摘 要：本发明属于化妆品原料技术领域，公开了一种罗布麻发酵提取物及其制备方法和应用。该制备方法按照以下步骤：在沸水中加入5％～10％的罗布麻碎粉，90～100℃浸泡10～30min，冷却至室温得到未滤渣的罗布麻水提液；将未滤渣的罗布麻水提液加入灭活乳酸菌菌液和葡萄糖得到发酵培养基，往每公斤发酵培养基中加入假丝酵母2×108～5×1010个，在37～42℃温度下发酵3～6h得到发酵液；对发酵液进行过滤、离心、二次过滤获得罗布麻发酵提取物。发明发酵提取物降低了细胞毒性的同时减少对表皮葡萄球菌的抑制，也保留了对其它两种致病菌的抑菌效果，提高了抗炎的效果，增强了修复细胞的活性，整体上提高了效率。
权利要求书
1.一种罗布麻发酵提取物的制备方法，其特征在于按照以下操作步骤：
(1)向沸水中加入罗布麻碎粉，90～100℃浸泡10～30min，冷却至室温得到未滤渣的罗布麻水提液；所述罗布麻碎粉的质量为沸水质量的5％～10％；
(2)将步骤(1)所得未滤渣的罗布麻水提液加入灭活乳酸菌菌液和葡萄糖得到发酵培养基，往每公斤发酵培养基中加入假丝酵母2×108～5×1010个，在37～42℃温度下发酵3～6h得到发酵液；所述灭活乳酸菌菌液的加入量为未滤渣的罗布麻水提液质量的5％～10％，所述葡萄糖的加入量为未滤渣的罗布麻水提液质量的0.2％～1％；
(3)对步骤(2)所得发酵液进行过滤、离心、二次过滤获得罗布麻发酵提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述罗布麻为市售罗布麻，包含市售罗布麻的茎和叶；所述罗布麻碎粉为罗布麻粉碎至20目以上。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述乳酸菌为植物乳杆菌、双歧杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、肠膜明串珠菌的一种或者多种组合乳酸菌；所述假丝酵母为热带假丝酵母、齐藤假丝酵母、蜂生假丝酵母的一种或多种组合。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述灭活乳酸菌菌液的总菌数不少于5×1010个/mL。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述灭活乳酸菌菌液由相应的乳酸菌液体培养基培养后离心得到菌体，用纯化水重悬至所需浓度，再经过高温灭菌获得。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述过滤是过50～400目筛；所述离心是采用5000～15000rpm转速进行离心；所述二次过滤是采用0.22～0.45um滤膜进行过滤。
7.一种由权利要求1所述的制备方法制备得到的罗布麻发酵提取物。
8.根据权利要求7所述的罗布麻发酵提取物在化妆品中的应用。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述化妆品为具有抑菌、消炎、修复功效的化妆品。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述化妆品为面膜、精华液、爽肤水、冻干粉或清洁泡沫。权利要求书1/1页2CN116350561A2一种罗布麻发酵提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于化妆品原料技术领域，具体涉及一种植物发酵类化妆品原料及其制备方法和应用，特别涉及一种罗布麻发酵提取物及其制备方法和应用。
背景技术
罗布麻(Apocynum venetum L)是一种夹竹桃科多年生宿根半灌木，其茎叶富含黄酮类化合物，含量高达10mg/g以上。罗布麻主要抑菌物质有黄酮类化合物、鞣质、甾体及其苷类、香豆素类化合物、酚酸类和苯甲醛类化合物以及挥发油等。罗布麻提取物对人体皮肤中金葡菌、痤疮丙酸杆菌这类有害微生物有明显的抑制效果，但同时也对表皮葡萄球菌有一定的抑制，其多种组分对微生物都有不同程度的抑制作用。罗布麻主要的活性成分黄酮多酚类均易溶于水，可利用热水浸泡提取。
痤疮丙酸杆菌是一类在毛囊皮脂腺内部寄生的常驻细菌。当皮脂分泌过多、毛囊口堵塞时，菌群平衡被打破，痤疮丙酸杆菌容易过量繁殖，诱发多种炎症因子，从而造成痤疮症状。目前针对痤疮的治疗，主要是采取内服及外用敏感的抗菌药物的方法。外用药物包括克林霉素凝胶、过氧化本甲酰凝胶等，口服大环内酯类以及四环素类的抗菌素，能够明显的改善痤疮症状。但抗生素的的广泛使用令痤疮丙酸杆菌的耐药性越来越普遍，一项欧洲的调查显示，超过2/3的样本中发现了耐药性的痤疮丙酸杆菌，形势越来越严峻。不仅如此，抗生素药物的外用同时也对皮肤正常菌群造成影响，加速了皮肤菌群失衡。
金黄色葡萄球菌，俗称金葡菌，常见于皮肤表面及上呼吸道黏膜。当皮肤损伤存在渗出血液、组织液时，会引起区域内的金葡菌大量繁殖。在痤疮皮肤中尤其是痘痘皮损周边存在大量的金葡菌，它分泌毒素加剧了皮肤炎症，阻碍了皮肤的恢复。
表皮葡萄球菌是皮肤中的常见菌株，不产生血浆凝固酶也不分泌溶血素，一般情况下不致病，对维持皮肤菌群的平衡有重要的意义。
金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌都是引起皮肤炎症的主要微生物。在皮肤表面，皮损局部微环境对金葡菌生长更有利。主要表现在痤疮区域有较多金葡菌，它取代了表皮葡萄球菌形成优势菌群。抗生素和一些抑菌植物成分都可以有效抑制、杀灭金葡菌，但同时对表皮葡萄球菌也有较大的影响。当药效过后，短时间内皮肤微环境并没有发生根本性变化。菌落数量都比较少的条件下，金葡萄还是会大量繁殖从而占据优势地位。要达到较好的效果通常都需要长时间定时外用药物，但实际情况往往会出现间断，从而造成痤疮反复。
祛痘除了抑制炎症，恢复的过程还涉及到皮肤的修复。以往在化妆品中可加入表皮生长因子促进皮肤的修复，然而在生长因子类产品被明确禁用后，修复类功效产物有广泛的市场需求。
乳酸菌和酿酒酵母是植物发酵中常用的微生物，往往一种或多种，一步或两步发酵协同发酵，可以提高植物活性成分的利用率，减少刺激成分降低毒性，增加活性成分溶出率，减少有机溶剂使用。乳酸菌发酵溶胞产物是化妆品中常用的生物发酵功效原料。一般乳酸菌发酵植物后会采用溶胞工艺，释放胞内的多种活性成分和菌体吸附的植物活性成分。罗布麻水提取物对乳酸菌有一定抑制效果，难以在含高比例罗布麻的发酵体系利用乳酸菌发酵。利用乳酸菌发酵少量的罗布麻，大量活性成分会被乳酸菌菌体吸附，需要溶胞工艺来释放，这造成罗布麻活性成分的损耗。利用酵母发酵，同样会面临活性成分被吸附的问题。而且，随着时间的增加，罗布麻部分活性成分还会被部分代谢消耗掉。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种罗布麻发酵提取物的制备方法。
本发明的又一目的在于提供一种上述制备方法制备得到的罗布麻发酵提取物。
本发明的再一目的在于提供一种上述罗布麻发酵提取物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种罗布麻发酵提取物的制备方法，按照以下操作步骤：
(1)向沸水中加入罗布麻碎粉，90～100℃浸泡10～30min，冷却至室温得到未滤渣的罗布麻水提液；所述罗布麻碎粉的质量为沸水质量的5％～10％；
(2)将步骤(1)所得未滤渣的罗布麻水提液加入灭活乳酸菌菌液和葡萄糖得到发酵培养基，往每公斤发酵培养基中加入假丝酵母2×108～5×1010个，在37～42℃温度下发酵3～6h得到发酵液；所述灭活乳酸菌菌液的加入量为未滤渣的罗布麻水提液质量的5％～10％，所述葡萄糖的加入量为未滤渣的罗布麻水提液质量的0.2％～1％；
(3)对步骤(2)所得发酵液进行过滤、离心、二次过滤获得罗布麻发酵提取物。
步骤(1)所述罗布麻为市售罗布麻，包含市售罗布麻的茎和叶；所述罗布麻碎粉为罗布麻粉碎至20目以上。
步骤(2)所述乳酸菌为植物乳杆菌、双歧杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、肠膜明串珠菌的一种或者多种组合乳酸菌；所述假丝酵母为热带假丝酵母、齐藤假丝酵母、蜂生假丝酵母的一种或多种组合。
步骤(2)所述灭活乳酸菌菌液的总菌数不少于5×1010个/mL。
步骤(2)所述灭活乳酸菌菌液由相应的乳酸菌液体培养基培养后离心得到菌体，用纯化水重悬至所需浓度，再经过高温灭菌获得。
步骤(3)所述过滤是过50～400目筛；所述离心是采用5000～15000rpm转速进行离心；所述二次过滤是采用0.22～0.45um滤膜过滤。
一种由上述的制备方法制备得到的罗布麻发酵提取物。
上述的罗布麻发酵提取物在化妆品中的应用。
上述化妆品为具有抑菌、消炎、修复功效的化妆品。
上述化妆品为面膜、精华液、爽肤水、冻干粉或清洁泡沫。
本发明的原理是：
为了提高罗布麻在化妆品中的使用价值，采用发酵的方式进行提取，虽然损失部分抑菌活性，使得最终的抑菌效果发生改变，同时提高和增加功效。
罗布麻中的活性成分大部分水溶，而且容易被微生物的菌体吸附，并不适合发酵利用。某些种类的假丝酵母有着适应高温、快速发酵优势，能在短时间内代谢罗布麻的刺激性成分，减少发酵造成的损耗。在罗布麻发酵培养基中加入灭活的乳酸菌菌体，通过发酵分解产生乳酸菌溶胞物，其中的菌体碎片可吸附部分罗布麻的成分。在此共同作用下，可保留大部分抑制痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌的活性成分，减少对表皮葡萄球菌的影响。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明所用方法，围绕痤疮皮肤护理的需求，以减弱对皮肤常驻微生物的影响为重心，兼顾修复和舒缓的功效，不追求最优抑菌效果；以损失少部分罗布麻的活性为代价，利用简单工艺实现多种效果。
(2)本发明所得罗布麻提取物，与水提液相比有更好的抗炎效果，增加了细胞修复活性，不需要复杂的分离方式就实现了抑菌效果的改变。满足了痤疮皮肤护理所需要抑菌、抗炎、修复的三种功效，提高罗布麻提取物的使用价值。
附图说明
图1为加入不同酵母量发酵所得罗布麻发酵提取物的细胞存活率图。
图2为不同样品对炎症因子TNF α的影响图。
图3为冻干粉样品对细胞的迁移率图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例为罗布麻发酵提取物的制备工艺：
(1)在加热桶中将纯化水煮沸后加入纯化水质量6.5％的罗布麻碎粉，95℃保温20min，冷却至室温，得到未滤渣的罗布麻水提液。
(2)将步骤(1)所得未滤渣的罗布麻水提液与灭活乳酸菌菌液和葡萄糖投入发酵罐得到发酵培养基，每公斤发酵培养基中加入假丝酵母5×109个，在40℃下发酵培养5h得到发酵液；所述灭活乳酸菌菌液的加入量为未滤渣的罗布麻水提液质量的8％，所述葡萄糖的加入量为未滤渣的罗布麻水提液质量的0.75％；
(3)将步骤(2)所得发酵液用200目过滤器过滤，滤液用管式离心机10000rpm离心，离心上清液用0.22um滤膜过滤后在无菌容器收集，得到罗布麻假丝酵母发酵提取物。
对比例1
将实施例1步骤(2)中假丝酵母换成酿酒酵母，40℃调整为37℃，以每公斤发酵培养基中加入5×109个酵母为1份，分别以1份、4份、8份、16份数量的酵母发酵，得到用不同数量酿酒酵母发酵的罗布麻发酵提取物。
对比例2
实施例1步骤(2)中假丝酵母的加入量计为1份，将假丝酵母的数量分别改为4份、8份、16份数量，其它条件不变，得到用不同数量假丝酵母发酵的罗布麻发酵提取物。
对比例3
将实施例1中的假丝酵母换成酿酒酵母，40℃调整为37℃，其它条件不变；最终得到罗布麻酿酒酵母发酵提取物。
实施例2
本实施例为实施例1所得罗布麻假丝酵母发酵提取物的体外抑菌效果评价
利用比浊法测定罗布麻假丝酵母发酵提取物对三种受试菌的最小抑菌浓度(MIC)，同时与实施例1中步骤(1)所得罗布麻水提液、对比例3所得罗布麻酿酒酵母发酵提取物对比，评价发酵前后的抑菌活性。
1.受试菌液的准备：
从平板上挑取金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌单菌落于MH肉汤培养基中，37℃培养16h，备用。
从平板上挑取痤疮丙酸杆菌于液体硫乙醇酸盐培养基中，37℃培养48h，备用。
2.供试品溶液的配制：
将罗布麻假丝酵母发酵提取物、罗布麻水提液、罗布麻酿酒酵母发酵提取物0.22um过滤器除菌，备用。
在超净工作台中无菌操作，将除菌后样品用相应的培养基梯度稀释，稀释倍数为原液的2、4、8、16、32、64、128倍，每管1mL，得到供试品溶液。
3.检测：
将受试菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌菌液调至在625nm波长检测吸收为0.090～0.10，然后用相应的培养基按1：100稀释，用培养基将上述供试品溶液分别加入等体积的含菌培养基1mL，使得最终稀释倍数为4、8、16、32、64、128、256倍系列样品浓度，金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌于37℃培养箱中静置培养24h，痤疮丙酸杆菌在厌氧罐中抽去氧气后通入无氧混合气体，37℃培养箱中72h。
4.结果判定：
将测试管与空白培养基的对照管相比，肉眼可见浑浊判断为长菌，无明显浑浊的最大稀释倍数判定检测样品MIC。
结果如表1所示，罗布麻假丝酵母发酵提取物仍保留大部分对两种致病菌抑制，同时对表皮葡萄球菌抑制减弱，由原来稀释128倍变成16倍。
表1 两种罗布麻发酵提取物和罗布麻水提液的抑菌活性
实施例3
本实施例为评估实施例1与对比例1、对比例2在细胞毒性上的差异。
具体操作为：
Raw264.7细胞株用完全培养基于37℃、5％CO2条件下培养，取对数生长期的细胞，弃去培养液残留至2mL，将细胞轻轻吹打至脱落，1000rpm、离心5min，加入新鲜含1％FBS的DMEM培养液重悬并进行细胞计数，制备3×105/mL的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，于37℃、5％CO2条件下培养24h。
设置对照组、以实施例1、对比例1、对比例2所得罗布麻发酵提取物为样品组，使用0.22um滤膜过滤后用基础培养液稀释，每组设置6个复孔，将样品配制为终浓度的2倍体系，弃去50μL培养液，对照组加入50μL基础培养液，样品组加入50μL不同浓度的样品溶液，继续培养24h；每孔加入CCK8溶液10μL，置于细胞培养箱，孵育1h，于酶标仪450nm处检测吸光度值，A0为对照组吸光度值，An为样品组吸光度值。以细胞存活率评估终浓度为0.1％的不同罗布麻样品细胞毒性，用以下公式计算。
加入不同酵母量发酵所得罗布麻提取物的细胞存活率结果图1所示，假丝酵母可以用更少的接种数量降低细胞毒性。
实施例4
本实施例为实施例1所得罗布麻发酵提取物作为原料在化妆品冻干粉剂型的应用。
该冻干粉含有质量百分比3％～15％的罗布麻发酵提取物，其它组分为常用辅料。具体为：A相：去离子水77份、甘露醇6份、磷酸氢二钠0.1份、磷酸二氢钠0.3份。B相：罗布麻发酵提取物10份。
该冻干粉的制备按照以下具体步骤：
1.将A相的组分溶解后121℃高温灭菌20min，放置冷却得到A相，备用。
2.将B相的组分加入A相中，装入西林瓶。
3.冷冻干燥成型，得到冻干粉。
所得冻干粉加入一定溶媒，溶解后即可涂抹使用。溶媒中无需加入防腐剂，罗布麻发酵提取物有一定的抑菌效果，冻干粉剂型通常一周内使用完。罗布麻发酵提取物在冻干粉中使用更能体现对皮肤微生态的友好。
实施例5
本实施例为实施例4在人体中的使用，评价罗布麻发酵提取物在人体皮肤中的实际效果。
利用实施例4所得冻干粉，加入一定量无菌水溶解，使得其中的组分罗布麻发酵提取物稀释至原浓度的10％。招募30个脸上有痘痘的志愿者，随机分成两组，脸部清洁后使用产品；使用6小时后，一次性灭菌棉签用300μl灭菌PBS蘸湿，在痘痘周边2×2cm皮肤上擦拭15～30s，放进含2mL的R2A液体培养基中，35℃震荡培养活化20min，取100μl菌液接入涂于R2A固态培养基中用于计算总菌落数，100μl菌液稀释至1mL于金黄色葡萄球菌指示片中，用于计算金黄色葡萄球菌数量；37℃培养24 48h后取出计数。以金黄色葡萄球菌与总菌落数比例评价对皮肤菌群的影响。
结果如表2所示，使用罗布麻发酵提取物的试验组金黄色葡萄球菌占比主要在10～30％区间比较多，而空白组在30％以上较多，使用罗布麻发酵提取物冻干粉可以改善痤疮皮肤中金黄色葡萄球菌比例，有助于减少其引发的炎症。
表2 罗布麻发酵提取物对金黄色葡萄球菌与总菌落数比例的影响
实施例6
本实施例为实施例1所制备假丝酵母细胞实验测试，痤疮生成的同时伴随着局部的炎症，舒缓功效以降低TNF α含量来表征。具体操作为：
1.细胞接种
1)Raw264.7细胞株用完全培养液于37℃、5％CO2条件下培养，取对数生长期的细胞，弃去培养液残留至2mL，将细胞轻轻吹打至脱落。
2)将脱落的细胞收集至离心管中后500rpm、离心5分钟。
3)离心结束后，弃掉上清液，向离心管中加入新鲜含1％FBS(胎牛血清)的DMEM培养液4mL，吸管吹打重悬细胞，血球计数板在显微镜下进行计数。
4)用细胞培养基稀释细胞至接种密度3×105/mL，接种至96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液。
5)接种结束后，放置于CO2培养箱中培养24±2h。
2.实验分组
实验中设置空白对照组、模型组、阳性对照组(LPS+甘草酸二钾)及样品组。样品组使用实施例1所得假丝酵母和实施例1中步骤(1)所得罗布麻水提液。根据细胞毒性检测的结果，选择细胞相对活力大于80 90％的浓度用无血清培养基进行稀释，每个浓度梯度下设置3个复孔。
3.配制样品工作液
用无血清培养基按下表(表3)配制不同浓度的样品工作液。
4.给药：待96孔板中细胞融合率达到60％左右时进行给药。空白对照组和模型组每孔加入100μL的无血清培养基；样品组每孔加入100μL含有相应浓度的样品工作液；阳性对照组加入100μL含有终浓度为100μg/mL的甘草酸二钾。给药完成后，将96孔板放置于CO2培养箱中培养4h。
5.LPS刺激：孵育4h后，根据实验设计，分别向已给药的孔板中加入120μL终浓度为1μg/mL的LPS的无血清培养基，空白对照组中加入无血清培养基120μL，混匀后将96孔板放置于CO2培养箱中培养20h。
6.收样：孵育培养结束后，收集110μL细胞上清液于1.5mL无菌离心管中，4℃条件下1000rpm离心15分钟取上清，立即用于后续ELISA实验。
7.ELISA检测：根据TNF ɑELISA检测试剂盒的操作说明书进行检测。
表3 样品工作液的配制
不同样品对炎症因子TNF α的影响如图2所示，罗布麻假丝酵母发酵提取物与水提浸出液均可降低TNF α的含量，发酵提取物的效果更明显。
实施例7
皮损修复涉及细胞的增殖迁移，利用细胞迁移实验评价发酵提取物对皮肤的修复效果，用各样品的最优结果作比较。
由实施例4所得罗布麻冻干粉作试验组；
使用实施例1中制备步骤(1)所得罗布麻水提液，用实施例4的方法制得冻干粉作对照组1；
使用实施例1中不加入假丝酵母酵母发酵，其它条件相同，最终所得的罗布麻提取物，用实施例4的方法制得冻干粉作对照组2；
使用实施例1中不加入灭活乳酸菌菌液，其余条件相同，最终所得罗布麻提取物，用实施例4的方法制得冻干粉作对照组3。
以人表皮生长因子EGF的适宜浓度作阳性对照组。
1.样品溶液配制
无血清培养基稀释冻干粉样品，根据每个样品细胞毒性检测的结果选择合适浓度；根据EGF标准品说明书用无血清培养基稀释至合适的活性浓度。以上样品均做4倍系列稀释，共4个稀释度，做2个复孔，操作均在无菌条件下进行。
2.操作过程
2.1先用Maker笔在12孔板背后，用直尺比划参考线，横穿过孔中心，每孔至少穿过2条线。
2.2胰酶消化处于对数期的Hacat细胞，10％FBS的培养基重悬，以10万/mL，1mL/孔接种细胞至12孔板中。
2.3第二天观察长至90％后，用无血清培养基配制样品所需的稀释浓度，每个浓度需2mL。
2.4吸弃12孔板中的上清，残留100 200μL培养基，用200μL枪头比着直尺，尽量垂直于背后的参考线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。用PBS洗涤细胞1 2次，去除脱落下的细胞，镜下观察没有漂浮的细胞即为洗涤干净。
2.5加入配置好的样品及标准品，900ul/孔，做好标记。
2.6放入37℃，5％CO2培养箱培养；按0，6，24小时选取位置拍照(每组拍摄的不同时间点要求是同一位置)，可根据实际情况调整拍摄时间。
2.7用ImageJ软件处理图片，结果以迁移率表示。
3.计算
冻干粉样品对细胞的迁移率如图3所示，本发明罗布麻假丝酵母发酵提取物有明显促进细胞迁移效果，可实现修复皮肤的功效。对比对照组1，水提罗布麻无明显活性。结合对照组2分析，乳酸菌菌体未经过假丝酵母发酵并不产生明显活性。再结合对照组3分析，水提罗布麻即使不加入乳酸菌，经发酵后也会产生明显活性，并且在加入乳酸菌菌体一起发酵后效果更优，最终实现与EGF生长因子有相似的效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
摘自国家发明专利，发明人：李洪金，张齐，申请号：202310495960.9，申请日：2023.05.05
