摘 要: 本发明涉及罗布麻鉴定技术领域，特别涉及基于罗布麻叶绿体基因制备的条形码及其应用，本发明的DNA条形码标是基于罗布麻属叶绿体基因设计的，能快速的对罗布麻属(Apocynum)的两个品种：罗布红麻(A.venetum)和罗布白麻(A.pictum)进行区分、鉴定，经基因对比发现：罗布红麻(A.venetum)和罗布白麻(A.pictum)的ycf1基因和rpoC2基因差异明显，特异性位点差别很大，可能通过对上述两种进行测序，就能快速区分罗布麻属的两个品种，该方法为能为后续的罗布麻植物学分类提供更准确的基因辅助工具。
权利要求书
1.基于罗布麻叶绿体基因制备的条形码,其特征在于,所述条形码为DNA条形码,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.4所示。
2.如权利要求1所述基于罗布麻叶绿体基因制备的条形码在区分不同罗布麻种质资源中的应用。
3.一种应用如权利要求1所述条形码对不同罗布麻种质资源进行鉴定的方法,其特征在于,所述方法为:提取待鉴定的罗布麻材料的叶绿体DNA,以叶绿体DNA为模板,应用rpoC2基因引物:如SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.6所示和ycf1基因引物:如SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.8所示对其基因组DNA进行PCR扩增,然后对PCR产物进行测序,如测序的rpoC2基因序列如SEQIDNO.1所示,在176 184bp处的基因序列为:5’ TAACCTCTC 3’且在203 211bp处的基因序列为:5’ TAACCTCTC 3’,则该样品为罗布白麻(A.pictum),如测序的rpoC2基因序列如SEQ ID NO.2所示,则该样品为罗布红麻(A.venetum);如测序的ycf1基因序列如SEQ ID NO.3所示,在153 158bp处的基因序列为:5’ AAAGAA 3’,则该样品为罗布红麻(A.venetum),如测序的ycf1基因序列如SEQ ID NO.4所示,则该样品为罗布白麻(A.pictum)。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述PCR扩增总反应体系为25μl:2×Reaction Mix 12.25μl, Golden DNAPolymerase 0.25μl,正反向引物各2.5μl,ddH2O 5μl,DNA模板2.5μl;
反应条件为:①94℃预变性3min;②94℃变性30s;③58℃退火30s;④72℃延伸30s;⑤步骤② ④循环35次;⑥72℃延伸7min。
技术领域
本发明涉及罗布麻鉴定技术领域，特别涉及基于罗布麻叶绿体基因制备的条形码及其应用。
背景技术
罗布麻(Apocynum venetum)又称茶棵子和茶叶花等,隶属夹竹桃科(Apocynaceae),是一种半灌木状多年生草本宿根植物,通过种子和根蘖繁殖。罗布麻能够在盐碱沙荒地等恶劣的自然环境下生长,具有改土保水等良好的生态效用,也可作为观赏植物种植。罗布麻叶可以入药,也可制保健茶;罗布麻纤维有“野生纤维之王”的美誉,是一种不可多得的天然纤维材料,因此综合利用价值巨大。
虽然罗布麻于1952年由董正钧先生命名,但其植物学分类问题并没有得到相应解决,只是沿用当地俗称,分为红麻和白麻两种。之后,张鹏云等多位学者就罗布麻的植物学分类问题发表了不同意见,分歧主要在于分类体系是采用Woodson的分类方法还是林氏分类法。1975年出版的《中国植物志》记载:我国俗称罗布麻的植物有3种,划归2个属。具体包括罗布麻属(Apocynum)中的罗布麻(A.venetum)及白麻属(Poacynum)中的白麻(P.pictum)和大叶白麻(P.hender sonii)。直至近年,罗布麻类植物的植物学分类问题依然未得到解决,不同学者之间仍存在争议,焦点主要在于白麻属与罗布麻属物种之间的亲缘关系远近以及白麻属类植物是否有必要另立新属。有学者根据对罗布麻和大叶白麻叶表面气孔形态?叶片?花和种子等结构形态的观察,认为二者在这些方面性状十分相似,大叶白麻没有另立新属的必要,建议将白麻属撤销,并将大叶白麻归并到罗布麻属。另一部份学者认为:通过对罗布麻属物种罗布麻(罗布红麻)?加拿大麻和白麻属物种大叶白麻和白麻的ITS?trnL内含子及trnL F非编码区序列比对,发现罗布红麻?大叶白麻和白麻的ITS序列完全一致,但与加拿大麻ITS序列差异较大;在trnL内含子和trnL F非编码区,大叶白麻和白麻序列完全一致,与罗布红麻仅有3个位点的变异。即来源不同地区不同居群的罗布麻样品之间以及罗布麻和大叶白麻样品的ITS?trnL及trnL F序列基本没有变化,但加拿大麻与此两种植物在这3个DNA标记序列上具有多达十多个SNP以及多处碱基插入/缺失的差异。因此认为罗布红麻与大叶白麻和白麻之间的亲缘关系可能较罗布红麻与罗布麻属内其它物种间的亲缘关系更近,建议撤销白麻属。将大叶白麻和白麻归入罗布麻属。因此,目前一般认为我国的罗布麻植物可划分为1属2种,即罗布麻属(Apocynum),包括罗布红麻(A.venetum)和罗布白麻(A.pictum)两个种。
因此,为了更好的对罗布麻属种质进行区分,有必要从基因手段深入研究,找出能确实区分罗布麻属种质的基因位点,在分子水平上快速区分不同的罗布麻属种质,达到简单?高效?准确区分不同罗布麻属种质的目的,为后续的罗布麻植物学分类提供更准确的基因辅助工具。
发明内容
鉴于上述内容，有必要对罗布麻基因进行深入研究，找出能准确、快速对罗布麻品种进行种质区分的基因位点，并将该位点制备成基因条形码，该条形码将能快速、准确的对不同罗布麻种质进行区分，为后续的罗布麻植物学分类提供更准确的基因辅助工具。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：基于罗布麻叶绿体基因制备的条形码，所述条形码为DNA条形码，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.4所示。
本发明还包括所述基于罗布麻叶绿体基因制备的条形码在区分不同罗布麻种质资源中的应用。
本发明还包括一种应用所述条形码对不同罗布麻种质资源进行鉴定的方法，所述方法为：提取待鉴定的罗布麻材料的叶绿体DNA，以叶绿体DNA为模板，应用rpoC2基因引物：如SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.6所示和ycf1基因引物：如SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.8所示对其基因组DNA进行PCR扩增，然后对PCR产物进行测序，如测序的rpoC2基因序列如SEQ ID NO.1所示，在176 184bp处的基因序列为：5’ TAACCTCTC 3’且在203 211bp处的基因序列为：5’ TAACCTCTC 3’，则该样品为罗布白麻(A.pictum)，如测序的rpoC2基因序列如SEQ ID NO.2所示，则该样品为罗布红麻(A.venetum)；如测序的ycf1基因序列如SEQ ID NO.3所示，在153 158bp处的基因序列为：5’ AAAGAA 3’，则该样品为罗布红麻(A.venetum)，如测序的ycf1基因序列如SEQ ID NO.4所示，则该样品为罗布白麻(A.pictum)。
进一步的，所述PCR扩增总反应体系为25μl：2×ReactionMix12.25μl，GoldenDNAPolymerase0.25μl，正反向引物各2.5μl,ddH2O5μl，DNA模板2.5μl；反应条件为：①94℃预变性3min；②94℃变性30s；③58℃退火30s；④72℃延伸30s；⑤步骤② ④循环35次；⑥72℃延伸7min。
本发明具有如下有益效果：本发明的DNA条形码是基于罗布麻叶绿体基因设计的，能快速的对不同罗布麻属(Apocynum)的两个品种：罗布红麻(A.venetum)和罗布白麻(A.pictum)进行区分、鉴定，经基因对比发现：罗布红麻(A.venetum)和罗布白麻(A.pictum)的ycf1基因和rpoC2基因差异明显，特异性位点差别很大，可能通过对上述两种进行测序，就能快速区分罗布麻属的两个品种，该方法能为后续的罗布麻植物学分类提供更准确的基因辅助工具。
附图说明
图1为罗布麻种质的叶绿体基因rpoC2差异片段图，从上至下依次为罗布白麻、罗布红麻、罗布白麻、罗布红麻、罗布白麻、罗布白麻、罗布白麻、罗布红麻、罗布红麻、罗布红麻、罗布白麻、罗布白麻、罗布红麻和罗布红麻。
图1
图2 图15为14个不同罗布麻样品的差异片段的rpoC2基因测序峰图,其中,图2?图4?图6?图7?图8?图12和图13的测序峰图的样品为罗布白麻;图3?图5?图9?图10?图11?图14和图15的样品为罗布红麻。
图2
图3
图5
图6
图7
图8
图9
图10
图11
图12
图13
图14
图15
图16为罗布麻种质的叶绿体基因ycl1差异片段图，从上至下依次为罗布白麻、罗布红麻、罗布白麻、罗布红麻、罗布白麻、罗布白麻、罗布白麻、罗布红麻、罗布红麻、罗布红麻、罗布白麻、罗布白麻、罗布红麻和罗布红麻。
图16
图17 图30为14个不同罗布麻样品的差异片段的ycl1基因测序峰图，其中，图17、图19、图21、图22、图23、图27和图28的测序峰图的样品为罗布白麻；图18、图20、图24、图25、图26、图29和图30的样品为罗布红麻。
图17
图18
图19
图20
图21
图22
图23
图24
图25
图26
图27
图28
图29
图30
图31为基因rpoC2的电泳图。
图31
图32为基因ycf1的电泳图。
图32
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例1
本实施例为罗布麻叶绿体基因间区多态性区域的筛选，具体方法如下。
(1)从NCBI上下载罗布红麻和罗布白麻的叶绿体基因，将罗布红麻和罗布白麻的这些基因的编码序列利用DNAMAN进行比对，发现罗布红麻和罗布白麻的rpoC2和ycf1基因之间存在较大片段的差异(InDel)。
(2)收集罗布红麻(红杆小花)和罗布白麻(红杆中花)的叶片，将幼嫩叶片在研钵中充分研磨，使用DNA提取试剂盒(天根DP320 03DNAsecure新型植物基因组DNA提取试剂盒)，按说明书步骤提取DNA。所得DNA 20℃保存待用。
(3)对罗布红麻和罗布白麻的ycf1和rpoC2基因之间的InDel进行测序验证：总反应体系为25μl:2×Reaction Mix12.25μl,Golden DNAPolymerase0.25μl,正反向引物各2.5μl,ddH2O5μl，DNA模板2.5μl。反应条件为：①94℃预变性3min；②94℃变性30s；③58℃退火30s；④72℃延伸30s；⑤步骤② ④循环35次；⑥72℃延伸7min。挑选琼脂糖电泳效果好的、明亮的、无杂带的样本PCR产物，送样进行一代sanger测序，均使用正向基因进行DNA扩增，扩增使用的引物对参见表1。
(4)将测序序列和NCBI下载序列比对，确认罗布红麻和罗布白麻的rpoC2和ycf1基因间的InDel序列确实存在。
因此人工核对后筛选得出：叶绿体基因rpoC2基因和叶绿体基因ycf1可以作为有效区分罗布红麻和罗布白麻核心种质特异性鉴别DNA条形码。
实施例2
(1)按照实施例1的方法获得14份罗布红麻或罗布白麻种质的DNA(表2)。
(2)对DNA条形码基因rpoC2和ycf1片段的扩增与测序：总反应体系为25μl：2×Reaction Mix12.25μl,Golden DNAPolymerase 0.25μl，正反向引物各2.5μl,ddH2O5μl,DNA模板2.5μl。反应条件为：①94℃预变性3min：②94℃变性30s；③58℃退火30s；④72℃延伸30s；⑤步骤② ④循环35次；⑥72℃延伸7min。参照图31基因rpoC2和图32基因ycf1的电泳图，挑选琼脂糖电泳效果好的、明亮的、无杂带的样本PCR产物，送样测序，均使用正向基因进行DNA扩增，扩增使用的引物对参见表1。
表1 基因rpoC2和ycf1的扩增引物
(3)序列比对、质量核查：使用DNAMAN对序列进行质量核查，通过多重序列比对检查测序结果，找出叶绿体基因rpoC2和叶绿体yc11基因存在差异的片段。
罗布白麻rpoC2基因的测序结果如序列表SEQ ID NO：1所示；罗布红麻rpoC2基因的测序结果如序列表SEQ ID NO：2所示。
罗布红麻ycf1基因的测序结果如序列表SEQIDNO：3所示；罗布白麻ycf1基因的测序结果如序列表SEQ ID NO：4所示。
不同种质叶绿体rpoC2基因的序列对比情况如图1所示，图1中的样品从上至下依次为表1中的样品，从图中可见，罗布白麻样品在176 184bp处的基因序列为：5’ TAACCTCTC 3’且在203 211bp处的基因序列为：5’ TAACCTCTC 3’，而罗布红麻样品的在176 184bp和203 211bp处的基因均为缺失基因。
不同种质叶绿体ycl1基因的序列对比情况如图16所示，图16中的样品从上至下依次为表1中的样品，从图中可见，罗布白麻样品在153 158bp处的基因为缺失基因；而罗布红麻样品在153 158bp处的基因序列为：5’ AAAGAA 3’。
具体测序的峰图如图2 图15和图17 图30所示，具体情况参见表2。
表2 对14份罗布麻样品的的测序结果
通过测序结果，可以得出，罗布白麻和罗布红麻样品在rpoC2基因和ycl1基因中变异位点非常明显，因此，可以利用rpoC2基因和ycl1基因片段作为鉴定、区分罗布白麻和罗布红麻核心种质特异性DNA条形码。
综上所述，本申请根据叶绿体的rpoC2基因和ycl1基因制备DNA条形码能快速的将罗布白麻和罗布红麻区分出来，是一种准确、高效区分罗布白麻和罗布红麻种质的方法。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
文章摘自国家发明专利，基于罗布麻叶绿体基因制备的条形码及其应用，张吉宇，陈利军，吴凡，许攀，狄红艳，申请号，202411231678.0，申请日，2024.09.04。
