摘 要：以甘肃省甘南藏族自治州的蕨麻作为本实验的研究材料，用超声波清洗机辅助提取蕨麻的总黄酮，探究了超声时间、功率级别、溶剂乙醇浓度、超声温度以及料液比5个单因素对总黄酮提取率的影响，并采用响应面法对蕨麻总黄酮提取的工艺条件进行优化.试验结果表明，甘南蕨麻总黄酮最佳提取工艺条件为：料液比1∶30，提取时间30min，50%乙醇浓度，32℃提取温度，2级功率，在此条件下，蕨麻总黄酮的提取量最高，为4.217mg/g.
关键词：蕨麻；总黄酮；提取率；单因素；响应面
0 引言
蕨麻(Potentilla anserina L.)，学名鹅绒委陵菜，蔷薇科，主要分布于我国西藏、青海、甘肃和四川等地.蕨麻富含人类必需的18种氨基酸以及多糖、维生素等[1-2].此外，蕨麻具有健脾胃、益气补血和止咳止血的作用，故用于治疗腹泻、呕血、肝炎和脾胃虚弱等疾病[3].如今，随着“绿色食品”成为主流发展趋势，蕨麻作为一种药食两用的植物，市场需求量大幅度增加，经济价值持续上涨，然而由于缺乏对蕨麻有效成分的研究和开发，导致蕨麻大部分仍以原材料的形式发挥作用.近年来随着蕨麻产业的发展，人们越来越重视蕨麻有效成分的研究，除发现多糖、三萜等有效成分外[4]，研究表明蕨麻还含有生物类黄酮[5]，黄酮具有抗肿瘤和抗炎镇痛活性，还具有降血压、胆固醇以及抗老化等作用[6].
本试验以黄酮提取率作为指标，利用单因素法和响应面法对甘肃地区蕨麻黄酮提取工艺进行优化，以获得最佳的提取条件，使黄酮提取率达到最佳，在减少损耗的基础上提高蕨麻的经济价值，为蕨麻产业的发展提供理论支撑.
1 材料与方法
1.1 材料
蕨麻，甘肃甘南藏族自治州的野生蕨麻，购于绵阳市高新区永兴镇康贝大药房.
1.2 试验方法
1.2.1 标准曲线的制作[7]
20mg芦丁标准品(Sigma-84082)于50%乙醇溶解并定容到100mL，摇匀，准确吸取定容后的溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，并分别置于25mL的比色管中，各加入1mL的5%亚硝酸钠溶液，摇匀，静置5min；各加入1mL的10%硝酸铝溶液，摇匀，静置5min；加入10mL的4%氢氧化钠溶液，最后加入50%的乙醇至刻度，摇匀，静置15min；分别在紫外分光光度计510nm处测吸光度，绘制出标准曲线.提取率按照下面公式计算，总黄酮的提取率(%)=
式中，C：测定样品溶液的浓度(mg·mL-1)；V：样品溶液定容后的体积(mL)；W：样品重量(g)；F：测定时溶液的稀释倍数.
1.2.2 超声时间对提取率的影响
称取5份0.1000g蕨麻粉于5只25mL的比色管中，分别加入3mL60%乙醇，加塞后放入超声波清洗机中，分别超声10、20、30、40、50min，温度设置为50℃，提取功率级别为3级，超声完成后，考察不同超声时间对提取率的影响.
1.2.3 超声功率级别对提取率的影响
称取5份0.1000g样品于5只10mL比色管中，分别加入3mL60%的乙醇，加塞后放入超声波清洗机中20min，提取温度50℃，超声功率级别为1、2、3、4、5级，考察不同超声功率对提取率的影响.
1.2.4 超声温度对提取率的影响
称取5份0.1000g样品于5只10mL比色管中，分别加入3mL60%的乙醇，加塞后放入超声波清洗机中20min，提取温度30、40、50、60、70℃，超声功率级别为4级，考察不同温度对提取率的影响.
1.2.5 料液比对提取率的影响
称取5份0.1000g样品于5只10mL比色管中，在5只试管中分别加入1、2、3、4、5mL60%的乙醇，加塞后放入超声波清洗机中20min，超声温度50℃，功率级别为4级，考察不同料液比对提取率的影响.
1.2.6 乙醇浓度对提取率的影响
称取5份0.1000g样品于5只10mL比色管中，分别加入3mL30%、40%、50%、60%、70%的乙醇，加塞后放入超声波清洗机中20min，提取温度50℃，功率级别设置为4级，超声完成后，考察不同乙醇浓度对提取率的影响.
1.2.7 响应面试验设计
根据单因素试验结果，采用三因素三水平BOX-Behnken design(BBD)实验方法，设计优化蕨麻总黄酮提取率的自变量(乙醇浓度、超声温度和功率级数)，自变量的水平以及BOX-Behnken实验设计如表1所示.
表1 响应面优化设计条件水平
1.2.8 数据处理
采用Microsoft Excel2016和Design-Expert10.0.4软件数据处理并分析.
2 结果与分析
2.1 芦丁的标准曲线
芦丁在0.008～0.048mg/mL的浓度范围内的线性方程为：y=20.025x+0.0205(R2=0.9994)，所得到的标准曲线如图1所示，其中横坐标为芦丁含量，纵坐标为芦丁在510nm处的吸光度.表明在此范围内，芦丁浓度与其吸光度之间呈良好的线性关系.
图1 芦丁标准曲线
2.2 单因素试验结果
2.2.1 超声时间对提取率的影响
根据1.2.2的方法，分析超声时间对总黄酮提取率的影响，反应条件为：在50℃下，提取剂为50%浓度乙醇，料液比为1：30，功率级别为4级.结果如图2所示，总黄酮提取率随着提取时间的增加呈现出先缓慢增加，达到最高值后呈下降趋势，当提取时间为30min时，总黄酮提取率达到峰值，为2.81%.
图2 提取时间对黄酮提取率的影响
2.2.2 超声功率级别对提取率的影响
根据1.2.3的方法，分析功率级别对总黄酮提取率的影响，反应条件为：料液比为1∶30，提取温度50℃，乙醇浓度50%，提取20min.结果如图3所示，在1～5的功率级别范围内，总黄酮提取率先增加后降低，当功率级别为2级(100～150W)范围内时，总黄酮提取率最高，为3.70%.
图3 功率级别对总黄酮提取率的影响
2.2.3 超声温度对提取率的影响
根据1.2.4的方法，分析提取温度对总黄酮提取率的影响，反应条件为：料液比为1∶30，功率级别为4级，提取时间20min，乙醇浓度50%.结果如图4所示，随着提取温度增加，总黄酮提取率先缓慢增加达到峰值后迅速降低，当提取温度在40℃时，总黄酮提取率最高，为4.18%.通过比较贾晓东等[8]的研究方法和结果，分析出现以上情况可能是由于温度升高分子运动加速，黄酮提取率增大，但温度继续升高部分黄酮成分受到高温破坏，使得提取率降低.
图4 提取温度对总黄酮提取率的影响
2.2.4 料液比对提取率的影响
根据1.2.5的方法，分析料液比对总黄酮提取率的影响，反应条件为：超声时间为20min，超声的温度为50℃，功率级别为4级，用50%的乙醇为提取剂.结果如图5所示，总黄酮提取率随着料液比的增加呈现出先增加后降低的趋势，当料液比为1∶30时，总黄酮提取率最高，为2.89%.李桂娟等[9]采用超声辅助提取黄酮的操作结果与本试验结果趋势一致，分析原因可能是随着料液比的增加，杂质也会随着增加，导致溶解在体系中的黄酮比例下降.
图5 料液比对提取率的影响
2.2.5 乙醇浓度对提取率的影响
根据1.2.6的方法，分析乙醇浓度对总黄酮提取率的影响，反应条件为：料液比为1∶30，提取温度50℃，功率级别4级，提取时间20min.结果如图6所示，随着乙醇浓度的增加，总黄酮提取率先增加后降低最后趋于平稳，当乙醇浓度为50％时，总黄酮提取率最高，为3.04%.康坤等[10]对总黄酮提取工艺优化时，研究乙醇浓度对提取率的影响方法与试验结果一致，分析原因可能是较高浓度的乙醇导致非黄酮类的一些脂溶性物质溶出，造成体系中黄酮含量下降.
图6 乙醇浓度对蕨麻总黄酮提取率的影响
2.3 响应面试验结果
2.3.1 响应面模型的建立与显著性检验
根据单因素试验结果，利用响应面对甘南蕨麻超声提取条件进一步优化，分别选取乙醇浓度、提取温度和功率级别，以总黄酮提取率为响应值，设计3因素3水平的响应面试验，试验设计及结果如表2所示.
表2 响应面试验设计及结果
表3 蕨麻黄酮响应面试验回归模型方差分析
利用软件对试验数据进行分析得到以黄酮提取率为响应值的回归方程为：Y=4.15+0.15A+0.084B+0.14C-0.25AB-0.16AC+0.32BC-0.38A2-0.44B2-0.38C2(R2=0.9807，P<0.0001).由表3可知，回归方程的P<0.0001，说明该回归方程模拟效果极显著，失拟项P=0.0816>0.05，说明失拟项检验不显著，回归方程模型拟合度高，试验误差对试验结果干扰性较低.R2=0.9807，说明响应面的理论值和实际值呈现较为显著的相关性.此外，模型A、B、C对黄酮提取率的影响显著(P<0.05).通过F值大小可以看出，蕨麻提取的3个因素对黄酮提取率的影响大小为：A乙醇浓度>C功率级别>B提取温度，且AB、BC、AC交互作用P<0.05，说明乙醇浓度、提取温度和功率级别对总黄酮的提取率的交互影响较显著.
2.3.2 响应面曲面图及分析
利用Design-Expert软件绘制乙醇浓度、功率级别以及提取温度3个因素之间的交互作用对黄酮提取率的响应面，结果如图7所示.
根据响应面坡度的陡峭程度以及等高线密集程度和形成椭圆形的程度表示两因素之间交互作用影响大小的原则，由图7可知，功率级别与提取温度之间所形成的交互作用最强，而乙醇浓度和功率级别之间所形成的交互作用最弱，结合方差分析可知各因素交互作用大小为BC>AB>AC.
图7 两因素交互作用对黄酮提取率的影响
2.3.3 优化及验证
通过软件测定，模拟出最优的提取条件为乙醇浓度50.911%，提取温度为31.550℃，功率级别为2.233时，蕨麻总黄酮的提取能达到4.180%，但考虑具体情况，将优化条件改为：乙醇浓度50%，提取温度32℃，功率级别为2.在此条件下，做5次重复实验进行验证，结果如表4，最后得到平均值为4.217±0.342，与理论值4.180符合，因此该模型有效可靠.
表4 验证实验结果
3 结论
本研究以甘南蕨麻为材料，通过超声辅助提取黄酮，结合单因素法与响应面法对提取条件进行优化，从而得到黄酮提取的最佳条件.研究表明：黄酮提取优化条件为提取时间30min，料液比为1∶30，超声时的温度32℃，功率级别2，提取剂为50%乙醇，在此条件下，总黄酮提取率达到4.217%；提取条件对黄酮提取率影响的大小顺序为：功率级数>乙醇浓度>提取温度；以黄酮提取率为目标函数的模型为：Y=4.15+0.15A+0.084B+0.14C-0.25AB-0.16AC+0.32BC-0.38A2-0.44B2-0.38C2(R2=0.9807，P<0.0001).
蕨麻作为一种传统的药食两用植物，有较高的营养价值和经济价值，其应用广泛、前景广阔，近年来研究发现，蕨麻中富含的蕨麻素具有抑制乙肝病毒复制、保肝降酶等作用[11].但目前针对蕨麻的研究大部分仍停留于初步研究或宏观水平的分析上[12]，其有效成分、活性成分以及药用机理等亟待进一步研究.要完善蕨麻在理论方面的研究缺陷，为蕨麻发展提供可靠准确的理论支撑，就要从不同角度对蕨麻进行全面系统的科学研究，这样才能更好的发扬我国的中医药文化，才能更加科学合理的利用蕨麻，有效的推动蕨麻产业的发展.
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