摘 要：采用碱提酸沉和经典Osborne分级分离的方法，分别制备得到了汉麻分离蛋白以及清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，并研究了这5种分离蛋白的氨基酸组成、等电点、吸水吸油性、起泡性、乳化性、成膜性及凝胶性。结果表明:4种蛋白分离产物中汉麻球蛋白的占比最高为46.80%，其次为清蛋白18.47%和谷蛋白18.00%，醇溶蛋白最少；汉麻球蛋白的多数氨基酸含量高于其他组分，并表现出了优异的氨基酸组成特性；5种分离蛋白的等电点依次为pH4.5、pH4.0、pH5.0、pH5.5和pH5.5；汉麻分离蛋白起泡性最好，汉麻清蛋白的乳化性最好，汉麻分离蛋白和谷蛋白吸水性较强，清蛋白和球蛋白的吸油能力较强，5种分离蛋白在质量浓度50mg/L下均可以揭膜，在200mg/mL时汉麻分离蛋白、清蛋白和谷蛋白能够形成凝胶。
关键词：汉麻籽蛋白；Osborne分级；功能特性
汉麻在我国有着悠久的种植历史，近年来汉麻种子逐渐从一味中药发展为一种营养丰富的日常食材[1,2]。汉麻籽具有优秀的不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸配比，同时还含有丰富的优质蛋白质[3]。它不含致敏因子，不会造成胃胀、反胃和过敏反应[4,5]，因而使用特性极高[6,7]。目前汉麻籽蛋白的研究仅停留在整籽蛋白的利用上[8,9]，对于汉麻籽蛋白的构成、分级提取及不同蛋白质成分的理化特性等的研究还未曾展开[10,11]。本研究采用Osborne方法分级提取汉麻籽分离蛋白[12,13,14,15]，并在获得4类分离蛋白后进行了理化特性的研究，为汉麻籽蛋白的合理利用提供数据支撑。
1材料与方法
1.1试验材料
脱脂汉麻粕，购自锦州俏牌生物技术有限公司；考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白、磷酸、盐酸、氢氧化钠、Tris-HCl、氯化钠、甘油，国产分析纯。
1.2仪器与设备
VFD-6000真空冷冻干燥机(液晶屏编程冻干曲线)，北京博医康实验仪器有限公司；L-8900氨基酸分析仪(配有EZChrom Elite分析软件)，天美(中国)科学仪器有限公司；GY-GSDCY-24孔干式氮吹仪，上海归永电子有限公司；梅特勒FE28-Standard pH计，瑞士梅特勒公司；UV759S紫外-可见光分光光度计，上海精科有限公司。
1.3试验方法
1.3.1汉麻分离蛋白的提取
脱脂汉麻籽粕进行粉碎、过筛后获得汉麻脱脂粉，以料液比1∶20(g/m L)在汉麻脱脂粉中加入蒸馏水进行混合，调节pH至10.5，于40℃恒温提取2h，再以4000r/min离心20min，取上清液调节pH至4.5，静止2h，弃去上清液，调节pH至6.0～7.0，真空冷冻干燥后获得汉麻籽分离蛋白粉[16,17]。
1.3.2汉麻籽各级蛋白Osborne分离方法
1.3.3氨基酸测定方法
分别称取0.05g的5种蛋白质于15mL离心管中，加入3mL水溶解，再加入3mL浓盐酸；氮吹仪操作30min后于110℃水解24h，再以5000r/min离心20min，定容至50mL；取4mL于100℃水浴蒸干后加入10mL的0.02mol/L盐酸溶解，使用0.22μm滤膜过滤至进样瓶，上机以氨基酸分析仪自动分析。
1.3.4等电点测定
移液管准确移取12份10.00 m L的5种蛋白质溶液于50mL离心管中，依次调节pH为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，以6000r/min离心15min，取一定量的上层清液于10.00mL考马斯亮蓝溶液中，静置5～10min后，在波长595 nm处测定不同pH下蛋白质溶液的吸光度。由于不同的蛋白质溶液中蛋白质含量不同，因此，需要将各种蛋白质溶液分别稀释至合适的质量浓度。根据蛋白质在等电点处溶解度最小的原理，吸光度最小的pH即为等电点。
1.3.5起泡性的测定
5种蛋白粉各取0.5g，溶于50mL水中，搅打2次，记录搅拌停止后的总体积，按照公式(1)计算起泡性。
1.3.6乳化性的测定
用0.05mol/L,pH8.0的Tris-HCL溶液配制蛋白质量浓度为10mg/L的5种蛋白溶液。使用HCl溶液调蛋白质溶液pH至7.0，按4∶1的体积比加入大豆油，于10000r/min下均质1min，静置1min后取乳化层10mL至有刻度离心管，于4℃下以3000r/min离心30min，乳化性的计算公式如公式(2)所示。
1.3.7吸水、吸油特性研究
称取5种分离蛋白各0.5g，加入6mL水充分混合，静置20min后，以3000r/min离心20 min，弃去上清液，称重试管。以每1g蛋白质结合的水量表示蛋白质吸水能力，按照公式(3)计算吸水性。
称取5种分离蛋白各0.5g，加入6 m L大豆油充分混合，静置20min后，以3000r/min离心20min，弃去上清液后称重试管。以每1g蛋白质结合的油量表示蛋白质吸油能力，按照公式(4)计算吸油性。
1.3.8成膜性的测定
将5种蛋白质以蒸馏水配制成质量浓度为50mg/L的蛋白质溶液100mL，分别加入1.5g甘油，搅拌20min，于65℃水浴加热20min，室温放置7h后过滤，玻璃板涂膜，在60℃下干燥17h取出。在湿度90%、温度30℃的条件下湿润回软15min，揭膜后室温干燥48h，使用紫外-可见光分光光度计测定透光率。
1.3.9凝胶性的测定
将5种蛋白质以蒸馏水配制成质量浓度为200mg/mL的蛋白质溶液，用封口膜封口，于85℃下恒温水浴40min后取出迅速冷却，放入冰箱冷藏过夜，随后倒置试管观察成胶情况[18,19]。
2结果与分析
2.1汉麻籽蛋白各级组分分布结果
采用经典Osborne分级分离的方法，分别制备得到了清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白。由表1可知:汉麻球蛋白的占比最高，占总质量的46.80%，其次为清蛋白18.47%和谷蛋白18.00%，醇溶蛋白最少，只占总质量的3.66%。在分离汉麻蛋白过程中还剩余了约13.07%的残渣，这主要是一些碳水纤维及剩余油脂的混合物以及一些不可溶性的蛋白质组分[20]，可以在今后的研究中加以利用。
表1汉麻籽蛋白各级组分的组成比例
2.2汉麻分离蛋白及4种分级蛋白的氨基酸组成分析
采用氨基酸分析仪进行了汉麻分离蛋白及4种分级蛋白的氨基酸组成检测，数据见表2。
表2汉麻分离蛋白及4种分级蛋白氨基酸分析结果
由表2可知:汉麻球蛋白显示出了优异的氨基酸组成特性，其中缬氨酸、蛋氨酸及组氨酸3种必需氨基酸含量均高于大豆分离蛋白、汉麻分离蛋白及其他各级蛋白组分，苏氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸及亮氨酸含量则与大豆分离蛋白相近，但远高于其他蛋白组分。汉麻球蛋白各种非必需氨基酸的含量都高于大豆分离蛋白，特别是精氨酸和半胱氨酸，含量几乎是大豆分离蛋白的2倍。
表3列出了5种蛋白的氨基酸种类分布，其中汉麻球蛋白的碱性氨基酸、酸性氨基酸含量都高于其他蛋白。汉麻谷蛋白的疏水氨基酸和亲水氨基酸、含硫氨基酸以及芳香族氨基酸含量均高于其他蛋白；汉麻球蛋白的碱性氨基酸和酸性氨基酸含量均高于其他蛋白；汉麻醇溶蛋白中的各类氨基酸含量都是最低的。
表3汉麻分离蛋白及4种分级蛋白氨基酸种类分布
2.3等电点的确定
由图1可知:汉麻分离蛋白、清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的吸光度最小值分别出现在pH4.5、4.0、5.0、5.5和5.5处，因此推断他们的等电点依次为pH4.5、pH4.0、pH5.0、pH5.5和pH5.5。在pH从3.0到其等电点处，由于酸性越强，蛋白质溶解度越高，因此5条曲线中吸光度均在一定范围内呈先下降再升高的趋势，也说明各种蛋白质在碱性条件下溶解度逐渐增大。
图1 5种蛋白质等电点曲
2.4起泡特性和乳化特性的比较
由图2可知:汉麻分离蛋白起泡性最好，其次是清蛋白、谷蛋白，球蛋白与醇溶蛋白的起泡性较差，考虑两者可能是平均疏水作用而导致的起泡性差。汉麻分离蛋白及各分级蛋白的乳化性大小依次是清蛋白、汉麻分离蛋白、谷蛋白、球蛋白、醇溶蛋白。
图2 5种蛋白质的起泡特性和乳化特
2.5吸水、吸油能力的测定
由图3可知:汉麻分离蛋白和谷蛋白比清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的吸水性强。吸油率则相反，清蛋白和球蛋白的吸油能力高于汉麻分离蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白
图3 5种蛋白质吸水、吸油能力
2.6成膜特性的研究
试验发现汉麻分离蛋白和4种分级蛋白在质量浓度50mg/L下均可以揭膜，但膜薄而脆易碎，醇溶蛋白与谷蛋白膜的颜色较黄，主要原因是这2种蛋白本身的颜色较深。球蛋白膜的透光率最高，厚度也较薄。
表4 5种蛋白成膜特性
2.7凝胶特性的研究
由表5可知:在200mg/mL时，汉麻分离蛋白、清蛋白和谷蛋白开始形成凝胶，此时为弱凝胶，球蛋白和醇溶蛋白的凝胶质量浓度可能大于200mg/mL。
表5 5种蛋白凝胶特性
3结果与讨论
采用碱提酸沉和经典Osborne分级分离的方法，分别制备得到了汉麻分离蛋白和4种汉麻分级蛋白，其中，汉麻球蛋白的占比最高，占总质量的46.80%，其次为清蛋白18.47%和谷蛋白18.00%，醇溶蛋白最少。氨基酸组成的分析结果显示，汉麻球蛋白中缬氨酸、蛋氨酸及组氨酸含量均高于大豆分离蛋白、汉麻分离蛋白及其他蛋白组分，表现出了优异的氨基酸组成特性。
汉麻分离蛋白、清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的等电点依次为pH4.5、pH4.0、pH5.0、pH5.5和pH5.5。汉麻分离蛋白起泡性最好，汉麻清蛋白的乳化性最好。汉麻分离蛋白和谷蛋白比清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的吸水性强，吸油率则相反，清蛋白和球蛋白的吸油能力高于汉麻分离蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白。汉麻分离蛋白和4种分级蛋白在质量浓度50mg/L下均可以揭膜。在200mg/mL时，汉麻分离蛋白、清蛋白和谷蛋白能够形成凝胶。总体来说，汉麻粕分离蛋白拥有优良的营养价值，特别是汉麻球蛋白具有优异的氨基酸组成特性，是值得开发利用的新型植物蛋白质资源，具有广阔的应用前景。
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文章摘自：石杰,宋淑敏,魏连会,杨庆丽.汉麻籽蛋白的分级提取及产物功能特性的研究[J].粮食与油脂,2021,34(11):132-136.
