摘  要：本发明属于分子育种技术领域，涉及一种控制红麻叶形基因HcLMI1及其应用。其步骤为：通过基因定位，分离克隆得到一个控制红麻叶形基因HcLMI1及等位基因HcLMI1-ZY1。通过图位克隆，将这个控制叶形性状的基因定位在第13号染色体上，其含有一个影响叶形发育的基因HcLMI1，定为候选基因。利用红麻自然群体，进行比较测序发现，含有HcLMI1的红麻品种为裂叶型。利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)载体转化红麻品种，结果表明，转化植株的裂叶表现出部分圆叶特征。本发明为红麻分子育种提供基因资源。

技术要点

1.叶形相关基因HcLMI1在控制红麻叶形中的应用，其特征在于：所述红麻叶形相关基因HcLMI1编码的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的控制红麻叶形相关基因HcLMI1的全长基因序列如SEQIDNO.2所示，其等位基因HcLMI1-ZY1的全长基因序列如SEQIDNO.3所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的控制红麻叶形相关基因HcLMI1的CDS序列如SEQIDNO.4所示。

4.一种含有HcMLI1基因的表达载体在控制红麻叶形中的应用。

5.一种含有权利要求4所述的表达载体的宿主菌在控制红麻叶形中的应用。

6.一种含有权利要求4所述的表达载体的宿主菌在红麻分子育种中的应用。

技术领域

本发明属于分子育种技术领域，涉及一种控制红麻叶形基因HcLMI1及其应用。

背景技术

叶片是植物进行光合作用、蒸腾作用以及维系自身热平衡的主要器官，其形状和大小影响了植物的冠层结构、产量和抗逆性重要农艺性状，环境因素和基因共同调控叶形，了解叶片形态变异的遗传基础对提高农业生产力至关重要。

红麻(Hibiscusspp.)是继棉花和黄麻之后的世界上第三大天然纤维作物，广泛在亚热带和热带地区种植，主要分布在中国、印度、泰国、孟加拉国、越南、印度尼西亚、巴西、古巴、伊朗与埃及等。由于红麻韧皮部纤维具有抑菌、透气、吸湿性好和可降解等特点，被视为21世纪潜在的优势作物。

叶片形状在红麻纤维改良中发挥着重要作用，在红麻发育过程中，叶片形状从三裂叶向五裂叶和七裂叶转变中，伴随着韧皮束和纤维层的数量的变化。目前虽然对叶片形态的发育遗传学已经有了一定的基础，但在红麻领域还是鲜见相关报道。李爱青对不同类型的随体本身的遗传研究发现叶形属于单基因遗传；陈美霞等利用阿联红麻和福红992杂交后构建的162份F2：3家系为材料对叶形在遗传连锁图谱中进行初步定位，但对控制红麻叶形的基因目前尚未见报道。

因此，发掘并克隆红麻叶形基因，对于开发具有我国知识产权的红麻叶形基因显得十分迫切和必要。

发明内容

本发明的目的在于提供了控制红麻叶形基因HcLMI1及其序列，为红麻遗传改良奠定基础。

本发明实现的技术方案：本发明提供一种叶形相关基因HcLMI1在红麻育种中的应用。

本发明的具体步骤是：

（1）红麻重组自交系群体构建：利用圆叶型栽培品种“赞引1号”分别与裂叶栽培品种“福红952”和“中红麻16”杂交，得到两个F2群体，分别是ZFF2(赞引1号×福红952，390株)和ZZF2(赞引1号×中红麻16，60株)。

（2）卡方检验表明，两个F2群体叶片形状表型基因型的比值符合单基因孟德尔分离比(裂叶:圆叶=3:1)，表明是由一个主要基因控制该性状。

（3）利用ZZF2群体中15个裂叶型个体和15个圆叶型个体构建DNA池，进行集团分离分析，将裂叶特异性标记定位到13号染色体上tig00018960。

（4）使用ZFF2群体中390个体，在10.4Mb的间隔内绘制目标基因图谱，预测42个基因。

（5）利用ZFF2群体延伸出的131个近等基因系中的低覆盖基因组序列精细定位，将控制叶片形状的精确到13号染色体54.21Mb-54.36Mb之间，共6个候选基因。

（6）在这6个候选基因中Hca.13G0013000(HcLMI1)与拟南芥中LMI1基因同源，蛋白质相似性为51.8%。

将克隆得到的叶形相关基因HcLMI1应用于控制红麻叶形中，所述红麻叶形相关基因HcLMI1编码的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。所述的控制红麻叶形相关基因HcLMI1的全长基因序列如SEQIDNO.2所示，其等位基因HcLMI1-ZY1的全长基因序列如SEQIDNO.3所示。所述的控制红麻叶形相关基因HcLMI1的CDS序列如SEQIDNO.4所示。

将含有HcMLI1基因的表达载体应用于控制红麻叶形中。

将含有上述表达载体的宿主菌应用于控制红麻叶形中。

将含有上述表达载体的宿主菌应用于红麻分子育种中。

本发明的有益效果在于：本发明通过基因定位，分离克隆得到一个控制红麻叶形基因HcLMI1及等位基因HcLMI1-ZY1。通过图位克隆，将这个控制叶形性状的基因定位在第13号染色体上，其含有一个影响叶形发育的基因HcLMI1，定为候选基因。利用红麻自然群体，进行比较测序发现，含有HcLMI1的红麻品种为裂叶型。利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)载体转化红麻品种，结果表明，转化植株的裂叶表现出部分圆叶特征。本发明为红麻分子育种提供基因资源。

附图说明

图1为HcMLI1全长基因组结构示意图。

图2为沉默红麻HcCLA1和HcLMI1的表型以及HcLMI1的表达量测定。

图3为赞引1号和福红952中HcLMI1的氨基酸序列比较；红色为同源结构域Homebox，蓝色为HALZ结构域。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

本发明使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能通过市场购买直接获取，所用引物序列均由上海生工技术有限公司合成。

实施例1

叶形相关基因HcLMI1的筛选

(1) 红麻重组自交系群体构建：利用圆叶型栽培品种“赞引1号”分别与裂叶栽培品种“福红952”和“中红麻16”杂交，得到两个F2群体，分别是ZFF2(赞引1号×福红952，390株)和ZZF2(赞引1号×中红麻16，60株)。

(2) 卡方检验表明，两个F2群体叶片形状表型基因型的比值符合单基因孟德尔分离比(裂叶:圆叶=3:1)，表明是由一个主要基因控制该性状。

(3) 利用ZZF2群体中15个裂叶型个体和15个圆叶型个体构建DNA池，进行集团分离分析，将裂叶特异性标记定位到13号染色体上tig00018960。

(4) 使用ZFF2群体中390个体，在10.4Mb的间隔内绘制目标基因图谱，预测42个基因。

(5) 利用ZFF2群体延伸出的131个近等基因系中的低覆盖基因组序列精细定位，将控制叶片形状的精确到13号染色体54.21Mb-54.36Mb之间，共6个候选基因。

(6) 在这6个候选基因中Hca.13G0013000(HcLMI1)与拟南芥中LMI1基因同源，蛋白质相似性为51.8%，图1为HcMLI1全长基因组结构示意图。

实施例2红麻基因的的克隆以及序列分析

1) RNA提取

取福红952B的幼嫩叶片，在陶瓷研钵中用液氮冷冻并研磨成粉状，然后用OMEGA试剂盒操作步骤提取RNA，-80℃冻存备用。

2) HcLMI1基因的克隆

取出-80℃冻存的RNA，按照TaKaRa反转录试剂盒操作步骤合成cDNA第一链，于-20℃保存，设计如下两条引物HcLMI1-F(SEQIDNO.5)和HcLMI1-R(SEQIDNO.6)。PCR反应体系为：cDNA模板2μL、上下游引物(10μM)各1.5μL、dNTP(2mM)5μL、10×KODPCRbuffer5μL、MgSO4(25mM)2μL、KODPlus1μL，补ddH2O至50μL。扩增条件为：94℃变性3min、55℃30s、68℃2min32个循环、72℃延伸10min。得到HcLMI1全长的DNA序列，送公司进行测序分析。

实施例2HcLMI1在红麻中的表达分析

1)  载体构建及VIGS侵染

采用Gateway（LifeivitrogenGatewayBPClonaseII酶/BP酶和InvitrogenLR酶,GatewayLRClonaseIIEnzymemix）技术构建载体。其操作步骤如下：利用设计的特异引物HcLMI1-F(SEQIDNO.5)和HcLMI1-R(SEQIDNO.6)从红麻叶片中克隆HcLMI1的特异片段并回收，回收片段经BP反应转入pDONR207载体，然后转入大肠杆菌获得阳性克隆。

测序后，筛选所需阳性菌，提取重组质粒。目的片段经LR反应从重组载体转移到TRV2表达载体。通过农杆菌转化筛选和PCR验证，获得含目标基因片段的农杆菌菌株。

参考Velásquez等(Virus-induced genesilencing(VIGS)inNicotianabenthamianaandtomato.JVisExp,2009,28:PII:1292.)的制备方法。以pTRV1和含有目的基因片段的pTRV2分别转化农杆菌GV3101。挑取新鲜培养的含pTRV1和目的基因片段的pTRV的农杆菌GV3101单菌落,分别接种到1mLLB液体培养基(Kan,50μgmL-1；Gen,50μgmL-1；Rif,50μgmL-1)中,28℃180转min-1培养24h；然后转入150mLLB液体培养基(Kan,50μgmL–1；Gen,50μgmL–1；Rif,50μgmL–1)中,28℃180转min-1培养12h；28℃5000rpm离心10min收集菌体细胞,以适当体积的重悬液(10mmolL-1MgCl2,10mmolL-1MES以及200μmolL-1乙酰丁香酮)重悬至终浓度为1.5(OD600)；将重悬液于室温下静置3h，含有pTRV1和目的基因片段的pTRV2的重悬液按体积比1∶1混匀，用于侵染红麻种子。pTRV:LMI1作为实验组，还设置了一个阴性对照。由于来自TRV的沉默会随着时间波动，且对湿度和温度较敏感，因此做pTRV:CLA1处理，CLA1可作为一个影响叶绿体发育的可见标记，确保VIGS实验成功。将实验材料置于温度22℃，光/暗周期14h/10h的条件下生长。

2)  侵染后红麻HcLMI1基因表达量测定待被pTRV:CLA1侵染的种子长出的苗，叶片表型为白色时，取被pTRV:LMI1侵染的叶片，用RNA试剂盒提取叶片总RNA，以Actin为内参基因，通过RT-PCR检测被沉默后目标基因的表达量。所用引物为：HcLMI1-RT-F(SEQIDNO.7)；HcLMI1-RT-R(SEQIDNO.8)；Actin-RT-F(SEQIDNO.9)；Actin-RT-R(SEQIDNO.10)。附图2为沉默红麻HcCLA1和HcLMI1的表型以及HcLMI1的表达量测定。附图3为赞引1号和福红952中HcLMI1的氨基酸序列比较。

图1

图2

图3

摘自国家发明专利，发明人：张立武，徐益，张力岚，祁建民，张列梅，徐建堂，申请号：201911295031.3，申请日期：2019.1.16