摘  要:以静态吸附率和解吸率为指标,筛选出适合荷叶?罗布麻总黄酮纯化的最佳大孔树脂,再用其进行动态吸附考察;采用单因素试验和正交试验优化荷叶?罗布麻总黄酮的纯化工艺条件?结果表明:荷叶?罗布麻总黄酮纯化的最佳树脂均是AB-8型大孔树脂,荷叶总黄酮最佳纯化工艺条件为上样流速3.0BV/h?上样质量浓度1.606mg/mL?乙醇体积分数80%?上样量1.4BV,在此条件下荷叶总黄酮含量为65.75%;罗布麻总黄酮最佳纯化工艺条件为上样流速1.5BV/h?上样质量浓度2.394mg/mL?乙醇体积分数80%?上样量1.5BV,在此条件下罗布麻总黄酮含量为46.75%?

关键词:大孔树脂;荷叶;罗布麻;总黄酮;纯化

 

荷叶为睡莲科属植物,生长在水上?陆地或湖泊,在我国资源十分丰富^[1]?现代医学研究证明,荷叶中含有大量的黄酮类和生物碱类物质,具有降血脂?治疗动脉粥样硬化?抑菌等功效^[2]?罗布麻在中国淮河?秦岭以北各省(自治区)都有分布?现代研究认为其可预防和治疗高血压,对增强机体抗病能力均有一定作用,为延年益寿?养生之药^[3]?

大孔树脂是一类有机高聚物吸附剂,其理化性质稳定,不溶于酸?碱及有机溶剂,选择性较好,与其他分离技术相比,它具有提高有效成分的相对含量?生产周期短?树脂再生方便等优点,因而近几年在天然产物的分离纯化中被广泛应用,尤其适用于黄酮类化学物的分离纯化^[4]?本研究筛选出适合荷叶和罗布麻总黄酮纯化的最佳大孔树脂,并优化得到纯化荷叶?罗布麻总黄酮的最佳条件,可为荷叶和罗布麻的有效开发利用提供理论依据?

1材料与方法

1.1材料与试剂

荷叶?罗布麻,湖北济善堂中药饮片有限公司;芦丁标准品(≥98%),天津一方科技有限公司;无水乙醇?浓盐酸?氢氧化钠?硝酸铝?亚硝酸钠,分析纯;D315大孔吸附树脂?D101大孔吸附树脂?X-5大孔吸附树脂?AB-8大孔吸附树脂?HPD600大孔吸附树脂?HPD450大孔吸附树脂,郑州勤实科技有限公司?

1.2仪器与设备

YP-202N型电子天平,上海精密科学仪器有限公司;RE-5ZCS型旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器有限公司;TDZ5-WS型低速离心机,长沙湘麓离心机仪器有限公司;DG-120型中草药粉碎机,浙江省瑞安市飞达器械有限公司;KQ-3200E型超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;SP-752型紫外分光光度计,上海光谱仪器有限公司;SPX-100B-D型全温振荡培养箱,常州诺基仪器有限公司?

1.3方法

1.3.1罗布麻?荷叶的总黄酮标准曲线的制作

精密称取芦丁标准品,用体积分数30%乙醇配制成0.15mg/mL芦丁标准品对照液,精准量取对照液0?1.00?2.00?3.00?4.00?5.00mL分别移入标有0?1?2?3?4?5号的10mL比色管中,分别加入体积分数30%乙醇至5mL,各加入0.05g/mLNaNO2溶液0.3mL,摇匀,静置6min,再加入0.1g/mLAl(NO3)3溶液0.3mL,摇匀,静置6min后,加入0.04g/mLNaOH溶液2.0mL,最后加入体积分数30%乙醇至刻度,摇匀,静置15min?以0号为空白对照,于波长510nm处测吸光度^[5]?以芦丁标准品质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,得到回归方程y=9.6267x+0.0071,相关系数R²=0.9996?芦丁对照品在质量浓度0.0075~0.0600mg/mL呈良好的线性关系?

1.3.2罗布麻?荷叶的预处理及提取工艺

按文献^[6]操作,分别取罗布麻?荷叶以60℃干燥至恒重,粉碎后过89μm钢筛,密封保存?分别称取一定量的罗布麻?荷叶粉末?荷叶粉末在60℃?150W条件下按料液比1∶20(g/mL)加入体积分数50%乙醇作溶剂,抽提2次,每次超声20min;罗布麻粉末在40℃?150W条件下按料液比1∶15(g/mL)加入体积分数60%乙醇作溶剂,抽提2次,每次超声20min;收集提取物后分别以4200r/min离心5min,取上清液,对荷叶?罗布麻中总黄酮含量进行测定

1.3.3提取液中总黄?酮含量测定

提取液于波长510nm处测吸光度,经标准曲线方程计算得到提取液中总黄酮质量浓度?按式(1)计算总黄酮含量?

 

式中:ρ为提取液中总黄酮质量浓度,mg/mL;V为洗脱液的体积,mL;m为洗脱液干燥后的质量,g?

1.3.4大孔树脂的预处理与筛选

按文献^[7]操作,将大孔树脂进行预处理使上清液pH呈中性?通过大孔树脂的静态吸附-解吸试验选取最优树脂?吸附率和解吸率按式(2)~(3)计算?

 

式中:ρ₁为初始质量浓度,mg/mL;ρ₂为吸附后质量浓度,mg/mL;ρ₃为解吸液中黄酮质量浓度,mg/mL?

1.3.5上样量的确定

按文献^[8]操作,称取已处理完毕的AB-8大孔树脂,湿法上柱维持柱体积10mL,以流出液总黄酮质量浓度为考察指标,加入一定体积的上样液,荷叶粗提液以上样流速为3.0BV/h,罗布麻粗提液以上样流速1.5BV/h进行动态吸附,每2.5mL接1管,测定总黄酮的质量浓度,当AB-8大孔树脂达到吸附饱和时,停止上样并记录上样量,绘制泄露曲线?

1.3.6单因素试验

1.3.6.1上样流速的确定

分别以1.5?3.0?4.5?6.0BV/h的上样流速,收集流出液,测定上样流速对总黄酮流出液质量浓度的影响?

1.3.6.2上样质量浓度的确定

将荷叶?罗布麻总黄酮提取液分别以0.803?1.606?2.409?3.212mg/mL与0.798?1.596?2.394?3.191mg/mL进行上样,收集流出液,测定上样质量浓度对总黄酮吸附率的影响?

1.3.6.3洗脱液体积分数的确定

分别用体积分数60%?70%?80%?90%乙醇进行洗脱,收集流出液,测定不同体积分数的乙醇对总黄酮流出液质量浓度的影响?

1.3.7正交试验

在单因素试验的基础上,以上样流速(A)?上样质量浓度(B)?乙醇体积分数(C)为变量?总黄酮含量为指标,设计正交试验,因素水平见表1?

表1 L₉(3³)正交试验因素水平表

  

注:每个因素的水平左边数值表示为荷叶总黄酮上样条件,右边数值表示为罗布麻总黄酮上样条件?

2结果与分析

2.1树脂筛选结果

由表2可知:对于荷叶总黄酮,D315吸附率最强,为55.49%,AB-8次之,为49.82%,而AB-8解吸率最强,为43.01%,远高于其他树脂;对于罗布麻总黄酮,AB-8吸附率最强,为65.68%,D101解吸率最强,为58.82%,而AB-8解吸率是中等水平,为40.13%?综合吸附率和解吸率,荷叶和罗布麻均选择极性树脂AB-8型进行后续动态吸附试验?

表2 5种大孔树脂对总黄酮的吸附率及解吸率

  

2.2上样量的确定

由图1可知:当荷叶提取液上样量达到1.4BV时出现泄露点,因此在最佳吸附条件下,荷叶选取上样量为1.4BV?罗布麻的泄露点在1.5~1.75BV且上样量为1.75BV时泄露明显,因此,罗布麻选取上样量为1.5BV?

  

图1 荷叶和罗布麻总黄酮的泄漏曲线

2.3单因素试验

2.3.1上样流速的确定

由图2可知:荷叶?罗布麻样品液的上样流速均在6.0BV/h时,泄漏点出现最早?荷叶?罗布麻样品液上样流速分别在3.0BV/h时,泄漏点出现较晚?因此,选择荷叶?罗布麻上样流速均为3.0BV/h?

  

图2 不同上样流速对总黄酮流出液质量浓度的影响

2.3.2上样质量浓度的测定

由图3可知:超过一定质量浓度范围后,随着上样液质量浓度的增大,AB-8大孔树脂对2种样液总黄酮动态吸附率均逐渐下降?其原因可能是随着上样质量浓度的增大杂质增多,造成对AB-8大孔树脂表面的堵塞,从而影响吸附效果?因此,选择荷叶上样质量浓度为1.606mg/mL,罗布麻上样质量浓度为1.596mg/mL?

  

图3 不同的上样质量浓度

对AB-8大孔树脂吸附率的影响

2.3.3洗脱液体积分数的确定

由图4可知:荷叶总黄酮用体积分数60%?70%乙醇洗脱出的峰形比较宽,且均有一定的拖尾现象,用体积分数80%?90%乙醇洗脱效果较好,峰形较窄,洗脱效果相差不大?罗布麻总黄酮用体积分数70%?80%乙醇洗脱时效果较好,峰形较窄,洗脱效果相差不大?综合成本考虑,荷叶?罗布麻总黄酮分别选用体积分数80%?70%乙醇进行洗脱?

  

图4 不同体积分数乙醇对总黄酮流出液质量浓度的影响

2.4正交结果分析

由表3可知:荷叶总黄酮的最佳纯化条件为A₂B₂C₂?罗布麻总黄酮的最佳纯化条件为A₁B₃C₃?在最佳提取纯化工艺条件下,分别进行3次验证实验,测得荷叶总黄酮含量平均为65.75%,罗布麻总黄酮含量平均为46.75%?

表3 L₉(3³)正交试验设计及结果表

  

注:k₁?k₂?k₃?R为荷叶,k₁′?k₂′?k₃′?R′为罗布麻?

3结论

以静态吸附率和解吸率为指标,筛选出适合荷叶?罗布麻总黄酮纯化的最佳大孔树脂,用其进行动态吸附考察?采用单因素试验和正交试验,得到纯化荷叶?罗布麻总黄酮的最佳条件?结果表明:荷叶?罗布麻总黄酮纯化的最佳树脂均为AB-8型大孔树脂,荷叶总黄酮最佳纯化工艺为上样流速3.0BV/h?上样质量浓度1.606mg/mL?乙醇体积分数80%?上样量1.4BV,在此条件下荷叶总黄酮含量为65.75%;罗布麻总黄酮最佳纯化工艺为上样流速1.5BV/h?上样质量浓度2.394mg/mL?乙醇体积分数80%?上样量1.5BV,在此条件下罗布麻总黄酮含量为46.75%?本研究可为荷叶?罗布麻的深入开发?产业附加值的提高提供参考依据?

 

参考文献

[1]郄冰冰,王璐,郭瑞锋,等.大孔吸附树脂分离纯化荷叶提取物[J].中国药业,2007,16(20):44-45.

[2]李浩然,高丽.荷叶黄酮提取工艺的研究[J].农业机械,2012(15):99-102.

[3]耿岩玲,李福伟,王晓,等.罗布麻中黄酮的超声波强化提取及高速逆流色谱分离纯化[J].食品科学,2007,28(12):47-49.

[4]刘东彦,石晓峰,胡鹏斌,等.大孔吸附树脂富集纯化雪松松针总黄酮工艺的优化[J].中成药,2017,39(2):308-311.

[5]韦琴,梅辉,乐薇,等.金鸡毛草叶和茎总黄酮的超声波提取工艺优化[J].粮食与油脂,2016,29(7):81-85.

[6]徐曌.荷叶中黄酮类化合物的提取?分离纯化工艺及其抗氧化性研究[D].武汉:武汉理工大学,2008.

[7]张强祖.中药材黄酮的大孔树脂吸附工艺研究及生产线设计[D].上海:华东理工大学,2013.

[8]MUNHOZ V M, LONGHINI R, SOUZA J R P, et al. Extraction of flavonoids from Tagetes patula: Process optimization and screening for biological activity [ J] . Revista Brasileira de Farmacognosia,2014,24(5):576-583.

 

文章摘自:韦琴,刘清怡,范康俊,梅辉.荷叶和罗布麻总黄酮的富集纯化工艺研究[J].粮食与油脂,2023,36(03):81-84+88.