作者：彭文仙等   来源：   发布时间：2021-10-27   Tag:   点击：
[麻进展]7个苎麻AP2_ERF基因时空表达分析与花发育相关BnERF1基因克隆
摘  要：苎麻(Boehmeria nivea（L.）Gaudich.)生殖生长对其纤维发育有显著的抑制作用，且苎麻开花受乙烯调控。AP2/ERF转录因子在植物中对乙烯信号响应和调控生长发育具有关键作用。本研究根据苎麻转录组数据筛选到7个不同的ERF基因，在分析其在不同种质不同部位的时空表达情况基础上，克隆了一个与花芽发育密切相关的ERF基因，并进行生物信息学特征分析。结果表明：7个ERF基因在不同种质和不同组织中均表达，但表达量差异显著，存在基因型和组织器官特异性。其中Unigene9156和Unigene16687在所有种质中相对表达量较高，尤其在0.5~1cm花芽(雌花芽和雄花芽)中表达量极高。Unigene9156在‘GBN08’种质0.5~1cm雄花芽中的表达量是在‘GBN08’麻骨中表达量的650多倍，而在‘GBN09’种质0.5~1.0cm雌花芽的表达量是在‘GBN08’麻骨中表达量的338倍。因此可推测Unigene9156在调节苎麻开花和花芽发育方面可能有重要作用。以苎麻转录组数据中的Unigene9156为模板，克隆unigene9156基因ORF长为1302bp，命名为BnERF1(登录号：MZ540911)。该基因编码433个氨基酸，分子质量为47.05kD，理论PI为9.04，含有AP2结构域的YRG和RAYD基序，是无信号肽蛋白，亚细胞定位在细胞核内。系统进化树显示苎麻与川桑、异色山黄麻、大麻的ERF蛋白同源关系较近。该研究为进一步揭示AP2/ERF调控苎麻开花提供了科学依据。
关键词：苎麻(Boehmeria nivea(L.)Gaudich.)；AP2；ERF；克隆
 
苎麻(Boehmeria nivea L.Gaudich.)是以收获韧皮纤维为主的多年生宿根性作物，三麻时期大量开花结实显示生殖生长对苎麻纤维生长有显著的抑制作用，导致了纤维产量和品质的下降(薛丽君，2015；马鑫，2017)。苎麻开花受乙烯调控。AP2/ERF(APETALA2与Ethylene-responsive factor)转录因子参与到乙烯信号的响应与调控，在植物生长发育等多个过程具有重要作用。开展苎麻AP2/ERF转录因子研究可为分子水平调控苎麻开花、减少或消除生殖生长，为生产中提供不开花的苎麻品种或为育种家提供不开花的材料提供科学依据。
AP2/ERF转录因子是一个含有由60~70个氨基酸组成的AP2/ERF结构域的转录因子家族，几乎在所有的植物中都大量存在。通过内部转录因子蛋白与其他相关蛋白之间的相互作用可以激活或抑制特定基因的转录。AP2/ERF转录因子一般含有DNA结合结构域、转录激活或抑制结构域、寡聚化位点以及核定位信号(吴慧敏等，2011)。根据AP2/ERF成员序列相似性和结构域的数量，将其分为5类，分别为AP2、DREB、ERF、RAV和Soloist亚家族(Faraji et al.，2020)。ERF是植物AP2/ERF家族中的一个亚族。最先发现AP2基因与植物着花与种子发育相关。ERF蛋白质的功能主要有以下几个方面：植物防卫反应信号传递，应答胁迫，调控基因表达，调节植物的生长发育等(许世达等，2021)。ERF家族基因的特征在于只含有1个AP2/ERF型DNA结合结构域，能够直接与乙烯响应元件中的GCCbox相互作用，这对于乙烯调节转录过程十分重要(Xu et al.，2020)。前人有研究报道水稻OsERF71基因参与ABA信号，并通过合成脯氨酸赋予植株抗旱性(Li et al.，2018)；FaERF003可能作为乙烯响应因子与乙烯调控草莓果实成熟密切相关(杨堉楠等，2021)；在黏果酸浆中ERF基因调节花、果实的发育(郑珍珍和黄芸，2021)。据黄瓜RU性别研究相关报道，CsERF110和CsERF31具有分别结合A基因(CsACS11)和M基因(CsACS2)的启动子，激活其转录的功能(潘健等，2020)，从而调控黄瓜花的性别(Tao et al.2018)。菊花的ERF基因转入拟南芥中发现可以调控拟南芥开花时间(Xing et al.2019)。由此可见ERF基因的功能具有极大的物种特异性，但其作用机理尚不明晰，开展不同作物中ERF基因的作用模式研究有重要的意义。
苎麻是雌雄同株异花植物，但雌雄花发育在不同时期，一般雄花先于雌花发育。前人研究发现雌性苎麻的乙烯释放速率要大于雌雄同株苎麻；对于雌雄同株材料来说雌花序的乙烯释放速率>混合花序乙烯释放速率>雄花序乙烯释放速率；AVG和AgNO3都可以使苎麻明显的雄性化，表明乙烯可以调节苎麻开花，从而可以影响性别表达等。乙烯信号转导研究发现(邢虎成等，2007)，乙烯信号通过级联反应传达给乙烯反应元素结合蛋白(EREBP)转录因子基因(又名ERF)，通过ERF的表达完成乙烯调控，调节最终应答因子的反应，从而最终调控植物发育(张慧君，2013)。因此本研究基于前期苎麻录组测序数据库，获得了7个ERF家族基因，对其进行不同苎麻种质不同器官和不同发育时期的时空表达研究，从而确定与苎麻花发育密切相关的AP2/ERF转录因子基因，然后对其进行克隆和生物信息学分析，为进一步深入研究其的生物学功能提供科学依据。
1 结果与分析
1.1 7个ERF基因在旺盛生长期的表达特性
基于湖南农业大学邢虎成课题组与华大基因合作完成的苎麻开花期转录组测序数据(采用solexa测序技术)，我们得到了7条苎麻AP2/ERF片段序列。初步分析获得序列，发现7条序列均含有AP2保守结构域，说明均属于AP2/ERF转录因子家族。以这7条苎麻AP2/ERF片段序列为模板设计了实时定量PCR引物(表1)，利用苎麻肌动蛋白(Actin)基因作为内参，采用表达量变化倍数对基因Unigene9156，Unigene18197，Unigene17478，Unigene16687，Unigene6896，Unigene15426，Unigene15247在5个苎麻品种不同器官间的表达情况进行分析。在同一生长时期不同的品种中这7个基因的表达量不同(图A；图B；图C；图D；图E)。旺盛生长期Unigene16687和Unigene9156基因在不同的苎麻种质中均有表达。尤其在‘GBN08’苎麻种质中，Unigene9156基因显著高表达。其次则是Unigene16687基因，在‘圆青5号’中总相对表达超过了Unigene9156。7个苎麻AP2/ERF在骨、茎尖、皮、叶四个不同的组织中，也存在着组织表达特异性。Unigene16687和Unigene9156基因茎尖的表达较高，而Unigene18197和Unigene6896在5个不同品种的不同组织中表达量极低。Unigene17478，Unigene15426和Unigene15247在不同品种和组织部位中有表达情况，但三者的相对表达量都较低。由此可见Unigene9156和Unigene16687在苎麻中较为保守，有可能在生长发育过程中承担重要作用。
 
图17个ERF基因在5个品种中的不同组织及不同品种不同生长时期的表达特性
1.2 7个ERF基因在开花期的表达特性
7个基因在开花期的表达情况具有明显差异，由于取样时仅有‘GBN08’和‘GBN09’有花芽发育，因此试验观察了‘GBN08’和‘GBN09’开花期各不同组织7个ERF基因的表达情况。随着苎麻生长，从旺盛生长期到开花期，7个ERF基因随着苎麻的生长发育在骨、茎尖、皮和叶组织中的表达量逐渐降低(图1D，图1F；图1E，图1G)，而在花芽中的表达量极显著的增加(图1H；图1I)，尤其是Unigene9156和Unigene16687基因，在苎麻开花期表达量显著上调，但Unigene16687的相对表达量上调倍数小于Unigene9156。无论是雌花还是雄花，雌雄同株的‘GBN08’或是全雌株的‘GBN09’中，Unigene9156基因几乎都在花芽大小为0.5~1cm时高表达，Unigene9156在‘GBN08’种质0.5~1cm雄花芽中的表达量是在‘GBN08’麻骨中表达量的650多倍(图1H，图1I)；该基因在‘GBN09’种质0.5~1.0cm雌花芽的表达量是在‘GBN08’麻骨中表达量的338倍，在<0.5cm的雌花芽中表达量是在‘GBN08’麻骨中表达量的12倍。因此可推测Unigene9156在调节苎麻开花和花芽发育方面可能有重要作用，可开展进一步研究。
1.3 花发育相关BnERF1基因ORF的克隆与生物信息学分析
时空表达分析发现Unigene9156可能与苎麻花芽发育有密切关系，因此以苎麻转录数据中的Unigene9156为模板，利用primer5.0设计基因克隆引物(表1)，通过聚合酶链式反应获得克隆产物，最终得到约1300bp的条带。纯化后连接克隆载体转入大肠杆菌，蓝白斑选择验证阳性克隆，菌液测序结果分析表明苎麻Unigene9156基因ORF长为1302bp，命名为BnERF1，(登录号：MZ540911)。该基因编码433个氨基酸(图2)，该序列与转录组数据库中的序列比对相似度达到99%以上。
 
图2 苎麻BnERF1核苷酸序列及相应氨基酸序列
通过在线软件Expasy分析BnERF1基因的基本理化性质，其结果显示该蛋白分子式为C2053H3235N595O651S12，分子质量较小，仅为47.05kD，有利于后续研究；此蛋白是碱性蛋白质，理论PI(等电点)为9.04；不稳定系数为50.72，脂肪系数为64.09，平均亲水系数为：-0.706，负电荷残基总数51。氨基酸组成中，G甘氨酸(Gly)和S丝氨酸(Ser)占比最高，二者都达到11.1%。
通过NCBI比对将BnERF1的ORF的氨基酸序列进行结构域分析，可以看出，其包含AP2的保守结构域，符合AP2/ERF家族基因的特征。信号肽在线预测发现该蛋白无明显信号肽。跨膜结构预测结果表明该蛋白没有跨膜区，不属于跨膜蛋白。亚细胞定位在细胞核内，与其作为转录因子的作用位点相符。
 
图3 不同物种ERF基因同源氨基酸比对结果
 
图4不同物种中ERF氨基酸序列系统发育树
苎麻BnERF1基因与其他15种植物ERF基因的氨基酸序列进行同源性比对，苎麻BnERF1基因含有AP2结构域的YRG和RAYD基序，符合AP2/ERF家族基因的结构特征(图3)。系统进化树中苎麻与川(Morus notabilis，XP024027236.1)、异色山黄麻(Trema orientalis，PON86895.1)、大麻(Cannabis sativa，XP030495582.1)的ERF蛋白同源关系较近，与绿豆(Vigna radiata，XP014494817.1)、山核桃(Juglans regia，KAG2683513.1)、榴莲(Durio zibethinus，XP022746128.1)等进化关系较远(图4)。经以上序列分析发现，BnERF1含有乙烯响应因子的主要特征结构，提示可能在乙烯信号转导或乙烯合成途径中参与重要作用。
2 讨论
苎麻作为一种饲纤兼用作物，具有纤维支数高、高蛋白、营养丰富等特点。三麻时期开花很大程度上影响了苎麻纤维品质和营养品质。AP2/ERF基因家族是最大的植物特异性转录因子基因家族之一，在植物生长发育、响应外界胁迫以及系统进化过程中发挥着重要作用，根据其AP2保守结构域的特点，分为了5个亚家族：ERF、DREB、AP2、RAV和soloist。含有一个AP2保守结构域的是ERF亚家族与DREB亚家族，含有两个重复的AP2结构域的是AP2亚家族，而RAV亚家族成员则有含有两个不同的结构域，分别是一个AP2和一个B3结构域，不同亚家族之间同源关系密切。目前有关ERF亚家族相关研究主要集中抗旱、抗涝和抗盐，如在小麦中(李世姣等，2021)分离出了4个盐胁迫相关的ERF基因，包含脱落酸、水杨酸和茉莉酸等多种植物激素响应元件，推测它们可能参与植物多种非生物胁迫信号转导通路；瓦式猕猴桃(Bai et al.，2021)中AvERF73和AvERF78在耐涝基因型中特异性诱导，而在敏感基因型中相对较低，表明它们在耐涝中的作用。咖啡豆(Matheus et al.，2021)中表明ERF基因可能作为体细胞胚性标记，在植物形态建成与生长发育中行使功能，这与本研究ERF基因在大部分苎麻发育期茎尖表达量较高的结果相吻合。Pan等(2021)的研究表明黄瓜CsERF31基因在乙烯信号通路上被CsEIN3激活，并刺激CsACS2从而触发正反馈循环以确保雌性而非双性花发育，CsERF31的敲除导致有缺陷的双性花取代雌花。CsERF31的异位表达抑制雄花的雄蕊发育并促进雌蕊发育，表明CsERF31具有性别转换的功能因此CsERF31介导的正反馈回路在雌性黄瓜花发育过程中有重要意义。本研究中苎麻雌花和雄花的在0.5~1mm时，BnERF1的相对表达量极显著增加，或存在于黄瓜类似的调控机制，在雌蕊或雄蕊发育过程中有促进或抑制作用，具体调控方式还有待进一步的研究。Pei等(2021)人研究报道了棉属(GoNe)的一个蜜腺发育基因，被注释为APETALA2/ethylene-responsive factor。通过病毒诱导基因沉默技术和Cas9敲除的植物产生无蜜源表型。重复基因Ne1和Ne2同时点突变和基因截断导致四倍体棉花蜜腺发育障碍，这也为苎麻开花授粉的调控打开了一个新思路，或许BnERF1基因也存在相似的功能。
3 材料与方法
3.1 植物材料
所有种质种植于湖南农业大学耘园基地，在苎麻旺盛生长期取‘GBN08’(雌雄同株)、‘GBN09’(全雌株)、‘圆青5号’、‘1313’、‘梁平青麻’的骨、茎尖、皮和叶。在开花期取‘GBN08’的花芽(<0.5cm雄花，0.5~1cm雄花，1~1.5cm雄花，<0.5cm雌花)、骨、茎尖、皮和叶，‘GBN09’的花芽(<0.5cm雌花，0.5~1cm雌花，1~1.5cm雌花)、骨、茎尖、皮和叶。其中‘GBN08’和‘GBN09’材料是湖南农业大学苎麻遗传育种课题组选育的不同性别的苎麻种质。所有取样样品分离后用蒸馏水洗净，用液氮迅速冷冻后于-80℃保存。
3.2 试验化学试剂
RNA提取试剂盒，cDNA合成试剂盒，购自索莱宝生物公司。荧光定量PCR试剂盒购自全式金(AQ141)，其余试剂均为化学分析纯。
3.3 试验所用引物
以苎麻转录组序列为参考，生物信息学分析基因是否存在AP2结构域，从而判断是否为ERF家族成员，最终筛选到7个ERF家族成员，使用Primer5设计引物并由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1)。
 
3.4 基因时空表达分析
试剂盒法提取材料中样品的各组织RNA经纯度和完整性检验后取1μg进行反转录，反转录完成后的cDNA稀释4倍用于实时荧光定量PCR实验，反应体系(20μL)如下：引物F0.4μL，引物R0.4μL，cDNA模板<1μg，Passive Reference Dye(50×)0.4μL，qPCRSuperMIX10μL，无酶水加至20μL。荧光PCR反应程序：94℃变性3min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环，72℃延伸10min。以苎麻的Actin作为内参基因，数据处理使用2-℃℃ct的方法。
3.5 BnERF1基因的克隆
采用基因克隆引物进行BnERF1基因的PCR克隆(表2)，PCR反应程序：98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸2min30s，30个循环。PCR产物回收后p-EASY载体连接，构建重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过蓝白斑选择进行阳性克隆验证后1：1甘油保存、测序。
3.6 BnERF1基因的生物信息学分析
使用DNAMAN软件对测序回来的基因序列进行拼接(NCBI登录号：MZ540911)，在NCBI进行核苷酸序列比对(NCBI网站Blast网址：https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)，并将推测的氨基酸序列进行BlastP比对和结构域预测；二维结构预测和二硫键预测(http：//espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/)；三维结构预测(http：//swissmodel.expasy.org)；使用MEGA5.0软件进行氨基酸序列比对与系统发育进化分析；蛋白质基本理化性质分析(http：//web.expasy.org)；信号肽预测(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SingalP/)；跨膜结构域预测(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；亚细胞定位预测(http：//www.psort.org/。)
 
文章摘自：彭文仙,马鑫,何思,何也君,张晓洋,霍颖怡,邢虎成.7个苎麻AP2/ERF基因时空表达分析与花发育相关BnERF1基因克隆[J/OL].分子植物育种:1-11[2021-10-20]

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