±2.20％，对α-淀粉酶的活性抑制率可以达到67.70％±2.12％，对自由基的清除能力相对更好一点，超微粉对DPPH的清除率率达到90.05％±1.85％，对ABTS+的清除率可以达到97.13％±1.99％。米根霉发酵后提高了黄酮的含量，而黄酮的自由基清除效果较好，所以发酵后火麻籽的自由基清除能力提高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
文章摘自国家发明专利，一种米根霉发酵火麻籽超微粉的制备方法，发明人：管立军，王崑仑，高扬，李家磊，严松，朱玲，张馨笛，季妮娜，李波，周野，姚鑫淼，陈凯新，陈晴，樊晶；申请号：202410395952.1；申请日：2023.09.09
