摘 要: 本发明公开一种产生果胶酶的菌株及在汉麻脱胶中的应用，属于微生物技术领域。产生果胶酶的菌株的分类明命名为沃特曼篮状菌 Talaromyces wortmannii，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株保藏名称为：HM01，保藏编号为：CGMCC No、41378，保藏日期为：2024年06月20日；菌株产生果胶酶，不产生纤维素酶，将菌株发酵液喷洒至汉麻杆可使菌株在汉麻表皮定植生长即可提升汉麻的脱胶效果；其有效提高汉麻雨露脱胶效果，加快雨露脱胶速度，提高汉麻麻皮与麻杆的分离效果，促进汉麻纤维产业的高质量发展。
权利要求书
1.一种产生果胶酶的菌株，其特征在于：所述产生果胶酶的菌株的分类明命名为沃特曼篮状菌 Talaromyces wortmannii，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌株保藏名称为：HM01，保藏编号为：CGMCC No、41378，保藏日期为：2024年06月20日。
2.一种权利要求1所述产生果胶酶的菌株的应用，利用沃特曼篮状菌 Talaromyces wortmannii HM01对汉麻脱果胶。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，沃特曼篮状菌 Talaromyces wortmannii HM01发酵生产的果胶酶对汉麻脱果胶。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，沃特曼篮状菌 Talaromyces wortmannii HM01生产果胶酶的过程如下：
a1、将菌种 Talaromyces wortmannii HM01接种于种子液培养基后置于摇床中，摇床恒温28℃、转速180rpm培养48h后获得种子液；
a2、将种子液按0.5％(v/v)的比例转接到发酵培养基中后放入摇床，摇床恒温28℃转速180rpm培养96h获得酶活发酵液；
a3、将酶活发酵液在相对离心力为13000g的条件下离心5min，收集上清液，测定上清液中的果胶酶活性达到324U/mL。
5.据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述种子液培养基成分为：果胶10g/L，(NH4)2SO41.5g/L，K2HPO41.0g/L，KCl0.5g/L，MgSO40.5g/L，FeSO40.1g/L。
6.据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基成分为：陈皮粉10g/L，(NH4)2SO41.5g/L，K2HPO41.0g/L，KCl0.5g/L，MgSO40.5g/L，FeSO40.1g/L。
7.据权利要求4所述的应用，其特征在于，用于果胶酶生产的沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii HM01的筛选过程如下
b1、沃特曼篮状菌的富集培养：选取表面具有霉点、霉斑的汉麻杆，将其表皮揭下后剪成约5mm的小段置于无菌生理盐水中充分震荡，随后将其梯度稀释涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA，于28℃培养3天后从PDA中挑取形态学上符合真菌特征的菌株进行初筛。
b2、初筛：将初筛得到的菌株进行菌种纯化，将菌种点种于固体纤维素培养基的中央，于28℃培养5天后向固体纤维素培养基表面滴加刚果红溶液进行染色，选择不能在纤维素培养基生长或不具有明显透明圈的菌株进行复筛；
b3、复筛：将初筛所得菌株点种于固体果胶培养基的中央，于28℃培养5天后向固体果胶培养基表面滴加碘液进行染色，测定和计算其透明圈直径与菌落直径的比值，选取比值最大的一株菌即为筛选后的菌种。
8.一种利用权利要求4所述果胶酶在汉麻脱胶中的应用，其特征在于，将菌种 Talaromyces wortmannii HM01接种于种子液培养基中，摇床转速180rpm、温度28℃培养48h，接着将所得种子液按0.5％(v/v)的比例转接到PDA培养基中，摇床转速180rpm、温度28℃培养96h获得脱胶发酵液；将脱胶发酵液喷洒在汉麻杆上，脱胶发酵液在汉麻杆表皮引起明显的菌株定植现象，并提升脱胶的效果。
9.据权利要求8所述的应用，其特征在于，利用脱胶发酵液处理汉麻杆具体步骤如下：
c1、微生物定植分析：将汉麻杆截成20cm的长度平铺在容器内；将脱胶发酵液装入喷壶内，以0.1mL发酵液/g汉麻的比例喷洒至汉麻杆表面；随后将汉麻杆于室温环境静置3天，观察汉麻表面微生物定植情况；
c2、脱胶效果测定：将脱胶发酵液在13000g、4℃的条件下离心5min，取上清液；将汉麻表皮用清水清洗晾干，随后按1:1(w/v)的比例将表皮浸于发酵上清液中，于摇床28℃、100rpm的条件下孵育5h即可实现脱胶处理。
10.据权利要求9所述的应用，其特征在于，将孵育后的汉麻表皮用清水清洗晾干，称量处理前后汉麻表皮的干重从而计算出脱胶率，脱胶率＝[(处理前干重 处理后干重)/处理前干重]×100％。
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种产生果胶酶的菌株及在汉麻脱胶中的应用。
背景技术
汉麻是汉麻科汉麻属的一年生草本植物，是最早应用于纺织业的植物之一。我国的汉麻种植历史悠久，产量居世界第一。汉麻纤维是从汉麻杆上分离得到的韧皮组织，通常也称为原麻。汉麻纤维的化学组分主要包括纤维素和胶质两大类，后者则主要由果胶、水溶物、半纤维素和木质素等非纤维素成分构成。胶质会影响汉麻纤维的可纺性，因此原麻需要经过脱胶处理才能作为纺织原料使用。
目前工业上常用的脱胶方法包括物理脱胶、化学脱胶和生物脱胶。物理脱胶是使用碾压、超声波及气爆等方法进行处理，但该法脱胶不彻底，且能耗一般较高；化学脱胶是通过碱处理或氧化处理的方法进行脱胶，其脱胶效果好、工艺较为成熟，但仍存在着能耗高、污染大等问题；生物脱胶是利用微生物或酶的作用特异性地分解原麻中的胶质、保留纤维素成分的方法，该方法工艺简单、能耗较低、绿色环保。然而，目前能用于汉麻脱胶的菌株种类少，酶活及酶产量低，这些因素限制了生物脱胶技术的推广应用。
常用于汉麻脱胶的微生物包括真菌和细菌两大类。与细菌相比，真菌在汉麻脱胶中具有明显的优势：一是真菌的酶产量大、酶活性高；二是真菌对于木质素等抗降解成分具有较强的分解能力，而细菌一般不能降解木质素；三是真菌喷施后更容易在汉麻表面定植，并产生孢子扩散，能长时间地发挥脱胶作用。因此整体而言，真菌的脱胶能力更强、效果更好。然而，真菌在应用上也有一些障碍：一方面，真菌的酶系更加丰富，它在分解胶质时往往同时产生纤维素酶，这会导致汉麻纤维水解、损害其可纺性；另一方面，真菌在液体培养时会形成菌丝球，这种颗粒状结构会堵塞管路和喷口，不利于使用设备进行田间喷施。因此，开发适宜脱胶应用的新型真菌资源成为了研究的热点方向。
发明内容
针对现有技术的不足之处，提供一种产生果胶酶的菌株及在汉麻脱胶中的应用，其只产生果胶酶，不产生纤维素酶，将菌株发酵液喷洒至汉麻杆可使菌株在汉麻表皮定植生长即可提升汉麻的脱胶效果；其有效提高汉麻雨露脱胶效果，加快雨露脱胶速度，提高汉麻麻皮与麻杆的分离效果，促进汉麻纤维产业的高质量发展。
所述产生果胶酶的菌株的分类明命名为沃特曼篮状菌 Talaromyces wortmannii，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌株保藏名称为：HM01，保藏编号为：CGMCC No、41378，保藏日期为：2024年06月20日。
一种产生果胶酶的菌株的应用，利用沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii HM01对汉麻脱果胶。
进一步，利用沃特曼篮状菌 Talaromyces wortmannii HM01发酵生产的果胶酶对汉麻脱果胶。
进一步，沃特曼篮状菌 Talaromyces wortmannii HM01生产的果胶酶的过程如下：
a1、将菌种 Talaromyces wortmannii HM01接种于种子液培养基后置于摇床中，摇床恒温28℃、转速180rpm培养48h后获得种子液；
a2、将种子液按0.5％(v/v)的比例转接到发酵培养基中后放入摇床，摇床恒温28℃转速180rpm培养96h获得酶活发酵液；
a3、将酶活发酵液在相对离心力为13000g的条件下离心5min，收集上清液，测定上清液中的果胶酶活性达到324U/mL。
进一步，所述种子液培养基成分为：果胶10g/L，(NH4)2SO41.5g/L，K2HPO41.0g/L，KCl0.5g/L，MgSO40.5g/L，FeSO40.1g/L。
进一步，所述发酵培养基成分为：陈皮粉10g/L，(NH4)2SO41.5g/L，K2HPO41.0g/L，KCl0.5g/L，MgSO40.5g/L，FeSO40.1g/L。
进一步，用于果胶酶生产的沃特曼篮状菌 Talaromyces wortmannii HM01的筛选过程如下：
b1、沃特曼篮状菌的富集培养：选取表面具有霉点、霉斑的汉麻杆，将其表皮揭下后剪成约5mm的小段置于无菌生理盐水中充分震荡，随后将其梯度稀释涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA，于28℃培养3天后从PDA中挑取形态学上符合真菌特征的菌株进行初筛。
b2、初筛：将初筛得到的菌株进行菌种纯化，将菌种点种于固体纤维素培养基的中央，于28℃培养5天后向固体纤维素培养基表面滴加刚果红溶液进行染色，选择不能在纤维素培养基生长或不具有明显透明圈的菌株进行复筛；
b3、复筛：将初筛所得菌株点种于固体果胶培养基的中央，于28℃培养5天后向固体果胶培养基表面滴加碘液进行染色，测定和计算其透明圈直径与菌落直径的比值，选取比值最大的一株菌即为筛选后的菌种。
一种利用果胶酶在汉麻脱胶中的应用，将菌种 Talaromyces wortmannii HM01接种于种子液培养基中，摇床转速180rpm、温度28℃培养48h，接着将所得种子液按0.5％(v/v)的比例转接到PDA培养基中，摇床转速180rpm、温度28℃培养96h获得脱胶发酵液；将脱胶发酵液喷洒在汉麻杆上，脱胶发酵液在汉麻杆表皮引起明显的菌株定植现象，并提升脱胶的效果。
进一步，利用脱胶发酵液处理汉麻杆具体步骤如下：
c1、微生物定植分析：将汉麻杆截成20cm的长度平铺在容器内；将脱胶发酵液装入喷壶内，以0.1mL发酵液/g汉麻的比例喷洒至汉麻杆表面；随后将汉麻杆于室温环境静置3天，观察汉麻表面微生物定植情况；
c2、脱胶效果测定：将脱胶发酵液在13000g、4℃的条件下离心5min，取上清液；将汉麻表皮用清水清洗晾干，随后按1:1(w/v)的比例将表皮浸于发酵上清液中，于摇床28℃、100rpm的条件下孵育5h即可实现脱胶处理。
进一步，将孵育后的汉麻表皮用清水清洗晾干，称量处理前后汉麻表皮的干重从而计算出脱胶率，脱胶率＝[(处理前干重 处理后干重)/处理前干重]×100％。
有益效果：a、本发明所用的菌株 Talaromyces wortmannii HM01生长速度快，发酵周期短，在以陈皮粉为碳源的发酵培养基中果胶酶活性高，能作为生产果胶酶的菌株资源；b、本发明所用的菌株 Talaromyces wortmannii HM01在PDA培养基中能产生高活性的果胶酶，但几乎不产生纤维素酶，可有效避免粗发酵液喷施至汉麻杆后对汉麻纤维造成损害；c、本发明所用的菌株 Talaromyces wortmannii HM01在PDA培养基中不形成菌丝球，可不进行额外处理直接装载于喷壶、农机、无人机等设备进行喷洒，不会堵塞管路、喷口；d、本发明所用的菌株 Talaromyces wortmannii HM01属于真菌，能有效在汉麻杆表面定植，且能产生孢子在麻杆间扩散，在露天环境下施用也能取得良好的脱胶效果；e、本发明所用的菌株 Talaromyces wortmannii HM01原位分离于黑龙江省汉麻种植区的汉麻秸秆上，具有较强的汉麻种植环境的适应性。
附图说明
图1为本发明产生果胶酶的菌株 Talaromyces wortmannii HM01的菌落形态图；
图1
图2为本发明产生果胶酶的菌株的ITS片段扩增结果图；
图3为本发明产生果胶酶的菌株系统发育树图；
图3
图4为本发明实施例中产生果胶酶的菌株 Talaromyces wortmannii HM01在汉麻表皮的定植效果示意图。
图4
具体实施方式
下面结合说明书附图的内容对本发明的实施例做进一步说明：
本发明公开一种产生果胶酶的菌株，所述产生果胶酶的菌株的分类明命名为沃特曼篮状菌 Talaromyces wortmannii，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌株保藏名称为：HM01，保藏编号为：CGMCC No、41378，保藏日期为：2024年06月20日，该菌株原位分离自黑龙江省汉麻秸秆，具有较好的汉麻种植环境适应性。有利于提高汉麻雨露脱胶效果，加快雨露脱胶速度，提高汉麻麻皮与麻杆的分离效果，促进汉麻纤维产业的高质量发展，具体如图1所示。
1、果胶酶生产菌的筛选
a、真菌的富集培养：选取表面具有霉点、霉斑的汉麻杆，将其表皮揭下后剪成约5mm的小段置于无菌生理盐水中充分震荡，随后将其梯度稀释涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，于28℃培养3天后挑取形态学上符合真菌特征的菌株进行初筛。
b、初筛：将上一步得到的真菌进行菌种纯化，随后点种于固体纤维素培养基的中央，于28℃培养5天后向培养基表面滴加刚果红溶液进行染色，选择不能在纤维素培养基生长或不具有明显透明圈的菌株进行复筛。
c、复筛：将初筛所得菌株点种于固体果胶培养基的中央，于28℃培养5天后向培养基表面滴加碘液进行染色，测定和计算其透明圈直径与菌落直径的比值，选择比值最大的一株菌进行后续实验。
2、果胶酶生产菌的鉴定
a、形态学鉴定：在PDA培养基上，28℃培养5天形成典型菌落。菌落近圆形，轮廓规则，外观绵密紧致，正面呈墨绿色，边缘为白色，背面为浅绿色，且产橘黄色物质。
b、分子生物学鉴定：取新鲜菌丝50mg，加液氮研磨，用试剂盒提取其基因组DNA。以该基因组DNA为模板，利用通用引物ITS1(5’ TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’)和ITS4(5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’)进行PCR，扩增得到一约700bp长度的片段，菌株的ITS片段扩增结果如图2所示；对该片段测序后将序列在NCBI中进行BLAST比对分析，结果表明菌株的ITS序列与 Talaromyces wortmannii ITS序列的一致性最高，达98％；利用MEGA7.0软件构建ITS序列的系统发育树，如图3所示，发现该菌株与 Talaromyces wortmannii亲缘关系最近。结合形态学特征，将分离所得的菌株鉴定为 Talaromyces wortmannii。
菌株的ITS片段测序结果为；
AATGATCCTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGCGGGTTCTCACGAGCCCAACCTCCCACCCGTGTTTACCGTTACCGCGTTGCCTCGGCGGGCCCACTGGGGCCTGGCCCCGGTCGCCGGGGGGCTTCTGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGACGCACCCTAGAACCCTGCCTGAATAGTGAGTCTGAGTGAGATTTGAAATCATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTGCCCTCCAGCACGGCTGGGTGTTGGGCGCTGTCCCCCCGGGGACACGCCCCAAAAGCAGTGGCGGCGCCGCGTCGGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCGGGAGGGACTCGGTCGGCGCTGGTCTTCCCTTTAGGCCGCCCTTCGGGGTGCGCCTCTTCCGGTGACCTCGGATCAGGTAGACACCCGATTGC。
3、酶活测定
a、粗酶液提取：将菌种 Talaromyces wortmannii HM01接种于种子液培养基中，摇床180rpm、28℃培养48h，接着将所得种子液按0.5％(v/v)的比例转接到发酵培养基中，摇床180rpm、28℃培养96h获得酶活发酵液，最后将发酵液于13000g、4℃离心5min，收集上清液作为酶液；将上清液在沸水浴中孵育30min，冷却后作为酶液的失活对照。
b、果胶酶活性测定：用pH5.0的磷酸缓冲液配置0.2％的果胶溶液作为底物，用相同的缓冲液对酶液进行适当稀释；取100μL底物溶液和50μL酶稀释液加入到一个1.5mL离心管中，混匀后于50℃反应10min，随后立即加入200μLDNS试剂终止反应；将体系混匀后置于沸水浴反应5min，冷却后加入1mL去离子水稀释；测定反应液在520nm处的吸光度值，再根据标准曲线计算产物释放量和酶活性。在本体系中，每分钟产生1μmol产物所需的酶量被定义为1个活力单位，结果显示酶活发酵液的果胶酶活性达到324U/mL。
c、纤维素酶活性测定：用pH5.0的磷酸缓冲液配置0.2％的羧甲基纤维素钠溶液作为底物，用相同的缓冲液对酶液进行适当稀释；取100μL底物溶液和50μL酶稀释液加入到一个1.5mL离心管中，混匀后于50℃反应10min，随后立即加入200μLDNS试剂终止反应；将体系混匀后置于沸水浴反应5min，冷却后加入1mL去离子水稀释；测定反应液在520nm处的吸光度值，再根据标准曲线计算产物释放量和酶活性。在本体系中，每分钟产生1μmol产物所需的酶量被定义为1个活力单位，结果显示酶活发酵液几乎不含纤维素酶活性。
4、利用 Talaromyces wortmannii 脱胶发酵液处理汉麻杆
a、微生物定植分析：将汉麻杆截成20cm左右的长度平铺在容器内；将脱胶发酵液装到喷壶内，以0.1mL发酵液/g汉麻的比例喷洒至汉麻杆表面；随后将汉麻杆于室温环境静置3天，观察汉麻表面微生物定植情况。
b、脱胶效果测定：将脱胶发酵液在13000g、4℃的条件下离心5min，取上清液；将汉麻表皮用清水清洗晾干，随后按1:1(w/v)的比例将表皮浸于发酵上清液中，于28℃、100rpm条件下孵育5h；将处理后的表皮用清水清洗晾干。称量处理前后表皮的干重计算脱胶率：
脱胶率＝[(处理前干重 处理后干重)/处理前干重]×100％
实施例1：果胶酶产生菌的筛选鉴定和产酶发酵
5、配制培养基：
a、种子液培养基：果胶10g/L，(NH4)2SO41.5g/L，K2HPO41.0g/L，KCl0.5g/L，MgSO40.5g/L，FeSO40.1g/L，pH值自然，115℃灭菌30min；
b、发酵培养基：陈皮粉10g/L，(NH4)2SO41.5g/L，K2HPO41.0g/L，KCl0.5g/L，MgSO40.5g/L，FeSO40.1g/L，pH值自然，115℃灭菌30min；
c、PDA培养基：称取200g马铃薯切块，加水煮沸30分钟，用八层纱布过滤，向滤液加入20g葡萄糖搅拌溶解，冷却后定容至1L，pH值自然，115℃灭菌30min。
实施例2：果胶酶产生菌改善汉麻脱胶效果
6、配制培养基
a、种子液培养基：果胶10g/L，(NH4)2SO41.5g/L，K2HPO41.0g/L，KCl0.5g/L，MgSO40.5g/L，FeSO40.1g/L，pH值自然，115℃灭菌30min；
b、PDA培养基：称取200g马铃薯切块，加水煮沸30分钟，用八层纱布过滤，向滤液加入20g葡萄糖搅拌溶解，冷却后定容至1L，pH值自然，115℃灭菌30min。
7、脱胶发酵液制备
将菌种 Talaromyces wortmannii HM01接种于种子液培养基中，180rpm、28℃摇床培养48h，接着将所得种子液按0.5％(v/v)的比例转接到PDA培养基中，180rpm、28℃摇床培养96h获得脱胶发酵液。
8、如图4所示，利用脱胶发酵液处理汉麻杆
a、微生物定植分析：将汉麻杆截成20cm左右的长度，平铺在容器内；将脱胶发酵液装到喷壶内，以0.1mL发酵液/g汉麻的比例喷洒至汉麻杆表面；随后将汉麻杆于室温环境静置3天，观察汉麻表面微生物定植情况，结果表明喷施发酵液可在表皮引起明显的菌株定植现象，并提升脱胶的效果。
b、脱胶效果测定：将脱胶发酵液在13000g、4℃的条件下离心5min，取上清液；将汉麻表皮用清水清洗晾干，随后按1:1(w/v)的比例将表皮浸于发酵上清液中，于28℃，100rpm条件下孵育5h；将处理后的表皮用清水清洗晾干。称量处理前后表皮的干重计算脱胶率，结果发现脱胶率显著提升。
文章摘自国家发明专利，一种产生果胶酶的菌株及在汉麻脱胶中的应用，发明人:刘伟杰，刘佳文，董振，张莹，刘聪，孙地，朱静榕，申请号，202411256784.4，申请日，2024.09.09。
