摘 要：为开发具有较好抗氧化活性的植物源蛋白肽，采用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶复合酶法水解汉麻籽粕获得汉麻籽蛋白水解物，经膜分离技术得到4种不同分子质量的多肽组分。通过DPPH自由基清除率、总还原力的测定，评价不同多肽组分的抗氧化活性，并对抗氧化活性最强的多肽组分进行氨基酸序列分析。结果显示：低分子质量的汉麻籽多肽组分具有更好的抗氧化活性，其中HP-Ⅳ组分(分子质量<1kDa)的抗氧化活性最强；HP-Ⅳ组分中丰度较高的6个肽段的分子质量分别为364.84、539.77、630.30、662.33、718.90、827.41Da,氨基酸序列分别为NRDDMRER、ANQLDQFSR、NPEDEFEQLRREGGRG、NHNNQLDLTPR、TVNSYNLPILRF、VSLLDTSNVNNQLDDNPRRFY。汉麻籽蛋白水解物，尤其是分子质量小于1kDa的多肽组分可作为功能性成分用于抗氧化相关功能食品和保健品的开发。
关键词：汉麻籽多肽；抗氧化活性；氨基酸序列
活性氧(ROS)参与人体生理代谢过程并起着至关重要的作用，在正常情况下，多余的ROS能够通过生物体内的抗氧化酶和非酶因子被有效消除[1]。ROS过多可导致许多疾病，如糖尿病、冠心病、癌症、肝病和炎症性疾病[2]。此外，ROS介导的脂质、蛋白质氧化会导致食物变酸，产生异味，并在食物中产生潜在的毒性[3]。因此，开发有效的抗氧化剂，对于食品加工和保鲜工业非常重要。目前，一些合成抗氧化剂具有很强的抗氧化性，并且已经广泛用于医药和食品工业。但是合成抗氧化剂具有副作用，如肝损害和致癌，影响其应用[4]。因此，开发天然抗氧化剂替代合成抗氧化剂具有重要的意义。饮食中的抗氧化成分包括维生素、类胡萝卜素、类黄酮、酚和多肽等[5],其中功能活性肽具有生物活性高、毒性低的特点，可开发为天然抗氧化剂[6]。
食物源抗氧化肽在其氨基酸序列中无活性亲本蛋白，具有2～20个氨基酸残基，易于吸收并且没有有害的免疫反应，可以发挥其作为自由基清除剂、过氧化物活性分解剂、金属灭活剂和氧气抑制剂的作用，保护食品和生物免受ROS的侵害[7]。研究表明，植物蛋白来源的多肽如大豆蛋白肽[8]、鹰嘴豆多肽[9]、米糠多肽[10]、玉米多肽[11]、核桃仁多肽[12]具有很强的抗氧化作用，可以用于功能性食品。
汉麻(Cannabis sativa L.)也称工业大麻、火麻、汉麻、线麻、黄麻等，是一种一年生草本植物，隶属于大麻科，在中国和加拿大地区广泛种植[13]。汉麻为无毒品种，四氢大麻酚含量低于0.3%。汉麻籽具有很好的药用价值和食用价值，其药用功效在2000年版的《药典》和2001年“药食同源”名单中均有记载[14]。汉麻籽脂肪含量为35%～50%,蛋白质含量为20%～40%。汉麻籽蛋白营养价值高，致敏性低，易消化，氨基酸种类齐全，组成均衡，必需氨基酸含量可以与酪蛋白和大豆蛋白相媲美，且精氨酸和谷氨酸含量丰富，是一种极具开发价值的优质蛋白[15]。目前关于汉麻籽多肽的制备工艺与降血糖、降血脂、抗氧化作用研究已有大量的报道[13,16,17,18],而关于汉麻籽抗氧化肽组成分析和结构鉴定的研究较少，因此本研究以汉麻籽粕为原料制备汉麻籽抗氧化肽，并对其进行组成分析和结构鉴定，以期为汉麻籽多肽在功能食品中的应用奠定理论基础。
1材料与方法
1.1实验材料
汉麻籽粕，实验室采用超临界技术由汉麻籽提取油脂后制得；木瓜蛋白酶(酶活力为8×105U/g)、中性蛋白酶(酶活力为1.3×105U/g),无锡雪梅酶制剂有限公司；其他试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
MALDI-TOF基质辅助激光解析飞行时间质谱仪，ABSCIEX公司；Pellicon切向流超滤系统，Millipore公司；FD-2A-80型真空冷冻干燥机，上海继谱电子科技有限公司；UV-5100B紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；Q Exactive组合型四极杆Orbitrap质谱仪、Easy-nLC1000纳升级液相色谱，赛默飞世尔公司。
1.2实验方法
1.2.1汉麻籽多肽的制备与分离纯化
以汉麻籽粕为原料制备汉麻籽多肽。按质量比1∶5将汉麻籽粕加入蒸馏水溶解，然后调整溶液pH为5.0,温度为70℃,加入汉麻籽粕质量3.0%的中性蛋白酶、0.4%的木瓜蛋白酶，酶解3h。95℃水浴灭酶活10min,以10000r/min离心15min, 取上清液，备用。采用不同截留分子质量超滤膜(1、3、5kDa)对上清液进行分离，超滤条件为温度25℃、压力0.15MPa、转速125r/min。收集各个组分的多肽液冷冻干燥，计算各组分所占比例。
1.2.2抗氧化活性测定
1.2.2.1DPPH自由基清除率的测定
根据You等[19]的方法测定DPPH自由基清除率，略作修改。冷冻干燥的汉麻籽多肽样品用蒸馏水溶解得到质量浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0mg/mL的溶液。取100μL汉麻籽多肽溶液，与100μL0.1mmol/L的DPPH溶液充分混匀后，在37℃水浴中反应1.5h,测定在517nm处的吸光度。空白组为100μL乙醇溶液和100μL一定质量浓度的汉麻籽多肽溶液，对照组为100μL乙醇溶液和100μLDPPH溶液。DPPH自由基清除率(E)按式(1)计算。
式中：A1为汉麻籽多肽溶液吸光度；A2为空白组吸光度；A3为对照组吸光度。
1.2.2.2总还原力的测定
参照Oyaizu[20]的方法测定总还原力，略作修改。反应管中依次加入0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0mg/mL的汉麻籽多肽溶液1.0mL,2.5mL0.2mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.6)和2.5mL10mg/mL铁氰化钾溶液，充分混合后，于50℃的水浴中充分反应20min,以3000r/min离心10min,取2.5mL上清液与0.1mL1mg/mLFeCl3混合，测定在700nm处的吸光度，以吸光度的大小表示总还原力的强弱。
1.2.3汉麻籽抗氧化肽分子质量分布的测定
采用MALDI-TOF基质辅助激光解析飞行时间质谱仪对汉麻籽抗氧化肽的分子质量分布进行测定[21]。取质量浓度为1mg/mL的汉麻籽多肽溶液1μL,点至样品靶位上，自然干燥后，再取1μL CHCA基质溶液点至对应靶位上并自然干燥，用相同方法在样品靶位相邻靶位上点校准标准品(4700Proteomics Analyzer Calibration Mixture 1)。采用校准标准品Calibration Mixture 1进行外标一级校准，质量误差小于0.5Da。图谱采集条件：一级质谱(MS)范围(m/z)100～5000,每张谱图累加500个Laser Shots。
1.2.4汉麻籽抗氧化肽的氨基酸序列分析
参照文献[21]方法，采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对汉麻籽抗氧化肽的氨基酸序列进行分析，采用ESI质谱鉴定及质谱数据分析。
2结果与分析
2.1汉麻籽多肽各组分所占比例
对汉麻籽粕酶解液进行分离纯化后得到4个多肽组分，各组分分子质量及所占比例见表1。
表1 汉麻籽多肽各组分分子质量及所占比例
由表1可知，得到的4个多肽组分中，HP-Ⅲ组分(分子质量为1～3kDa)所占比例最高，为54.32%,其次为HP-Ⅳ组分(分子质量<1kDa),所占比例为40.18%。
2.2汉麻籽多肽的抗氧化活性
2.2.1DPPH自由基清除能力
汉麻籽多肽对DPPH自由基的清除能力如图1所示
图1 汉麻籽多肽的DPPH自由基清除能力
DPPH自由基在乙醇溶液中稳定，且在517nm处有最大的吸光度。当DPPH自由基遇到提供质子的物质，如抗氧化剂时，自由基被清除，吸光度降低。这个方法可评价抗氧化剂对DPPH自由基的清除能力。由图1可见，汉麻籽多肽对DPPH自由基具有清除能力，且呈现出剂量相关性。汉麻籽多肽的分子质量越大，相同质量浓度的汉麻籽多肽对DPPH自由基清除能力越小。一般来说，生物活性肽的分子质量、疏水性、氨基酸组成和序列被认为在抗氧化作用中起关键作用，抗氧化肽的生物活性高度依赖于其分子大小，因为小分子的抗氧化剂更有可能与自由基相互作用，以防止过氧化反应[22]。
2.2.2总还原力
汉麻籽多肽的总还原力如图2所示。
图2 汉麻籽多肽的总还原力
总还原力是评价活性肽抗氧化活性的重要指标。从图2可见，在0.1～10.0mg/mL范围内，汉麻籽多肽的总还原力均随着汉麻籽多肽质量浓度的增加而增强，并呈现出显著的量效关系，相同质量浓度条件下，分子质量越大，总还原力越低，HP-Ⅳ组分的分子质量(分子质量<1kDa)最小，其总还原力最强。
2.3汉麻籽抗氧化肽的分子质量分布
经测定，HP-Ⅳ组分丰度较高的6个峰对应的肽段分子质量分别为 364.84、539.77、630.30、662.33、718.90、827.41Da。
2.4汉麻籽抗氧化肽的氨基酸序列分析
为了确定可能引起抗氧化活性的肽段结构，根据HP-Ⅳ组分的分子质量分布，对HP-Ⅳ组分丰度较高的6个峰对应的肽段进行氨基酸序列分析，多肽序列分析结果如表2所示，质谱图如图3～图8所示。
表2 汉麻籽抗氧化肽肽段的氨基酸序列
注：G.甘氨酸；A.丙氨酸；V.缬氨酸；L.亮氨酸；I.异亮氨酸；P.脯氨酸；F.苯丙氨酸；Y.酪氨酸；S.丝氨酸；T.苏氨酸；M.甲硫氨酸；N.天冬酰胺；Q.谷氨酰胺；D.天冬氨酸；E.谷氨酸；R.精氨酸；H.组氨酸。
图3 NRDDMRER质谱图
图4 ANQLDQFSR质谱图
图5 NPEDEFEQLRREGGRG 质谱图
图6 NHNNQLDLTPR质谱图
图7 TVNSYNLPILRF质谱图
图8 VSLLDTSNVNNQLDDNPRRFY质谱图
据报道，天冬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸、色氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸等对肽的抗氧化性有贡献[23]。由表2和图3～图8可知，鉴定的6个肽段中，均含具有抗氧化活性的氨基酸。已有研究证明多肽序列中异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸等疏水性氨基酸使其具有较好的抗氧化活性[24]。因此，研究认为NRDDMRER、ANQLDQFSR、NPEDEFEQLRR-EGGRG、NHNNQLDLTPR、TVNSYNLPILRF、VSLLD-TSNVNNQLDDNPRRFY多肽序列组成是使分子质量小于1kDa的汉麻籽多肽组分具有较好抗氧化活性的主要因素。
3结论
本文采用复合蛋白酶法制备了具有较高抗氧化活性的汉麻籽多肽。利用切向流超滤系统分离纯化，通过比较不同组分汉麻籽多肽的抗氧化活性，确定分子质量小于1kDa的汉麻籽多肽具有最强的抗氧化活性。分子质量小于1kDa的汉麻籽多肽组分中丰度较高的6个峰对应的肽段分子质量分别为364.84、539.77、630.30、662.33、718.90、827.41Da,采用液相色谱-串联质谱对其进行氨基酸序列分析，得到的氨基酸序列分别为NRDDMRER、ANQLDQFSR、NPEDEFEQLRREGGRG、NHNNQL-DLTPR、TVNSYNLPILRF、VSLLDTSNVNNQLDDN-PRRFY。研究认为分子质量小于1kDa的汉麻籽蛋白水解物是抗氧化功能食品开发的优良原料。
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文章摘自：魏连会,董艳,石杰,宋淑敏,孙兴荣.汉麻籽抗氧化肽的制备与氨基酸序列分析[J].中国油脂,2022,47(04):36-40.DOI:10.19902/j.cnki.zgyz.1003-7969.210278.
