摘 要：本发明公开了一种抗苎麻花叶病毒的抗血清及其制备方法和应用，抗血清以RaMoV CP蛋白作为免疫原免疫大白兔得到，RaMoV CP蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。其制备方法以RaMoV CP基因为模板，通过PCR扩增得到扩增产物、酶切、连接、转化、分离得到RaMoV CP蛋白，将PepMoV CP重组蛋白作为免疫原免疫大白兔得到抗血清。本发明的抗血清可应用于苎麻花叶病毒的检测，该方法可以实现快速、高通量检测，具有快速简便、特异性强、灵敏度高、检测结果可靠的优点，可用于生产上该病毒的快速检测和预测预报。
权利要求书
1.一种抗苎麻花叶病毒的抗血清，其特征在于，所述抗血清以RaMoV CP蛋白作为免疫原免疫大白兔得到，所述RaMoV CP蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种权利要求1所述的抗血清的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以RaMoV CP基因为模板设计引物对，对感染RaMoV植物的cDNA进行PCR扩增得到扩增产物；
(2)酶切载体和所述扩增产物，用连接酶连接得到重组载体；
(3)将所述重组载体转化至感受态细胞中得到转化产物；
(4)从所述转化产物分离出RaMoV CP重组蛋白。
(5)将所述的RaMoV CP重组蛋白免疫大白兔获得多克隆抗体，即为抗苎麻花叶病毒的抗血清。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQ ID NO.4所示的DNA序列；所述下游引物为SEQ ID NO.5所示的DNA序列。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述载体为pET30a。
5.一种权利要求1所述的抗血清在制备检测苎麻花叶病毒的检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测试剂盒的成分包括：PBST缓冲液、封闭液、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗、显色液和显色终止液；所述封闭液为含1％BSA的PBST缓冲液；所述显色液为3,3',5,5' 四甲基联苯胺；所述显色终止液为用无菌水配制的浓度为2M的硫酸溶液。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用为ID ELISA检测，具体为：
S1 1、10×PBST缓冲液包被待测物，加入到酶标板中，用封闭液封闭；
S1 2、在酶标板中加入含有苎麻花叶病毒抗血清的一抗溶液，进行孵育；
S1 3、在酶标板中加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗的溶液，进行孵育；
S1 4、加入显色液进行显色，用酶标仪检测OD 450nm吸光值，OD 450nm吸光值≥2.5倍为阳性，反应孔OD 450nm吸光值＜2.5倍为阴性。
7.一种权利要求1所述的抗血清在制备检测苎麻花叶病毒的检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测试剂盒的成分包括：PBS缓冲液、封闭液、碱性过氧化物酶标记羊抗兔二抗、显色液；所述封闭液为含1％BSA的PBST缓冲液，所述显色液的成分为：0.1MNaHCO3、0.001MMgCl2、0.3g/LNBT(四唑氮兰)和0.15g/LBCIP(5 溴 4 氯 3 吲哚磷酸盐)。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用为Dot ELISA检测，具体为：
S2 1、将待检测物用PBS缓冲液研磨得到抗原溶液，将所述抗原溶液点在NC膜上用封闭液封闭；
S2 2、在NC膜上加入含有苎麻花叶病毒抗血清的一抗溶液，进行孵育；
S2 3、在酶标板中加入碱性过氧化物酶标记羊抗兔二抗的溶液，进行孵育；
S2 4、加入显色液进行显色，颜色为深蓝色至蓝紫色为阳性。
技术领域
本发明涉及植物保护技术领域，尤其涉及一种抗苎麻花叶病毒的抗血清及其制备方法和应用。
背景技术
苎麻花叶病毒(Ramie mosaic virus，RaMoV)属双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)，自然条件下，只能通过介体昆虫烟粉虱传播。该病毒在自然条件下可侵染苎麻和烟草，严重危害苎麻和烟草的产量和品质。苎麻作为我国的重要经济作物，种植历史悠久，野生苎麻和家麻的种植区域均非常广泛，且在自然环境下生活能力极强；烟草的经济附加值高，在我国种植范围广。被该病毒感染的烟草出现植株矮化、叶片皱缩、植物顶端不发育继而死亡等症状。因而由烟粉虱广泛传播的RaMoV感染苎麻、烟草等经济作物所带来的危害隐患不可小觑，一旦在田间爆发，损失将严重难以估算。同时双生病毒重组率较高，一旦RaMoV与烟粉虱传播的多种病毒发生重组，产生的危害将更为严重。
植物病毒病，目前生产上还缺乏有效的防控技术措施，预防是控制植物病毒病的最佳方法。建立高通量、快速的检测方法是预防植物病毒病最关键的技术之一。血清学方法具有这些优点，且广泛的应用于植物病毒的检测与病害诊断。目前没有应用于检测我国RaMoV分离物的快速血清学检测方法。
发明内容
本发明针对上述需要解决的技术问题，提供了一种抗苎麻花叶病毒的抗血清及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明提供了一种抗苎麻花叶病毒的抗血清，所述抗血清以RaMoV CP蛋白作为免疫原免疫大白兔得到，所述RaMoV CP蛋白的DNA序列如SEQIDNO.3所示。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的抗血清的制备方法，包括以下步骤：
(1)以RaMoV CP基因为模板设计引物对，对感染RaMoV植物的cDNA进行PCR扩增得到扩增产物；
(2)酶切载体和所述扩增产物，用连接酶连接得到重组载体；
(3)将所述重组载体转化至感受态细胞中得到转化产物；
(4)从所述转化产物分离出RaMoV CP重组蛋白。
(5)将所述的RaMoV CP重组蛋白免疫大白兔获得多克隆抗体，即为抗苎麻花叶病毒的抗血清。
上述的制备方法，进一步的，所述步骤(1)中所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQIDNO.4所示的DNA序列；所述下游引物为SEQ ID NO.5所示的DNA序列。
上述的制备方法，进一步的，所述步骤(2)中所述载体为pET30a。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的抗血清在制备检测苎麻花叶病毒的检测试剂盒中的应用，所述检测试剂盒的成分包括：PBST缓冲液、封闭液、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗、显色液和显色终止液；所述封闭液为含1％BSA的PBST缓冲液；所述显色液为3,3',5,5' 四甲基联苯胺；所述显色终止液为用无菌水配制的浓度为2M的硫酸溶液。
上述的应用，进一步的，所述应用为ID ELISA检测，具体为：
S1 1、10×PBST缓冲液包被待测物，加入到酶标板中，用封闭液封闭；
S1 2、在酶标板中加入含有苎麻花叶病毒抗血清的一抗溶液，进行孵育；
S1 3、在酶标板中加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗的溶液，进行孵育；
S1 4、加入显色液进行显色，用酶标仪检测OD 450nm吸光值，OD 450nm吸光值≥2.5倍为阳性，反应孔OD 450nm吸光值＜2.5倍为阴性。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的抗血清在制备检测苎麻花叶病毒的检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测试剂盒的成分包括：PBS缓冲液、封闭液、碱性过氧化物酶标记羊抗兔二抗、显色液；所述封闭液为含1％BSA的PBST缓冲液，所述显色液的成分为：0.1M NaHCO3、0.001M MgCl2、0.3g/L NBT(四唑氮兰)和0.15g/L BCIP(5 溴 4 氯 3 吲哚磷酸盐)。
上述的应用，进一步的，所述应用为Dot ELISA检测，具体为：
S2 1、将待检测物用PBS缓冲液研磨得到抗原溶液，将所述抗原溶液点在NC膜上用封闭液封闭；
S2 2、在NC膜上加入含有苎麻花叶病毒抗血清的一抗溶液，进行孵育；
S2 3、在酶标板中加入碱性过氧化物酶标记羊抗兔二抗的溶液，进行孵育；
S2 4、加入显色液进行显色，颜色为深蓝色至蓝紫色为阳性。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种抗苎麻花叶病毒的抗血清，以我国湖南烟草的RaMoV分离物相对保守的CP基因为模板，获得CP蛋白对应编码的氨基酸序列，并将氨基酸序列进行密码子优化，用以增加靶基因的翻译效率来提高重组蛋白的表达水平。随后进行原核表达、纯化，利用纯化的重组蛋白作为抗原，制备RaMoV专一型抗血清。
(2)(2)本发明提供了一种抗苎麻花叶病毒的抗血清的制备方法，抗RaMoV专一型抗血清的免疫原为RaMoV的CP重组蛋白，是由原核表达质粒pET30a CP表达，表达的重组蛋白含HIS标签，用Ni IDA树脂亲和层析纯化得到CP重组蛋白。
(3)本发明提供了抗苎麻花叶病毒的抗血清在检测苎麻花叶病毒中的应用，以制备的RaMoV抗血清，建立RaMoV特异性ELISA和Dot ELISA快速检测方法，为该病毒的早期诊断以及田间大规模样本大规模检测提供技术方法，应用于苎麻花叶病毒的间接ELISA检测和Dot ELISA检测。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1中RaMoV CP重组蛋白诱导表达SDS PAGE图。图中M为蛋白Marker，泳道1 2为RaMoV CP重组蛋白。
图1
图2为本发明实施例2中RaMoV CP多克隆抗体灵敏度检测结果。图中横坐标是RaMoV抗原稀释梯度，纵坐标是OD 450nm吸光值。
图2
图3为本发明实施例3中RaMoV CP多克隆抗体特异性检测结果。点1 4为感染RaMoV烟草，点5 6为健康烟草，点7 10为感染RaMoV苎麻，点11 12健康苎麻，点13 16为感染RaMoV烟粉虱，点17 18为健康烟粉虱。
图3
具体实施方式
以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1：
一种RaMoV CP蛋白多克隆抗体，以RaMoV CP蛋白作为免疫原免疫大白兔得到，具体制备方法为：
(1)制备RaMoV CP蛋白抗原：
1.1氨基酸序列获取与密码子优化：
以GenBank上报道的苎麻花叶病毒(Ramie Mosaic virus，RaMoV)基因组中的CP基因为模板，使用Primer5.0在线设计引物对，引物对由上游引物和下游引物组成，上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的碱基序列的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。引物序列如下：
F：CGCATATGATGTCGAAGCGTCCC(SEQ ID NO.1)；
R：CGGAATTCATTACTGATAGAATCATAAA(SEQ ID NO.2)。
利用上述引物对感染RaMoV的感病样品烟草DNA进行PCR扩增，得到完整的RaMoV CP基因的扩增产物。
具体的扩增体系为：Template:1μL，TopTaq:1μL，10×Top Taq buffer:5μL，2.5mM dNTPs:4μL，上游引物/下游引物(10μM)各1μL；ddH2O定容至20μL。
扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸60s，34个循环，最后72℃延伸10min。
将扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，显示在800bp位置处有单一条带，与预期序列大小一致。扩增获得苎麻花叶病毒分离物CP碱基序列。
RaMoV CP基因序列为：ATGTCGAAGCGTCCCGCCGATATAGTGATTTCAACACCCGCCTCCAAAGTACGCCGCCGGCTGAACTTCGACAGCCCCGGGATCAGCCGTGCCGCTGCCCCCACTGTCCTCGTCACAAACAGAAGACGGGCTTGGACCTACAGGCCCATGTATCGCAAGCCCAAGATGTACAGGATGTTCAGAAGCCCAGATGTTCCTCGTGGCTGTGAAGGCCCATGTAAGGTCCAGTCCTTTGAGGCCCGTCATGATGTAACCCATACTGGTAAGGTTATTTGTATTTCAGATGTCACTCGTGGTGGTGGGCTGACCCACCGAACAGGCAAGAGGTTCTGCGTAAAGTCCGTTTACGTATTGGGTAAGATCTGGATGGATGAGAATATTAAGGTTAAGAACCATACAAATACAGTCATGTTTTTTGTTGTCCGAGACAGGAGGCCTTATGGAACCCCCCAGGATTTTGGGCAGGTGTTCAACATGTATGACAATGAGCCCAGTACTGCCACTGTGAAGAACGATCTTAGAGATCGTTTTCAAGTTATCCGTCGTTTTACGTCAACTGTTACTGGAGGTCAATATGCGAGCAAGGAACAAGCCCTTGTCAAGAAGTATATGAAGGTTAACGCTCAGGTGGTTTATAACCACCAGGAAGCTGGGAAATATGAGAATCATACTGAGAATGCTTTATTATTGTATATGGCTTGTACGCATTCTAGTAATCCCGTGTATGGAACTTTGAAAATCAGGATCTATTTTTATGATTCTATCAGTAATTAA。
翻译对应编码的氨基酸序列，氨基酸序列如下：
MSKRPADIVISTPASKVRRRLNFDSPGISRAAAPTVLVTNRRRAWTYRPMYRKPKMYRMFRSPDVPRGCEGPCKVQSFEARHDVTHTGKVICISDVTRGGGLTHRTGKRFCVKSVYVLGKIWMDENIKVKNHTNTVMFFVVRDRRPYGTPQDFGQVFNMYDNEPSTATVKNDLRDRFQVIRRFTSTVTGGQYASKEQALVKKYMKVNAQVVYNHQEAGKYENHTENALLLYMACTHSSNPVYGTLKIRIYFYDSISN。
将上述氨基酸序列进行密码子优化，并于5’端添加His标签序列，优化后得到的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：
CACCATCATCATCATCATAGCAAACGCCCGGCGGATATTGTTATTAGCACCCCGGCAAGTAAAGTCCGTCGTCGCCTGAACTTTGATAGCCCGGGTATTAGTCGCGCAGCAGCACCGACCGTTTTAGTTACCAATCGTCGTCGCGCTTGGACCTATCGTCCGATGTACCGCAAACCGAAAATGTACCGCATGTTTCGTAGTCCGGACGTTCCGCGCGGTTGCGAAGGTCCGTGTAAAGTCCAGAGCTTTGAAGCACGTCACGACGTTACCCATACCGGCAAAGTCATCTGCATTAGCGACGTTACCCGCGGCGGCGGTTTAACCCATCGTACCGGTAAACGCTTCTGCGTTAAAAGCGTCTACGTCCTGGGCAAAATCTGGATGGACGAGAACATCAAAGTCAAAAACCACACCAACACCGTGATGTTCTTTGTCGTTCGCGATCGTCGTCCGTACGGTACCCCGCAAGATTTTGGTCAAGTCTTCAACATGTACGACAACGAACCGAGCACCGCAACCGTTAAAAACGATCTGCGCGATCGCTTTCAGGTCATTCGTCGTTTTACCAGCACCGTTACCGGCGGTCAATACGCAAGTAAAGAGCAGGCGCTGGTCAAAAAATACATGAAAGTCAACGCGCAGGTCGTTTATAACCATCAGGAAGCGGGCAAATACGAAAACCACACCGAAAACGCGTTACTGCTGTACATGGCTTGCACCCATAGCAGTAATCCGGTTTACGGTACCCTGAAAATCCGCATCTACTTCTACGACAGCATCAGCAACTAA。
1.2原核表达载体构建：
体外合成少量上述核酸片段，以上述密码子优化后的核苷酸序列为模板，使用Primer5.0在线设计引物对，引物对由上游引物和下游引物组成，引物5’端添加酶切位点，上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物的碱基序列的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。引物序列如下：
F：CATATGCACCATCATCATCATCAT(SEQ ID NO.4)；
R：AAGCTTTCATTAGTTGCTGATGC(SEQ ID NO.5)。
利用上述引物对密码子优化核酸序列进行PCR扩增，具体的扩增体系和扩增程序同1.1。重组质粒的构建采用双酶切法，参照说明书进行：将优化后基因的PCR产物和pET30a通过NdeI Hind III进行双酶切，分别纯化后，用T4连接酶连接，得到重组表达载体pET30a CP。
1.3重组蛋白的表达和分析：
在42℃热激50S，使重组载体转化至BL21(DE3)感受态细胞，得到转化产物(转化方法参照[美]J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002)。
将得到的转化产物涂布于含50(μg/mL)的卡那霉素的LB平板，37℃倒置培养12h。
挑取平板上的阳性单菌落，采用菌落PCR验证。
含有pET30α CP重组子的工程菌Rosetta pET30α CP接种到4mL的LB培养基中(含50μg/mL的卡那霉素)，培养至OD 600＝0.5～0.8，将上述培养液以1∶100体积比接种于20mL的LB培养基中培养至OD 600为0.6～0.7(培养时间一般为2～4h)，加入诱导剂异丙基 β d 硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.8mM，于37℃继续培养，并在培养时间为16h内取菌液检测。取菌液，离心收集菌体。取诱导的菌液作为对照。
全菌采用20mMPB(pH7.2)，300mM NaCl，20mM Imidazole含1％TritonX 100，1mM DTT，1mM PMSF超声裂解，同时以20mM PB(pH7.2)，300mM NaCl，20mM Imidazole缓冲液平衡Ni IDA亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分。
将收集的洗脱组分用12％(v/v)SDS PAGE凝胶在100V，25mA的电泳条件下电泳2h，然后用考马斯亮蓝染液(考马斯亮蓝染液的成分包括：0.1％(w/v)考马斯亮兰，45％(v/v)甲醇，10％(v/v)冰醋酸、余量的ddH2O)染色15min，最后用脱色液(脱色液的成分包括：40v/v％甲醇，10v/v％冰醋酸，50v/v％无菌水脱色1h后观察电泳结果。电泳结果参见图1。
从图1的电泳结果中可知：收集的洗脱组分有约35kDa的蛋白表达，此大小与CP蛋白氨基酸序列加上标签His基因融合蛋白的氨基酸分子大小基本一致，认为此蛋白为融合表达CP蛋白。
1.4重组蛋白纯化和浓度测定：
经Ni IDA亲和层析纯化分析，收集纯度较高的Lane1 2，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液(缓冲液的成分为：1×PBS(pH7.4)，4mM GSH，0.4mM GSSG，0.4ML Arginine，1M Urea，5％Glycerol)中复性，复性后CP His蛋白最终透析于储存液1×PBS(pH7.4)溶液约6 8h。透析复性结束后，上清用0.22μm滤器过滤后分装，并将其冻存至 80℃。
(2)制备RaMoV CP蛋白多克隆抗体：
以纯化蛋白CP His为抗原，免疫2只新西兰白兔(2 2.5kg)，皮下免疫，初免剂量为300μg/只，二免、三免、四免的剂量为150μg/只，2 3周免疫1次。免疫4次后，采血检测，使用抗原亲和纯化的方法获得针对CP His抗原的特异性多克隆抗体和抗血清，所得的RaMoV CP多克隆抗体的浓度为1.22mg/ml。
实施例2
一种实施例1的RaMoV CP蛋白多克隆抗体在在检测苎麻花叶病毒中的应用，具体的实验过程如下：
(1)包被：用10×PBST缓冲液包被RaMoV抗原，将实施例1中所述的RaMoV蛋白稀释液(即为RaMoV抗原)，用抗体稀释液进行梯度稀释，依次稀释1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、16000倍、32000倍、64000倍、128000倍的各RaMoV抗原梯度稀释液，在酶标板的各孔中依次加入100μl前述各RaMoV抗原梯度稀释液，4℃过夜。用含1％BSA的10×PBST缓冲液(pH7.4)作为阴性对照。
所述BSA为牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum，BSA)。
(2)洗板：将已包被的酶标板用PBST洗涤三次，5分钟/次。
(3)封闭：每孔加入150ul封闭液，37℃封闭60分钟。所述洗涤液为的10×BST缓冲液(pH7.4)；所述封闭液为含的1％BSA的PBST缓冲液。
(4)洗板：用PBST洗涤三次，5分钟/次。
(5)加一抗：封闭后的酶标板按原加有不同稀释倍数的RaMoV抗原的各孔中加入200μl一抗稀释液，37℃孵育1小时。所述一抗稀释液是将实施例2获得的浓度为1.22mg/ml的RaMoV CP多克隆抗体，用抗体稀释液稀释为500倍的RaMoV CP多克隆抗体(即浓度为2.44μg/ml的RaMoV CP多克隆抗体)，所述抗体稀释液为含1％BSA的10×PBST缓冲液(pH7.4)。
(6)洗板：用PBST洗涤三次，5分钟/次。
(7)加二抗：每孔加入二抗稀释液200μl，37℃温育1h，用10×PBST缓冲液(pH7.4)洗涤3次。所述二抗稀释液为将辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase，HRP)标记羊抗兔二抗用抗体稀释液稀释至5000倍，所述抗体稀释液为含1％BSA的PBST缓冲液。
(8)洗板：用PBST洗涤三次，5分钟/次。
(9)显色：加入TMB(3,3',5,5' 四甲基联苯胺)底物溶液100μl/孔，反应约15min，最后加入100μl2mol/L硫酸终止液终止反应。所述显色终止液为用无菌水配制的浓度为2M的硫酸溶液。
(10)测OD值：用酶标仪在450nm波长下测定OD值。以各孔的OD 450nm吸光值为纵坐标，以本实施例步骤(2)中所述的RaMoV抗原梯度稀释液的稀释度为横坐标，结果见图2。取阴性对照OD 450nm吸光值的2.5倍为临界值，反应孔OD 450nm吸光值≥2.5倍为阳性，反应孔OD 450nm吸光值＜2.5倍为阴性。
图2表明，在RaMoV多克隆抗体稀释2000倍时(浓度为0.25μg/ml)，抗原的最大稀释倍数为128000倍，即抗原的浓度为3.9ng/ml，此时RaMoV多克隆抗体仍能特异性的识别RaMoV抗原，表明其RaMoV CP多克隆抗体的灵敏度高。
实施例3
一种实施例1的RaMoV CP蛋白多克隆抗体在在检测苎麻花叶病毒中的应用，采用Dot ELISA法检测RaMoV CP多克隆抗体的特异性。测试以下3种样品：RaMoV侵染的三生烟苗叶片、RaMoV侵染的苎麻叶片和RaMoV侵染的烟粉虱成虫。
Dot ELISA法的实验步骤包括：
(1)样本制备：0.1g植株叶片或烟粉虱成虫，加入1mL 0.01mol/L的PBS缓冲液充分碾磨，12000rpm离心5min，上清即为抗原溶液。
(2)封闭：每个样品取2μL点在NC膜上，37℃孵育30min，将NC膜浸入封闭液中，37℃室温封闭30min。用PBST洗涤液洗涤3次，每次5min。所述洗涤液为的10×PBST缓冲液(pH7.4)；所述封闭液为含的1％BSA的PBST缓冲液。
(3)加一抗：NC膜置于50mL一抗稀释液，37℃孵育1h，然后用洗涤液洗涤3次，每次5min。所述洗涤液为10×PBST缓冲液；所述一抗稀释液是将实施例2获得的浓度为1.22mg/ml的RaMoV CP多克隆抗体，用抗体稀释液稀释为500倍的RaMoV CP多克隆抗体(即浓度为2.44μg/ml的RaMoV CP多克隆抗体)，所述抗体稀释液为含1％BSA的10×PBST缓冲液(pH7.4)。
(4)加二抗：NC膜置于二抗稀释液，37℃温育30min，用10×PBST缓冲液(pH7.4)洗涤5次，每次5min。所述二抗稀释液为将碱性过氧化物酶(Alkaline Peroxidase，AP)标记羊抗兔二抗用抗体稀释液稀释至5000倍，所述抗体稀释液为PBST缓冲液。
(5)显色：NC膜置于20mL底物NBT/BCIP稀释液(1∶500稀释)中进行显色，室温下显色10min。所述显色液含0.1M NaHCO3、0.001M MgCl2、0.3g/LNBT(四唑氮兰)和0.15g/L BCIP(5 溴 4 氯 3 吲哚磷酸盐)。
(6)结果判定：颜色为深蓝色至蓝紫色为阳性。
图3为本发明实施例3中RaMoV CP多克隆抗体特异性检测结果。点1 4为感染RaMoV烟草，点5 6为健康烟草，点7 10为感染RaMoV苎麻，点11 12健康苎麻，点13 16为感染RaMoV烟粉虱，点17 18为健康烟粉虱。
图3结果表明，感染RaMoV的烟草、苎麻叶片和烟粉虱样本显示深蓝色，未感染RaMoV的烟草、苎麻叶片和烟粉虱样品不显示深蓝色，表明RaMoV CP多克隆抗体特异性强。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
摘自国家发明专利，发明人：彭静，高阳，张德咏，刘勇，郑立敏，谭新球，史晓斌，朱春晖，张卓，孙书娥，申请号：202210923345.9，申请日：2022.08.02
