摘 要：通过鉴定红麻全基因组中WRKY基因家族所有成员，并分析其在盐胁迫下的表达特征，从而为研究WRKY基因家族成员在红麻响应盐胁迫过程中的生物学功能奠定坚实基础。利用生物信息学的方法对红麻全基因组中的WRKY基因家族成员进行鉴定，并对WRKY基因家族各成员的理化性质、系统发育和保守功能域进行分析，同时利用实时荧光定量PCR技术分析盐胁迫下WRKY基因家族各成员的表达特征。结果表明，共鉴定出33个WRKY基因家族成员，且该基因家族成员不均匀地分布在12条染色体上，每个基因家族成员的理化性质如氨基酸数目、分子质量、理论等电点都存在一定的差异，且每个基因家族成员的氨基酸保守序列WRKYGQK没有发生变异。红麻和拟南芥的WRKY基因家族系统进化树分析表明，33个WRKY家族成员分成了3个类群，GroupⅠ、GroupⅡ、GroupⅢ，其中GroupⅢ包含了5个亚组。实时荧光定量PCR技术分析结果表明，盐胁迫诱导表达的WRKY家族成员有26个，其中23个具有正向调控作用，3个具有负向调控作用。共鉴定出红麻WRKY家族成员33个，其中26个WRKY家族成员参与了红麻盐胁迫响应过程。
关键词：红麻；WRKY；生物信息学；盐胁迫
WRKY转录因子家族是植物体内最大的转录因子家族之一，参与植物生物/非生物逆境胁迫响应、生长发育等过程，是植物调控网络重要的组成部分［1－2］。红麻是重要的天然纤维作物之一，主要用于纺织、纸浆、生物质能源等方面［3－4］。红麻种植以盐碱地、沿海滩涂、干旱坡地等非粮食耕地为主。因此，筛选和鉴定参与红麻响应非生物胁迫过程的WRKY基因家族成员，对阐明红麻耐逆机理、培育耐逆品种、维持红麻产业的可持续发展具有重要意义。
WRKY转录因子家族成员都具有一段保守的氨基酸序列，N-端具有标志性的高度保守序列WRKYGQK，C-端具有C2H2或C2HC这2种锌指结构。自从第一个WRKY转录因子SPF1［5］从甘薯中克隆获得后，人们陆续从拟南芥［6］、水稻［7］、小麦［8］、棉花［9］、红麻［10］等不同作物获得WRKY家族成员。
WRKY转录因子家族参与植物的生长发育、生物、非生物逆境胁迫等多种过程，有的WRKY转录因子家族成员在植物响应盐胁迫过程中具有重要作用。魏晓爱等［11］通过实时荧光定量PCR发现，72个拟南芥
WRKY基因家族成员中有30个盐胁迫响应基因，其中上调表达基因23个，下调表达基因7个。在250mmol/L的NaCl胁迫下，高粱SbWRKY71基因的表达量呈现出先上升后下降的表达趋势，且在胁迫9h表达量达到最高［12］。盐胁迫下，与野生型烟草相比，在过表达小麦TaWRKY46基因的烟草植株中可溶性糖和可溶性蛋白含量显著上升，植株的鲜质量明显增加，可见，小麦TaWRKY46基因增强了转基因烟草植株的耐盐性［13］。郭玉敏等［14］研究表明，盐胁迫下，玉米ZmWRKY101基因的表达量显著提高，通过提高转ZmWRKY101基因拟南芥植株抗氧化酶的活性，增强转基因植株的耐盐性。综上所述，WRKY转录因子家族成员在植物响应盐胁迫过程中具有正向/负向的调控作用。目前，关于红麻WRKY基因家族的系统分析及其盐胁迫下的表达分析尚未见报道。本研究拟用生物信息学筛选、鉴定出红麻WRKY基因家族成员，并通过实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR，qRT-PCR)技术分析盐胁迫下WRKY基因家族成员的表达情况，旨在为进一步研究红麻WRKY基因家族成员的生物学功能奠定基础。
1材料和方法
1.1试验材料的种植
试验材料中红麻16号的种子由中国农业科学院麻类研究所提供。挑选籽粒饱满的种子播种于湖南文理学院温室，待红麻幼苗长到四叶一心时移栽到水培室进行培养，培养7d后选取健壮的红麻幼苗45株，进行nacl胁迫处理，nacl的浓度梯度为0，0，100，200，400mmol/l，每个处理3株，3个生物学重复，胁迫处理7d后，分别选取每个浓度梯度红麻幼苗的根?茎?叶，液氮速冻后放入超低温冰箱保存备用。
1.2试验方法
1.2.1红麻wrky家族成员的鉴定
红麻WRKY家族成员的鉴定从国家基因组科学数据中心(National Genomics Data Center)下载红麻全基因组的核苷酸序列和蛋白质氨基酸序列［15］，利用Blast软件构建本地蛋白数据库，以红麻HcWRKY71［10］蛋白的氨基酸序列为比对序列，利用Blast本地比对功能，在本地建立的蛋白库中进行比对，获取红麻WRKY候选蛋白，同时从Pfam数据库(http：//pfam.xfam.org/)下载WRKY基因家族保守结构域的隐马尔可夫模型文件，利用HMMER3.1软件在红麻本地蛋白数据中进行BlastP搜索，获取红麻WRKY候选蛋白，去掉重复序列后将二者获得序列全部作为WRKY基因家族的候选序列。然后利用在线软件SMART(http：//smart.embl.de/)和NCBI网站的CD-SearchTool对基因家族候选序列的WRKY结构域进行预测，去掉不具有WRKY结构域的候选序列，最后获得红麻WRKY基因家族序列，将获得的WRKY基因家族序列逐条在NCBI网站进行BlastP序列比对并命名。
1.2.2红麻WRKY家族成员系统进化树的构建
从网站(https：//www.arabidopsis.org/)下载拟南芥WRKY家族成员核苷酸序列并翻译成蛋白质氨基酸序列，利用MEGA11.0软件，采用邻近法构建拟南芥和红麻2个物种WRKY基因家族系统发育进化树。
1.2.3红麻WRKY家族基因保守基序和蛋白理化性质分析
利用在线网站MEME(https：//memesuite.org/)对红麻WRKY家族基因进行保守基序分析，同时利用在线网站ExPASy(https：//www.expasy.org/)检测WRKY家族成员氨基酸序列的等电点(PI)、蛋白质分子量(MW)和氨基酸数目(aa)。
1.2.4盐胁迫下红麻WRKY家族的实时荧光定量PCR分析
利用植物总RNA提取试剂盒分别提取不同NaCl浓度胁迫下红麻植株根、茎、叶的总RNA，并反转录成cDNA作为实时荧光定量PCR的模板。根据WRKY家族基因的核苷酸序列，利用PrimerPremier6.0设计引物(表1)。以Hcβaction基因为内参基因，采用qRT-PCR技术对在不同NaCl浓度胁迫下WRKY家族成员的表达特征进行分析，每个反应设置3次重复。qRT-PCR的反应体系：上下游引物各0.5μL，qPCRmix10μL，cDNA模板2μL，ddH2O补至20μL。qRT-PCR的2步法扩增程序：95℃2min;95℃15s，60℃30s，45个循环;溶解曲线标准程序：95℃15s，65℃15s。
表1 实时荧光定量PCR引物序列
2结果与分析
2.1红麻WRKY家族基因成员鉴定及其理化性质分析
通过Blast和HMMER序列比对，结合WRKY保守结构域分析，最后获得33个WRKY家族成员。将33个WRKY家族成员逐条在NCBI网站进行Blast比对分析，根据最小E值对其进行系统命名。由表2可知，33个WRKY家族成员不均匀地分布在12条染色体上。其中，7，6号染色体分布的WRKY家族成员最多，各5个成员;5，8号染色体分布的WRKY家族成员最少，各1个成员;3，6，7号染色体分别存在同一基因的2个拷贝，分别是HcWRKY71-1、HcWRKY71-2;HcWRKY72-1、HcWRKY72-2;HcWRKY40-1、HcWRKY40-2。而HcWRKY75基因的2个拷贝分别位于18，4号染色体上。这可能是由基因组复制事件导致的结果。
WRKY家族成员理化性质鉴定分析结果如表2所示，该基因家族多肽链氨基酸数目为87～1142个;等电点为5.26～10.18;蛋白质分子质量为0.2～132.7。
2.2红麻WRKY家族成员系统进化树分析
利用MEGA11.0对72个拟南芥WRKY家族成员和33个红麻WRKY家族成员的氨基酸序列构建系统发育进化树，结果如图1所示。由图1可知，2个物种的WRKY家族成员分成了3个类群GroupⅠ、GroupⅡ、GroupⅢ，其中GroupⅢ包含了5个亚组。红麻WRKY家族成员在每个分支都有分布，其中，GroupⅠ和GroupⅢ-a全部为红麻WRKY家族成员。
红麻WRKY家族成员中的HcWRKY13、Hc-wrky31?hcwrky33?hcwrky40-2分布在groupⅡ，与其相对应的拟南芥的wrky家族成员则分布在groupⅢ。这可能是由于红麻属于锦葵科木槿属，而拟南芥属于十字花科鼠耳芥属的缘故。
表2 WRKY家族成员及其理化性质分析
2.3WRKY家族成员保守基序分析
由图2可知，33个WRKY家族成员都含有WRKY保守基序，其中有5个WRKY家族成员含有2个WRKY保守基序。这一结果与系统进化树的分析结果相似，具有2个WRKY保守基序的WRKY家族成员(HcWRKY2、HcWRKY3、HcWRKY4、HcWRKY58)都位于GroupⅡ;其余28个WRKY家族成员都含有1个WRKY保守基序，分布在系统进化树的不同分支上。
2.4WRKY家族成员在不同器官的表达分析
采用荧光定量PCR技术，对33个红麻WRKY家族成员在不同器官的表达特征进行分析，成功检测到26个WRKY家族成员基因在不同器官的表达变化，分别是HcWRKY2、HcWRKY3、HcWRKY4、HcWRKY7、HcWRKY9、HcWRKY11、HcWRKY13、HcWRKY17、HcWRKY24、HcWRKY31、HcWRKY32、HcWRKY33、HcWRKY39、HcWRKY40-1、HcWRKY40-2、HcWRKY43、HcWRKY44、HcWRKY47、HcWRKY53、HcWRKY57、HcWRKY58、HcWRKY65、HcWRKY71-1、HcWRKY72-1、HcWRKY72-2、HcWRKY74。未能检测到的WRKY家族成员有7个，分别是HcWRKY23、HcWRKY26、HcWRKY46、HcWRKY51、HcWRKY71-2、HcWRKY75-1、HcWRKY75-2。其中在根、茎、叶表达量没有显著差异的WRKY家族成员有8个，分别是HcWRKY4、HcWRKY7、HcWRKY39、HcWRKY43、HcWRKY44、HcWRKY53、HcWRKY71-1、HcWRKY72-1(图3);在根和茎的表达量低于叶片的WRKY家族成员有5个，分别是HcWRKY2、HcWRKY32、HcWRKY33、HcWRKY47、HcWRKY74，其中在根中表达量极显著低于叶片的是HcWRKY2、HcWRKY32、HcWRKY33、HcWRKY74。hcwrky71-2?hcwrky75-1?hcwrky75-2。其中在根?茎?叶表达量没有显著差异的wrky家族成员有8个，分别是hcwrky4?hcwrky7?hcwrky39?hcwrky43?hcwrky44?hcwrky53?hcwrky71-1?hcwrky72-1(图3);在根和茎的表达量低于叶片的wrky家族成员有5个，分别是hcwrky2?hcwrky32?hcwrky33?hc-wrky47?hcwrky74，其中在根中表达量极显著低于叶片的是hcwrky2?hcwrky32?hcwrky33?hcwrky74。在茎中表达量极显著低于叶片的是基因hc-wrky33，显著低于叶片的基因是hcwrky47?hc-wrky32。在根中表达量显著低于叶片的基因是hcwrky72-2(图4)。在茎中表达量高于叶片的wrky家族成员有12个，其中极显著高于叶片的是hcwrky9?hcwrky13?hcwrky31?hcwrky40-1?hc-wrky40-2?hcwrky57?hcwrky65基因，显著高于叶片的基因是hcwrky3?hcwrky17(图5)。综上所述，红麻wrky家族成员在根?茎?叶都有表达，都属于组成型表达基因。
图1 红麻和拟南芥wrky家族成员系统进化树
图2 红麻wrky家族成员保守基序分布
图3 在不同器官表达量无显著差异的wrky家族成员
图4 在根?茎表达量下调的wrky家族成员
图5 在茎表达量上调的wrky家族成员
2.5盐胁迫下wrky家族成员的表达分析
以叶片cdna为pcr模板，采用荧光定量pcr技术，对成功检测到的26个wrky家族成员在盐胁迫下的表达特征进行分析，结果发现，不同的wrky家族成员具有不同的表达特征。
2.5.1盐胁迫下基因表达量一直上升的wrky家族成员
盐胁迫下，随着nacl浓度的升高，基因表达量一直上升的wrky家族成员有5个，分别是hcwrky17?hcwrky24?hcwrky40-1?hcwrky53?hcwrky71-1。由图6可知，当nacl浓度为400mmol/l时，hcwrky71-1基因表达量上调幅度最大，为对照的42倍，其次是hcwrky53?hcwrky40-1?hcwrky24?hcwrky17。与对照相比，这5个wrky家族成员表达量上调幅度都具有极显著差异水平(p<0.01)。由此推测，这5个wrky家族成员在红麻响应盐胁迫的过程中具有正向调控作用。
2.5.2盐胁迫下基因表达量先上升后下降再上升的wrky家族成员
盐胁迫下，随着nacl浓度的升高，基因表达量先上升后下降然后再上升的wrky家族成员有5个，分别是hcwrky39?hcwrky40-2?hcwrky47?hcwrky58?hcwrky72-1。由图7可知，在低浓度nacl胁迫下(50mmol/l)，这5个wrky家族成员基因的表达量均呈现不同程度的上调，随着nacl浓度的升高，基因的表达量均呈现下降的趋势。当nacl浓度为400mmol/l时，hcwrky47?hcwrky58?hcwrky72-1基因的表达量则进一步上升，其中hcwrky72-1基因的表达量是对照表达量的9倍多，其次依次是hcwrky47?hcwrky58。由此推测，这5个wrky家族成员在红麻响应盐胁迫过程中具有正向调控作用。
图6 盐胁迫下表达量一直上升的wrky家族成员
图7 盐胁迫下基因表达量先上升后下降再上升的wrky家族成员
盐胁迫下基因表达量先上升后下降的wrky家族成员随着nacl浓度的升高，基因表达量先上升然后下降的wrky家族成员有12个，分别是hc-wrky2?hcwrky4?hcwrky7?hcwrky13?hcwrky31?hcwrky32?hcwrky33?hcwrky43?hcwrky44?hc-wrky65?hcwrky72-2?hcwrky74(图8)。在nacl浓度为50mmol/l时，基因表达量达到最高值的有hc-wrky4?hcwrky13?hcwrky31?hcwrky33?hcwrky43?hcwrky72-2?hcwrky74;在nacl浓度为100mmol/l时，基因表达量达到最高值的有hcwrky4?hcwrky44?hcwrky65;在nacl浓度为200mmol/l时，基因表达量达到最高值有hcwrky2?hcwrky7?hcwrky32。与对照相比，基因表达量的最高值均具有极显著差异(除hcwrky4外)。由此可知，这12个wrky家族成员表达量上调达各自峰值时对应不同的nacl浓度，且在红麻响应盐胁迫过程中均具有正向调控作用。
图8 盐胁迫下表达量先上升后下降的wrky家族成员
盐胁迫下表达量先下降后上升的wrky家族成员随着nacl浓度的升高，基因表达量先下降然后上升的wrky家族成员有1个，即hcwrky3。由图9可知，在浓度nacl胁迫时(50，100mmol/l)该基因表达量下降，与对照相比没有显著差异，当nacl浓度升高时(200，400mmol/l)该基因表达量上升，与对照相比具有极显著差异。推测该基因在红麻响应盐胁迫过程中具有正向调控作用。
2.5.4盐胁迫下基因表达量一直下降的wrky家族成员
随着nacl浓度的升高，基因表达量一直下降的wrky家族成员有3个，分别是hcwrky9?hc-wrky11?hcwrky57。由图10可知，当nacl浓度为400mmol/l，hcwrky11基因表达量下调幅度最大，为对照的1/16倍，其次是依次hcwrky57?hcwrky9。与对照相比，这3个wrky家族成员表达量下调幅度具有极显著差异水平。由此推测，这3个wrky家族成员在红麻响应盐胁迫的过程中具有负向调控作用。
图9 盐胁迫下表达量先下降后上升的wrky家族成员
图10 盐胁迫下表达量一直下降的wrky家族成员
综上所述，盐胁迫下，wrky基因表达量出现上调的家族成员有23个，表达量出现下调的家族成员有3个，表达量上调的wrky基因可能具有正向调控作用，表达量下调表达的wrky基因可能具有负向调控作用。
3结论与讨论
3.1红麻wrky家族成员分子特征
wrky家族成员参与植物的不同逆境调控网络，目前很多植物已经完成了wrky家族成员的系统分析，如拟南芥[16-18]?水稻[19]?小麦[20]?杨树[21]?石榴[22]。然而对红麻wrky家族的系统研究还未见报道。本研究通过红麻基因组blast和hmmer序列比对，结合wrky保守结构域分析，最后获得了33个wrky家族成员，远少于棉花[23]的109个wrky家族成员。这表明，与棉花相比，红麻wrky基因家族在进化过程中基因丢失现象严重，在西瓜[24]和黄瓜[25]wrky家族成员研究者也有相似的结果。不同的wrky家族成员之间在蛋白质理化性质方面存在一定的差异，比如氨基酸数目?蛋白质分子量?理论等电点。这些理化性质的差异是每个wrky家族成员具有不同生物学功能的分子基础。系统进化树分析发现，3个红麻wrky家族成员hcwrky11?hc-wrky32?hcwrky46没有与拟南芥的wrky家族成员聚类到一起。同时分别来源于红麻和拟南芥的wrky家族成员在同一进化树的分支中存在散在的分布情况，说明大多数同源基因在这2个物种适应各自环境的进化过程中发生了一定程度的变异。
3.2红麻wrky家族成员的盐胁迫响应
wrky转录因子家族在植物响应盐胁迫过程中具有重要的调控作用。如在拟南芥中过表达棉花gmwrky34基因能够显著提高转基因拟南芥的耐盐性[26]，在烟草中过表达棉花gmwrky41基因能够显著提高转基因烟草的耐盐性[27]。本研究发现，33个wrky家族成员中有26个被成功检测到，且全部是盐胁迫诱导表达基因，其中23个wrky家族成员具有正向调控作用，3个wrky家族成员具有负向调控作用。这就是红麻耐盐性强的一个重要因素。
盐胁迫下，红麻hcwrky71-1基因的表达量随着nacl浓度的增加而逐渐上调，这与盐胁迫下棉花gh-wrky71[28]基因的表达相似;hcwrky4基因的表达量随着nacl浓度的增加呈现出先上升后下降的表达趋势，同样甘蔗scwrky4[29]基因的表达受到盐胁迫的诱导;红麻hcwrky33基因和拟南芥atwrky33[30]基因都是盐胁迫诱导表达基因。可见，同源基因在不同的物种中具有相似的生物学功能，这将为红麻wrky家族成员的功能研究提供理论参考。
本研究利用生物信息学技术鉴定出了33个wrky家族成员，不均匀地分布在12条染色体上。盐胁迫下，通过实时荧光定量pcr技术成功检测到26个wrky家族成员，其中23个具有正向调控作用，3个具有负向调控作用。这将为进一步研究红麻wrky家族成员的生物学功能奠定坚实的基础。
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