摘  要：本发明属于植物基因工程技术领域，公开了一种红麻HcCLA1基因VIGS沉默体系。通过构建含有HcCLA1基因特异性片段的pTRV2病毒沉默表达载体质粒，农杆菌介导法转化红麻，诱导红麻内源HcCLA1发生沉默，有效降低了红麻HcCLA1基因的表达水平，导致白化表型。本发明方法建立了TRV-VIGS沉默红麻内源基因从而鉴定基因功能的体系，具有快速，高通量，易于操作的优势，为开展红麻基因功能研究提供了新途径。

技术要点

1.一种红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1，其特征在于：所述1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的全长基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种用于沉默红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的HcCLA1基因特异性片段，其特征在于：所述HcCLA1基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一种红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的VIGS病毒载体，其特征在于：利用gateway重组克隆技术将HcCLA1基因特异性片段连接至VIGS病毒骨架载体pTRV2中，构建获得重组病毒载体pTRV2--HcCLA1。

4.一种红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的VIGS沉默体系，其特征在于，所述VIGS沉默体系的构建方法包括以下步骤：

（1）利用冻融法将重组病毒载体pTRV2-HcCLA1转化至农杆菌GV3101；

（2）将转化后的阳性农杆菌菌液与pTRV1菌液按菌液体积比1：1混合制成混合菌液；

（3）将种子浸泡于步骤（2）的混合菌液中，24℃浸种24h；

（4）将浸泡后的种子点在清水浇透的土壤中，于24℃/20℃，14h/10h，光/暗周期生长，观察红麻真叶的表型，并检测叶片中HcCLA1的表达情况，即构建得到红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的沉默体系。

5.如权利要求2所述的HcCLA1基因特异性片段在沉默红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1中的应用。

6.如权利要求3所述的一种红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的VIGS病毒载体在沉默红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1中的应用。

7.如权利要求4所述的一种红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的VIGS沉默体系在沉默红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1中的应用。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种红麻HcCLA1基因VIGS沉默体系。

背景技术

病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)属于转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。其中由烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus，TRV)诱导的基因沉默(TRV-VIGS)，以其持续时间长、沉默效率高，寄主植物病毒症状轻，不会掩盖沉默表型，且在各种组织均可产生基因沉默等优点，成为目前应用广泛的一类基因沉默体系。TRV-VIGS已在番茄、烟草、辣椒、拟南芥等植物上成功应用。

在不同的植物中建立VIGS体系，可选用1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因(cloroplasto alterados，CLA1)基因作为报告基因。植物CLA1(cloroplastos alterados 1)基因参与叶绿体发育过程，进化中高度保守，CLA1基因突变体有明显的白化表型，是易于识别的标记性状。本发明构建了携带HcCLA1干扰片段的烟草脆裂病毒重组载体，通过农杆菌成功侵染红麻，建立红麻高效VIGS体系，为红麻功能基因组学研究提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于提供一种红麻HcCLA1基因VIGS沉默体系。该方法成功建立红麻HcCLA1基因的VIGS沉默体系，实现简单、高效、低成本鉴定红麻HcCLA1基因功能。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1，该基因的全长基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种用于沉默红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的HcCLA1基因特异性片段，所述HcCLA1基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示.一种红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的VIGS病毒载体，利用gateway重组克隆技术将HcCLA1基因特异性片段连接至VIGS病毒骨架载体pTRV2中，构建获得重组病毒载体pTRV2--HcCLA1。

一种红麻HcCLA11基因VIGS沉默体系，其构建方法包括以下步骤：

（1）通过冻融法将重组病毒载体pTRV2-HcCLA11转化到农杆菌GV3101感受态细胞，PCR鉴定阳性；

（2）将转化后的阳性农杆菌菌液与pTRV1菌液按菌液按体积比1：1混合制成混合菌液；

（3）将红麻种子在步骤（2）的混合菌液中24℃，浸泡24h；

（4）将步骤（3）浸泡后的种子点在清水浇透的土壤中，于24℃/20℃，14h/10h光/暗周期生长，观察新长出的红麻真叶的表型变化，并检测叶片中HcCLA11的表达情况，即构建得到红麻HcCLA11基因序列沉默体系。

上述HcCLA1基因特异性片段在沉默红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1中的应用。

上述一种红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的VIGS病毒载体在沉默红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1中的应用。

上述一种红麻HcCLA11基因的VIGS沉默体系沉默红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1中的应用。

上述红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1，全长基因序列的获得：在TAIR网站（https：//www.arabidopsis.org/）获得拟南芥AtCLA1（AT4G15560）基因蛋白质序列。然后，在NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/，Sequence Read Archive(SRA)登录号PRJNA596386），利用红麻优良品种福红952的参考基因组（Zhang et al.，2020，Plant Biotechnology Journal，DOI：10.1111/pbi.13341），通过BLASTP查找红麻同源基因，获得1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的全长基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述HcCLA1基因特异性片段的克隆：以1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的全长基因序列为模板，设计用于扩增HcCLA1基因CDS结构域上的250bp特异性片段的引物HcCLA1-F和HcCLA1-R；其核苷酸序列分别为：HcCLA1-F：SEQ ID NO.2：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATTATGTCTTCAATGCTCCTAGAG-3’ HcCLA1-R：SEQ ID NO.3：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCACAACATTATTCCTTTCACCTTTC-3’

取红麻福红952的幼嫩叶片，在研钵中用液氮冷冻并研磨成粉状，然后用OMEGA试剂盒操作步骤提取RNA，-80℃冻存备用。取出-80℃冻存的RNA，按照TaKaRa反转录试剂盒操作步骤合成cDNA第一链，于-20℃保存。以cDNA为模板，利用特异性引物HcCLA1-F和HcCLA1-R，PCR扩增HcCLA1基因特异性片段，其大小为250bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的有益效果：

1.本发明首次构建红麻HcCLA1基因VIGS沉默体系，获得了具有能够使红麻HcCLA1基因沉默的体系。

2．本发明通过，并采用烟草脆裂病毒构建红麻HcCLA1基因沉默体系，能够在红麻植株内进行系统扩散传播。

3．本发明所述沉默体系能够有效降低红麻HcCLA1基因的表达水平，叶绿素被漂白。

附图说明

图1本发明实施例1中构建的重组病毒载体pTRV2-HcCLA1农杆菌菌液PCR的琼脂糖凝胶电泳图。M：DNA ladder DL2000；1-8：农杆菌克隆。

图2本发明实施例1中沉默载体侵染红麻幼苗后出现的新叶白化表型形状。

图3本发明实施例2中采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测红麻HcCLA1的沉默效果。CK：空载体pTRV2侵染的红麻幼苗；HcCLA1：重组病毒载体pTRV2-HcCLA1侵染的红麻幼苗。

图4质粒pTRV2-HcCLA1结构图。本发明采用gateway cloning的方法构建载体质粒pTRV2-HcCLA1。其中，ccdB为致死基因，Cm为目标基因HcCLA1。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。

实施例1构建重组病毒载体pTRV2-HcCLA1

（1）HcCLA1全长基因序列的获得首先，在TAIR网站（https：//www.arabidopsis.org/）获得拟南芥AtCLA1(AT4G15560)基因蛋白质序列。然后，在NCBI网站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/，Sequence Read Archive(SRA)登录号PRJNA596386)，利用红麻优良品种福红952的参考基因组（Zhang et al.，2020，Plant Biotechnology Journal，DOI：10.1111/pbi.13341），通过BLASTP查找红麻同源基因，获得1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的全长基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

（2）HcCLA1基因特异性片段的克隆以1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的全长基因序列为模板，设计用于扩增HcCLA1基因CDS结构域上的250bp特异性片段的引物HcCLA1-F和HcCLA1-R；其核苷酸序列分别为：HcCLA1-F：SEQ ID NO.2：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATTATGTCTTCAATGCTCCTAGAG-3’HcCLA1-R：SEQ ID NO.3：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCACAACATTATTCCTTTCACCTTTC-3’

取红麻福红952的幼嫩叶片，在研钵中用液氮冷冻并研磨成粉状，然后用OMEGA试剂盒操作步骤提取RNA，-80℃冻存备用。取出-80℃冻存的RNA，按照TaKaRa反转录试剂盒操作步骤合成cDNA第一链，于-20℃保存。以cDNA为模板，利用特异性引物HcCLA1-F和HcCLA1-R，PCR扩增HcCLA1基因特异性片段。

PCR反应体系为：cDNA模板2μL、上下游引物(10μM)各1.5μL、dNTP(2mM)5μL、10×KOD PCR buffer 5μL、MgSO₄(25mM)2μL、KOD Plus 1μL，补ddH₂O至50μL。扩增条件为：94℃变性3min、55℃30s、68℃2min 32个循环、72℃延伸10min。得到HcCLA1共250bp的特异性序列（SEQ ID NO.4），送公司进行测序分析，确保该特异性片段位于HcCLA1的基因结构域上。该片段沉默后，HcCLA1基因的功能丧失。

（3）载体构建及VIGS侵染采用Gateway技术构建载体。其操作步骤如下：将该HcCLA1特异性片段（SEQ ID NO.4）、载体pDONR207和BP酶按体系混匀后，置于25℃的PCR仪中进行过夜连接。再将得到的连接产物热激转化到DB3.1感受态细胞中，然后涂布在含有庆大霉素（50μg/mL）的LB平板上，37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养。提取质粒pDONR207-HcCLA1后，用pDONR207的通用引物pDONR207-F（SEQ ID NO.5）和pDONR207-R PCR（SEQ ID NO.6）扩增检测。再将质粒pDONR207-HcCLA1、载体pTRV2和LR酶按体系混匀后，置于25℃的PCR仪中进行过夜连接。再将得到的连接产物热激转化到TOP10感受态细胞中，然后涂布在含有卡那霉素的（50μg/mL）LB平板上，37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养。提取质粒pTRV2-HcCLA1，用HcCLA1-F和HcCLA1-R进行PCR扩增检测，测序验证序列为HcCLA1的特异性片段SEQ ID NO.4。将质粒pTRV2-HcCLA1（结构图见图4）通过冻融法转入GV3101感受态细胞中，经过含有50μgmL^-1卡那霉素、50μgmL^-1庆大霉素和50μgmL^-1利福平的筛选，获得含目标基因片段HcCLA1特异性片段的农杆菌菌株。

参考Velásquez等的制备方法。以pTRV1质粒、pTRV2质粒和pTRV2-HcCLA1质粒分别转化农杆菌GV3101。挑取新鲜培养的含pTRV1质粒、pTRV2质粒和pTRV2-HcCLA1质粒的农杆菌GV3101转化子单菌落（图1），分别接种到1mLLB液体培养基(Kan，50μgmL^-1；Gen，50μgmL^-1；Rif，50μgmL^-1)中，28℃180转min^-1培养24h；然后转入150mLLB液体培养基(Kan，50μgmL^–1；Gen，50μgmL^–1；Rif，50μgmL^–1)中，28℃180转min^-1培养12h；28℃5000rpm离心10min收集菌体细胞，以适当体积的重悬液(10mmolL^-1MgCl₂，10mmolL^-1MES以及200μmolL^-1乙酰丁香酮)重悬至终浓度为1.5(OD600)；将重悬液于室温下静置3h，将携带有pTRV1载体的农杆菌GV3101菌液分别与携带pTRV2的农杆菌GV3101菌液和携带pTRV2-HcCLA1质粒的农杆菌GV3101菌液的重悬液按体积比1：1混匀制成2种混合菌液，用于侵染红麻种子。红麻种子在混合菌液中24℃，侵泡24h，将红麻种子实验材料置于24℃/20℃，光/暗周期14h/10h的条件下生长。

实施例2HcLMI1在红麻中的表达分析

（1）侵染后红麻HcLMI1基因表达量测定待被pTRV：CLA1侵染的种子长出的苗，叶片表型为白色时（图2），取被pTRV：CLA1侵染的叶片，用RNA试剂盒提取叶片总RNA，以Actin为内参基因，通过RT-PCR检测被沉默后目标基因的表达量。所用引物为：HcCLA1-RT-F(SEQ ID NO.7)；HcCLA1-RT-R(SEQ ID NO.8)；Actin-RT-F(SEQ ID NO.9)；Actin-RT-R(SEQ ID NO.10)。HcCLA1基因表达量测定结果见图3，图3结果表明：与对照CK相比，受到含有pTRV2-HcCLA1载体农杆菌侵染的红麻叶片中HcCLA1基因表达量显著降低。

摘自国家发明专利，发明人：张立武，张力岚，徐益，祁建民，张列梅，徐建堂，申请号202010073455.1，申请日2020.01.22