[麻进展]剑麻种质资源DNA条形码遗传多样性分析

作者：董斌等来源：发布时间：2021-11-03 Tag: 点击：

摘要：剑麻是重要的国防和工业战略物资，准确和快速鉴别剑麻种质对于剑麻品种选育具有重要意义。本研究对82份剑麻种质资源中的rbcL和matK的DNA条形码编码区进行测序，分析了rbcL和matK的NJ聚类图、条形码序列多样性以及碱基替换概率。结果显示，rbcL序列GC含量为42.97%，matK序列GC含量为30.55%；matKDNA条形码差异位点数和位点变异率明显高于rbcLDNA；NJ聚类图显示，rbcL序列可将82个剑麻种质分为6个亚群，而matK序列可将82个剑麻种质分为8个亚群，群内每种剑麻种质与其他种质之间均存在一定的遗传距离；差异位点数、位点变异率、核苷酸多样性、中性检验统计等序列多样性结果表明，matK序列的差异性明显高于rbcL序列；rbcL序列和matK序列的碱基发生了不同程度的转换和颠换，碱基转换主要发生在T与C之间，而C和G碱基之间比较保守，发生的颠换概率最低。综上所述，matK序列在剑麻种质中遗传多样性更高，更适用于剑麻种质鉴别。

关键词：剑麻；遗传多样性；DNA条形码；matK基因；rbcL基因

剑麻为龙舌兰科(Agavaceae)多年生热带优质纤维经济植物，农业种植面积大部分在广东、广西、海南三省，主要选用来自龙舌兰属、丝兰属和巨兰属的广义剑麻种质。剑麻具有较高的经济价值，是重要的战略性经济作物。剑麻纤维具有坚韧耐磨、质地刚柔、低温下不会硬化脆断、不霉变、耐腐蚀、防静电等特点，是制作电梯和航海专用缆绳的优质材料(Corbin et al.，2015；Hernández et al.，2016)，另外，剑麻纤维与树脂、橡胶等物质混合能制造出新型纤维复合材料(Sahu and Gupta，2017；赵鑫和孙占英，2021)。剑麻的茎心含有大量的淀粉和糖分，是制作生物酒精和酿造龙舌兰酒的主要原料(Palomo et al.，2018)。剑麻叶片纤维提取后剩余的液汁和麻渣也具有开发价值，叶片液汁含有的剑麻皂苷元具有杀菌抗炎、解热镇痛、增强免疫、降脂降压、减低血糖、抗击肿瘤等作用，提取物常用于开发成药物(Sidana et al.，2016)，而剑麻渣发酵后，可以作为湖羊或其他反刍动物的辅助粗饲料用于动物饲养(郑继昌等，2018)。由此可见，剑麻纤维制品在各行各业均有广泛运用，随着国内外对剑麻纤维的总需求量日益增加，剑麻呈现出供不应求的局面。

DNA条形码(DNA barcoding)技术是一种基于DNA基因序列进行物种区分的常用方法，通过对物种中具有高度保守和足够变异的DNA条形码鉴别不同的分类群。rbcL位于叶绿体基因组，属于核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶的大亚基基因，在进化上较为保守；matK基因是在叶绿体基因组中进化速率最快的基因，在植物科级、属级、种间和种内水平均有广泛的应用，常用于探讨类群的系统进化研究(毕毓芳等，2020。鉴于叶绿体基因组不同程度的保守性，rbcL和matK这两种叶绿体基因DNA核心条形码片段广泛用于研究高等级植物间的系统发育关系(Liu et al.，2019；熊瑶等，2020，rbcL位于叶绿体基因组较大的单拷贝区，具有通用性好、易扩增和易序列比对等优点(代培红等，2020，而matK基因位于叶绿体trnK基因的内含子中(熊哲铭等，2020，具有分子质量小，多拷贝和结构简单等特点(吴育鹏等，2016，在植物科级、属级水平，该序列为研究类群内部的系统重建提供了较多的信息和较高的支持率(马丽等，2020。))))))

为了有效地分析国家农业农村部剑麻种质资源圃内种质资源的系统发育、亲缘关系，本研究以不同国家来源的82份剑麻种质资源为研究对象，对叶绿体上的2个DNA条形码rbcL和matK进行测序，分析了rbcL和matK的NJ聚类图、条形码序列多样性以及碱基替换概率。以期为剑麻类种质资源的保存、评价、创新和利用提供重要的分子依据，并为剑麻产业的升级发展提供良好的种质资源基础。

1结果与分析

1.1DNA条形码扩增和测序

对82份剑麻的rbcL和matK片段PCR扩增后进行电泳检测，其中，rbcL条形码长度约为700bp，matK条形码长度约为800bp(图1)，扩增片段长度准确，条带清晰明亮，能够用于测序分析。剑麻DNA条形码测序结果显示(表1)，在叶绿体rbcL序列扩增长度为686bp，其GC含量为42.97%；matK序列长度为837bp，GC含量为30.55%。

图1部分剑麻种质的rbcL和matK琼脂糖电泳检测

表1剑麻DNA条形码测序产出数据

1.2DNA条形码序列多样性和碱基替换概率

对剑麻DNA条形码序列多样性进行了分析(表2)，结果显示rbcL和matK两个序列多样性有较大差别，mat KDNA条形码差异位点数65，位点变异率0.079，明显大于rbc LDNA条形码差异位点数和位点变异率。通过中性检验可以推断种群的历史动态，当Tajima's D值呈现较大负值时，可以认为其序列多样性更加显著。rbcL和mat KDNA条形码中性检验统计值分别为-2.041和-2.396，mat KDNA条形码D值高于rbc LDNA条形码。总的来看，matK序列的多样性明显高于rbcL序列。

DNA条形码碱基替换概率可以看出(表3)，rbcL序列和matK序列的碱基发生了不同程度的转换和颠换。转换主要发生在T与C之间，rbcL序列和matK序列的T和C碱基转换概率分别达到18.01%和17.34%；在rbcL序列和matK序列中，C和G碱基之间比较保守，在序列中发生的颠换概率最低，分别为6.10%和3.67%。DNA条形码碱基替换率的结果表明，不同的碱基类型的转换和颠换的发生概率不同。

表2剑麻DNA条形码序列多样性分析

表3剑麻DNA条形码碱基替换概率

1.3DNA条形码系统聚类分析

基于DNA条形码差异性构建剑麻NJ系统聚类图，rbcL序列的系统聚类图显示，82个剑麻种质可聚类为6类，其中78、79、40、9为同一个进化支，41为单独一个进化支，24、43、50、51为一个进化支，61、63、82是一个进化支，22为独立进化支且遗传距离较远，其余的为同一进化支聚为一类(图2A)。由于试材rbcL序列的变异位点较少，在多数剑麻种质中几乎不存在遗传距离或遗传差异极小，鉴别不同剑麻种质范围有限，因此不适用于鉴别不同的剑麻种质。根据matK的系统聚类图显示，82个剑麻种质可聚类为8个亚群，而且群内每种剑麻种质与其他种质之间均存在一定的遗传距离(图2B)，以上结果表明，mat KDNA能够更好的区分剑麻种间相近的物种，具有较高的多样性，能清晰划分剑麻种质之间的亲缘关系，适合用于剑麻遗传多样性的分析和不同剑麻种质的鉴别。

2讨论