摘 要：黄麻黄脉病毒（Corchorus yellow vein virus，CoYVV）属于菜豆金色花叶病毒属病毒，含有DNA-A和DNA-B两个组分。本研究利用同源重组法和酶切连接法分别对该病毒DNA-A和DNA-B进行了侵染性克隆的构建，利用农杆菌介导的植物接种法将其接种于黄麻植株，可产生花叶、黄脉等典型症状，并且通过PCR和Southern blot均检测到了病毒DNA组分。以上结果表明CoYVV侵染性克隆构建成功，也验证了黄麻黄脉病的病原是CoYVV。CoYVV侵染性克隆的构建可为病毒致病机制的解析奠定基础。
关键词：黄麻黄脉病毒；侵染性克隆；菜豆金色花叶病毒；黄麻
菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）病毒是双生病毒中分布最广泛、种类分化最多和危害程度最大的一类病毒，给烟草、番茄、棉花等经济作物带来重大经济损失[1，2，3，4，5，6]。根据病毒的基因组类型，双生病毒可以分为单组分（仅DNA-A）和双组分（含DNA-A和DNA-B）；根据病毒的进化关系，双生病毒分为新世界病毒（New World virus）与旧世界病毒（Old World virus），新世界病毒主要为双组分病毒，旧世界病毒主要为单组分病毒，常伴有卫星分子，但也有少数是双组分病毒[7，8]。其中，DNA-A的正义链上编码2个开放阅读框（open reading frame，ORF）（AV1和AV2），互补链上编码4个ORF（AC1～AC4），DNA-B病毒链和互补链各编码1个ORF（BV1和BC1）。在DNA-A和DNA-B非编码区存在一个共同区（common region，CR）或基因间隔区（intergenic region，IR），该区域包含一个序列、位置和结构上高度保守的核苷酸序列（TAATATT/AC），含有病毒复制起始位点[7，8]。双生病毒侵染性克隆的构建必须包括2个完整的IR区[9]。
黄麻（Corchorus capsularis），又称为绿麻、火麻等，是椴树科（Tiliaceae）黄麻属（Corchorus）重要的纤维作物，种植量和用途的广泛度仅次于棉花，在长江以南被广泛栽培，为精准扶贫做出了重要的贡献[10，11]。黄麻黄脉病毒（Corchorus yellow vein virus，CoYVV）最早于2006年在越南的黄麻上被发现[12]；本课题组于2015年在我国福建省福州地区的黄麻上鉴定到该病毒[13]。CoYVV属于菜豆金色花叶病毒属，可侵染黄麻并造成花叶、黄脉、植株矮化等症状，影响黄麻产量与品质，对我国黄麻产业具有潜在威胁。其基因组为双组分，作为旧世界病毒，CoYVV还具有典型的新世界双生病毒特征，即不编码AV2蛋白。本研究拟构建CoYVV的侵染性克隆，验证福州黄麻花叶病的病原，以期为CoYVV基因组功能及其致病机制的研究奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
感病黄麻的总DNA由本实验室提取和保存，其中含有CoYVV DNA-A（NCBI登录号：KX101212）和CoYVV DNA-B（NCBI登录号：KX101213）。
pTOPO-BamHⅠ克隆载体、pBINPLUS双元表达载体、GV3101农杆菌菌株由本实验室保存；大肠杆菌T1感受态购自北京全式金生物技术有限公司。
胶回收试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；质粒快速小提试剂盒、MarkerⅢ（MD103）购自天根生化科技（北京）有限公司；StarMarker D15k购自北京康润诚业生物科技有限公司；Trans2k Plus DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司。
1.2DNA-A侵染性克隆的构建
DNA-A侵染性克隆的构建采用同源重组法。以感病黄麻总DNA为模板，利用引物CoYVV-DNA-A-F1（5′-caggtcgactctagaggatccACCGTGCAGCAGCCCCGC-3′）/CoYVV-DNA-A-R1（5′-GGCTGCTGCACGGTAATATTATAGGCGTGCAGCAGCG-3′）、CoYVV-DNA-A-F2（5′-AATATTACCGTGCAGCAGCCCCGC-3′）/CoYVV-DNA-A-R2（5′-aattcgagctcggtacccgggTGACCTTCCCTGTATGAGCA-3′）（小写字母代表与载体反向互补的同源臂序列）分别对DNA-A进行扩增，获得长度为2.7kb左右的片段A和0.5kb左右的片段B。扩增体系：总DNA1μL，正向引物（10μmol·L-1）1μL，反向引物（10μmol·L-1）1μL，dNTP Mix0.5μL，2×Phanta Max Buffer12.5μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme）1μL，ddH2O 8μL。反应程序：95℃预变性3min，95℃变性15s，52℃退火15s，72℃延伸100s，35个循环，72℃终延伸10min。产物经1%（质量分数）琼脂糖凝胶回收。利用FastDigest BamHⅠ和FastDigest SmaⅠ（以下所用内切酶均为FastDigest）对pBINPLUS载体进行双酶切，酶切体系：质粒DNA1μg，BamHⅠ1μL，SmaⅠ1μL，10×FastDigest Green Buffer2μL，ddH2O补至20μL，37℃反应30min。载体酶切产物标记为pBINPLUS-SB，经1%琼脂糖凝胶回收。
按照多片段无缝克隆试剂盒（MultiS One Step Cloning Kit）的说明书（Vazyme），将片段A和片段B以及酶切产物pBINPLUS-SB，按一定比例的摩尔数进行混合。反应体系：5×CE MultiS Buffer 4μL，Exnase® MultiS 2μL，片段A 54ng，片段B 10ng，酶切产物pBINPLUS-SB 240ng，ddH2O补至20μL，37℃反应30min。转化大肠杆菌后，提取质粒，BamHⅠ和SmaⅠ双酶切验证阳性克隆，标记为pBINPLUS-CoYVV-1.2A（图1A）。利用电击法将其转入农杆菌GV3101菌株。
1。3DNA-B侵染性克隆的构建
DNA-B侵染性克隆的构建采用传统的酶切连接法。以感病黄麻总DNA为模板，根据φ29DNA聚合酶试剂盒（GE Healthcare）的说明书进行滚环扩增，扩增产物利用BamHⅠ酶切得到2.7kb左右的片段，将其连接于pTOPO-BamHⅠ载体，即为pTOPO-DNA-B。利用BamHⅠ和SmaⅠ对pTOPO-DNA-B进行双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳后回收较小的2.6kb左右的片段C。将片段C连接至pBINPLUS-SB，连接体系：片段C 6μL，pBINPLUS-SB 2μL，T4 Ligase（Promega）1μL，10×T4 Ligase Buffer1μL，4℃反应过夜。转化大肠杆菌后，提取质粒，利用BamHⅠ和SmaⅠ双酶切验证阳性克隆，标记为pBINPLUS-DNA-B-SB。利用BamHⅠ对pBINPLUS-DNA-B-SB进行单酶切，1%琼脂糖凝胶电泳回收后，进行去磷酸化处理，去磷酸化体系：单酶切载体片段17.5μL，10×CIAP缓冲液2μL，CIAP （TaKaRa）0.5μL，37℃反应30min，过柱纯化即可。
利用BamHⅠ对pTOPO-DNA-B进行单酶切，1%琼脂糖凝胶电泳后回收较小的2.7kb左右的片段D。将片段D与上一步去磷酸化的载体连接，转化大肠杆菌后，提取质粒，利用引物B-F570（5′-GACGAACCGTCACGTGCATCCACG-3′）/B-R570（5′-TGTCGACAGCAAAGCACTCTGTTG-3′）检测插入片段及其方向，阳性克隆标记为pBINPLUS-CoYVV-2.0B（图1B）。利用电击法将其转入农杆菌GV3101菌株。
图1CoYVV侵染性克隆构建示意图
A.CoYVV DNA-A侵染性克隆构建；B.CoYVV DNA-B侵染性克隆构建。AC1～AC4、AV1、BC1、BV1:CoYVV开放阅读框；IR:基因间隔区；LB、RB:载体左、右臂。
1.4农杆菌接种及检测
农杆菌接种方法参考文献[9]。使用医用去除针头的1mL一次性注射器，吸取等比例混合的DNA-A和DNA-B侵染性克隆的农杆菌菌液，接种于刚长出2～3片真叶的黄麻叶片，接种的黄麻置于防虫温室（16h光照/8h黑暗）中培养，同时设置未接种的空白对照，每隔3d观察一次植株症状。接种30d后，采集黄麻叶片，采用CTAB法提取其总DNA，利用引物A-F534（5′-AGGATCTATCGGACCTATAGGTCC-3′）/A-R534（5′-AGGATTAGAGGCATGAGTACATGC-3′）和B-F673（5′-ACGAATATCGTCTGACTCATGACC-3′）B-R673（5′-TCCAGCATACTTGTGCTGAGTCTG-3′）分别对病毒两个组分进行PCR检测，扩增产物送交生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序分析；接种60d后，采集黄麻叶片约0.5g，提取其总DNA进行Southern blot检测（Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ）。
2结果与分析
2.1侵染性克隆的构建
图2CoYVV侵染性克隆载体鉴定
M.分子质量标准；A.CoYVV DNA-A侵染性克隆载体酶切分析；B.CoYVV DNA-B侵染性克隆载体PCR分析。
将同源重组获得的重组载体pBINPLUS-CoYVV-1.2A进行双酶切验证，得到12kb左右的载体片段和3.3kb左右的片段（图2A），表明DNA-A侵染性克隆载体构建成功。将传统酶切连接获得的重组载体pBINPLUS-CoYVV-2.0B进行特异性引物检测，得到0.5kb左右的片段（图2B），表明DNA-B侵染性克隆载体构建成功。
2.2农杆菌接种结果
接种CoYVV侵染性克隆30d后，黄麻产生黄脉、花叶、斑驳、卷叶等症状（图3）。PCR检测结果显示，接种黄麻植株均可见DNA-A和DNA-B的特异性条带，而健康植株无任何条带（图4）；测序表明，该条带确实是病毒基因组序列，说明所构建的侵染性克隆已成功侵染黄麻。Southern blot检测结果显示，接种黄麻植株可见病毒DNA-A组分的积累，而健康黄麻植株无任何特异性条带（图5），表明病毒已在黄麻体内大量复制。
图3黄麻接种CoYVV侵染性克隆30d后的症状
CK.健康黄麻；DNA-A+DNA-B。接种病毒侵染性克隆的黄麻。
图4黄麻接种CoY VV侵染性克隆30d后的PCR检测
M．分子质量标准；1～3。DNA-A；4～6。DNA-B；CK．健康黄麻．
图5黄麻接种CoY VV侵染性克隆60d后的Southern blot检测
1．接种病毒的黄麻；CK．健康黄麻。
3讨论
病毒侵染性克隆不仅是病毒病病原鉴定的基础，也是病毒基因功能及其与寄主植物互作研究的重要前提[14，15]。目前，双生病毒侵染性克隆的构建策略已经成熟[16，17，18，19]。Ha et al[12]早在2006年即鉴定了CoYVV，虽然利用本氏烟（Nicotiana benthamiana）NT1细胞证明了CoYVV DNA-A AC1/AC2/AC3可以起始DNA-B的复制，但未能构建其侵染性克隆。本研究构建了CoYVV的侵染性克隆，将其接种于健康黄麻植株，能引起与田间发病类似的症状，并且从接种的植株上检测到了CoYVV基因组组分，完成了科赫氏法则的验证。本研究对接种黄麻植株进行Southern blot检测时，DNA-A组分显示病毒已积累，但是对DNA-B组分的多次检测均未能得到较好的结果，推测可能的原因是杂交探针设计不够特异，然而，PCR的结果可以证实DNA-B组分的存在。已知双生病毒DNA-A与病毒的复制和介体传播有关，很多双组分双生病毒DNA-A单独存在可以系统侵染寄主，但不能诱导典型的病害症状；而DNA-B组分对于诱导典型的病害症状是必需的，并能增加DNA-A组分的积累量，且必须依赖DNA-A组分进行复制[9，16，20]。本研究中，DNA-A具有较高的积累量，且黄麻症状明显，表明CoYVV侵染性克隆构建成功。
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文章摘自：林文忠，李景远，彭诗山，韩星，翟盈盈，杜振国，张洁，吴祖建.黄麻黄脉病毒侵染性克隆的构建及应用[J].福建农林大学学报（自然科学版），2022，51（03）:317-321.
