摘 要:重金属镉污染农田的修复是世界性的难题?红麻(Hibiscus cannabinus)耐逆性强,可用于镉污染农田的修复。为了探索红麻WRKY家族成员对镉胁迫的响应模式,本研究利用HMMER和BLAST软件在红麻基因组中鉴定获得HcWRKY家族成员,并通过ExPasy在线网站获得了HcWRKY家族成员的分子信息,同时利用TBtoolsv1.6软件将家族成员全部定位到相应染色体上。结果表明,33个HcWRKY家族成员不均匀地分布在12条染色体上,其理化性质,如氨基酸数量?蛋白质分子量和理论等电点各不相同。除HcWRKY4-2位于细胞质外,其他HcWRKY成员均定位于细胞核内。系统发育分析表明,33个HcWRKY蛋白分为4组:其中第Ⅱ组和第Ⅳ组仅含HcWRKY家族成员;第Ⅰ组和Ⅲ组同时含有HcWRKY和AtWRKY家族成员。实时荧光定量PCR分析表明,受镉胁迫诱导表达的HcWRKY家族成员有24个。在红麻响应镉胁迫反应过程中22个HcWRKY家族成员基因表达量上调,2个HcWRKY家族成员基因表达量下调?这可能是红麻耐镉能力强的一个重要因素。本研究结果为进一步探索HcWRKY基因家族在红麻响应镉胁迫过程中的生物学功能提供了基础资料。
关键词: 红麻；镉胁迫；WRKY基因家族
重金属镉(cadmium,Cd)污染农田的修复是世界性难题。近年来，随着我国工业化的发展如采矿、金属冶炼、精炼、排放未经处理的工业废水以及大量化肥和含镉农药的使用，使得镉污染问题日益突出(Zhao et al.,2017)。据统计，目前我国约有4%的耕地遭受镉污染，占重金属污染土壤总面积的40%(王芸等,2007)。重金属镉不仅严重损坏作物的品质，还能够通过食物链在人体中富集，直接危害人类健康。镉元素不是人体必需的元素，在人体内不易被降解，镉对人的骨骼、肾、肝脏等重要器官会造成严重的损害，还会导致癌症等致命性疾病(Sanità et al.,1999;Chaney et al.,2004;Moynihan et al.,2017)。因此，重金属镉污染土壤的修复和粮食作物安全生产的保障，是当前土壤和环境领域的研究热点。
红麻(Hibiscus cannabinus)具有适应性广，耐逆性强的特点，对重金属污染土壤具有很强的修复能力。栗原宏幸等(2005)表明红麻对重金属镉具有很强的吸附作用，而且红麻主要收获韧皮纤维不进入食物链，因此红麻是修复镉污染农田的理想植物。
WRKY转录因子家族是高等植物体中最重要的转录因子家族之一。WRKY基因家族在植物响应镉胁迫应答中具有非常重要的作用。Os‐WRKY15是1个具有功能的核蛋白，可能通过NO、脱落酸(abscisic acid, ABA)介导的信号途径参与水稻(Oryza sativa)对Cd胁迫的抗性反应(彭喜旭等,2018)。在镉胁迫下，多年生草本植物匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)中基因WRKY23和WRKY75的表达量上调，表明WRKY23、WRKY75基因的表达受到镉胁迫的诱导(Yuan et al.,2018)。PyWRKY75的过表达显著提高了转基因杨树(Populus)对镉的吸收能力，同时增加了对镉的耐受性(Wu et al.,2022)。随着CdCl2浓度的逐渐增加，红麻植株叶片中HcWRKY71基因表达量逐渐降低(李辉等,2021)。上述研究证实，WRKY转录因子在植物响应镉胁迫过程中具有重要作用。然而，WRKY转录因子在红麻响应镉胁迫过程中的作用还未见报道。
本研究以HcWRKY71基因(即HcWRKY3-3)序列为饵序列，利用本地BLAST技术对红麻基因组进行全基因扫描以获得WRKY基因家族序列，利用qRT-PCR技术分析镉胁迫下红麻WRKY基因家族成员的表达特征，为提高红麻耐镉，富集镉的能力提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料的种植
实验材料'中红麻16号'(Hibiscus cannabinus)种子由湖南文理学院红麻育种课题组提供，选取健康、饱满的种子，用次氯酸钠消毒后播种于育苗托盘内。当红麻幼苗具有5片真叶时，选取健壮的幼苗进行水培培养，一周后对其进行CdCl2胁迫处理。将CdCl2加入水培营养液中使其最终浓度为0?50?100?150和200μmol/L。每个浓度处理设置3个生物学重复，每个重复5株幼苗。镉胁迫下，水培培养1周后，剪取每个处理组红麻植株的根、茎、叶，液氮速冻后保存于-80℃冰箱。
1.2 实验方法
1.2.1 红麻WRKY家族成员的鉴定及其命名
从国家基因组科学数据中心(https://ngdc.cncb.ac.cn/)获取红麻CDS序列和蛋白质序列(Zhang et al.,2020)，然后利用本地BLASTV2.9软件构建红麻蛋白质本地数据库，以HcWRKY71氨基酸序列为诱饵序列(李辉等,2021)，利用本地BLAST软件对蛋白质数据库进行序列比对，从而获得WRKY基因家族成员的候选序列。同时从蛋白质家族数据库在线网站https://www.ebi.ac.uk/interpro/下载WRKY基因家族的HMM文件，然后利用HM‐MER3.0软件筛选红麻WRKY基因家族候选蛋白序列。将两种方法获得的WRKY候选蛋白质序列进行比较，并手动筛选冗余序列。利用NCBI保守性结构域程序来进一步验证所获得的WRKY蛋白序列。
红麻HcWRKY家族成员的命名参照Hong等(2021)的命名规则并进行了相应的修改，规则如下：每个HcWRKY家族成员的名称都以物种名称Hibiscus cannabinus(Hc)的缩写开头；每个Hc‐WRKY家族成员的序列号是该家族成员基因所在染色体的序列号；同一染色体上每个HcWRKY家族成员的序列号由染色体号和该成员基因的物理位置号(由小到大进行排序1,2,3......)共同组成。
1.2.2 红麻HcWRKY家族成员的染色体定位及理化性质分析
利用TBTOOLS软件(Chen et al.,2020)从基因组注释文件中获得HcWRKY家族成员的位置信息，用于绘制其相应的基因座。通过专业蛋白质分析系统在线网站(http://web.expasy.org/prot‐param/)获得HcWRKY基因家族成员的理化信息，包括氨基酸数目、蛋白质分子质量、蛋白质等电点。通过亚细胞定位预测网站(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)分析HcWRKY基因家族成员的亚细胞定位。
1.2.3 红麻WRKY家族成员系统进化树的构建
从拟南芥(Arabidopsis thaliana)在线网站(https://www.Arabidopsis.org/)下载AtWRKY基因家族各成员的蛋白序列，然后利用MEGA11.0软件，采用Neighbor-joining法构建红麻和拟南芥WRKY基因家族的系统发育树。
1.2.4 镉胁迫下HcWRKY基因家族成员的表达分析
利用TRIzol法分别提取不同处理组红麻幼苗根、茎和叶的总RNA，然后利用两步法将总RNA逆转录成cDNA，并将其作为实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的模板。利用引物在线设计网站(https://ginkgo.zju.edu.cn/genome/tools/primer3/)设计qRT-PCR引物(表1)。利用实时荧光定量PCR技术对HcWRKY基因家族不同成员在不同处理组红麻根、茎、叶中的表达特征进行分析，每个反应设置3个生物学重复，Hcβ-actin为参照基因。qRT-PCR的反应体系：10μmol/L正向和反向引物各0.5μL，cD‐NA模板30ng，10×PCRMix10μL，最后用ddH2O补足20μL。两步法扩增反应程序：95℃加热2min；95℃变性15s，60℃退火30s，共45个循环；溶解曲线标准程序：95℃15s，65℃15s。基因的相对表达量采用2-ΔΔCt进行计算。
表1 实时荧光定量PCR引物序列
Hc:红麻;WRKY:WRKY基因家族;β-actin:β-肌动蛋白;下同 Hc: Hibiscus cannabinus; WRKY: WRKY gene family; The same below.
2 结果与分析
2.1 红麻HcWRKY家族成员的鉴定，理化性质及其亚细胞定位
利用BLSATP搜索本地红麻蛋白质数据库,获得38个HcWRKY基因家族成员。同时,利用HMMER软件获得了41个HcWRKY基因家族成员。人工筛选并删除冗余蛋白序列后,进一步利用NCBI保守结构域鉴定,最后获得33个Hc‐WRKY基因家族成员并命名为HcWRKY1-1~Hc?WRKY18-2。由表2可知,该基因家族氨基酸数目为87(HcWRKY9-3)~1142aa(HcWRKY17-2);蛋白质等电点为5.26(HcWRKY3-1)~10.18(Hc‐WRKY17-3);蛋白质的分子量为10.2(Hc‐WRKY9-3)~132.7kD(HcWRKY17-2)。亚细胞定位预测发现,除HcWRKY4-2位于细胞质外,其他HcWRKY家族成员均位于细胞核内。由以上结果可知,每个HcWRKY家族成员具有不同的理化性质,在红麻响应镉胁迫过程中可能具有不同的生物学功能。
表2 HcWRKY基因家族成员的基本信息
2.2 红麻HcWRKY家族成员的染色体定位
33个HcWRKY基因家族成员全部定位于12条红麻染色体上(图1)。其中，具有最多HcWRKY家族成员的染色体是6号染色体(5个)；其次是具有4个HcWRKY成员的染色体2号和7号染色体；染色体3、9、10和17分别定位了3个HcWRKYs基因；染色体1、4和18分别包含2个HcWRKYs基因，最少的是5号和8号染色体，分别定位1个Hc‐WRKY家族成员。6号染色体HcWRKY家族成员最多，在6号染色体发生HcWRKY家族成员基因的分离，以及成员基因之间的交换最多，故推测可能是遗传热点。
图1 HcWRKY家族成员在红麻12条染色体上的分布
2.3 红麻HcWRKY家族成员系统进化树分析
根据红麻33个HcWRKY家族成员和拟南芥72个AtWRKY家族成员的氨基酸序列,利用MEGA11.0构建了两个物种的系统发育树(图2)。由图2可知,WRKY家族成员分为4组,其中第Ⅰ组含有3个亚组即GroupⅠ-a?GroupⅠ-b?GroupⅠ-c,第Ⅰ组分布的WRKY家族成员最多有92个,第Ⅳ组分布的WRKY家族成员最少,仅有1个即Hc‐WRKY15-2。33个HcWRKY基因家族成员在4个组群中均有分布,其中第Ⅱ组和第Ⅳ组只分布有HcWRKY家族成员,占所有HcWRKY家族成员的30.3%,第Ⅰ组的GroupⅠ-a有11个HcWRKY家族成员,GroupⅠ-b有5个HcWRKY家族成员,GroupⅠ-c有6个HcWRKY家族成员,共占所有Hc‐WRKY家族成员的66.7%。97.2%的AtWRKY家族成员分布在第Ⅰ组,表明WRKY转录因子家族具有种属特异性,即红麻和拟南芥分属不同的种属。仍然有66.7%HcWRKY分布在第Ⅰ组,表明属于红麻和拟南芥的WRKY转录因子家族成员在其序列结构上保守性较强,可能存在相似的生物学功能。
图2 红麻和拟南芥WRKY家族成员系统进化树
2.4 红麻HcWRKY家族成员在不同器官的表达特征
利用qRT-PCR技术对HcWRKY家族成员在红麻根、茎、叶中的表达特征进行分析。由图3可知，HcWRKY1-1、HcWRKY3-1、HcWRKY3-3、HcWRKY6-1、HcWRKY6-2、HcWRKY6-3、HcWRKY8和HcWRKY10-3在不同器官中的表达量没有显著差异。由图4可知，HcWRKY1-2、HcWRKY2-3、HcWRKY2-4、Hc?WRKY6-5、HcWRKY10-1和HcWRKY17-2在根或茎中表达量下调(与叶片中相对表达量相比)；由图5可知，HcWRKY5、HcWRKY7-2、HcWRKY7-3和Hc?WRKY18-1在根和茎中表达量上调；HcWRKY2-2、HcWRKY4-1、HcWRKY6-4、HcWRKY7-1、HcWRKY7-4、HcWRKY9-1、HcWRKY9-2和HcWRKY10-2在茎中的表达量上调而在根中表达量下调(图6)。
HcWRKY2-1?HcWRKY3-2?HcWRKY4-2?Hc?WRKY9-3?HcWRKY17-1?HcWRKY17-3和Hc?WRKY18-2基因的表达量低，未能检测到。成功检测26个HcWRKY家族成员在红麻根、茎、叶中均有表达，且具有组织表达特异性，推测其在红麻响应镉胁迫的过程中可能具有不同的生物学功能。
图3 在不同器官表达量无显著差异的HcWRKY家族成员
以基因在叶片的表达量为对照。内参基因：Hcβ-actin；n=3；下同
图4 在根和茎中表达量下调的HcWRKY家族成员
*：差异显著(P＜0.05)；**：差异极显著(P＜0.01)；下同
图5 在根和茎中表达量上调的HcWRKY家族成员
图6 在茎中表达量上调，在根中表达量下调的HcWRKY家族成员
2.5 镉胁迫下红麻HcWRKY家族成员的表达特征
镉胁迫下，用qRT-PCR技术对叶片中Hc‐WRKY家族成员的表达特征进行分析，结果表明，其中24个HcWRKY家族成员表现出不同的表达特征，HcWRKY7-3、HcWRKY8基因的表达可能受到镉胁迫的抑制，在叶片中未能检测到这两个基因的表达量。
镉胁迫下，HcWRKY9-2在叶片中的表达量随着CdCl2浓度的升高逐渐升高。在CdCl2浓度为200μmol/L时，HcWRKY9-2基因的表达量最高，为对照的3.3倍。由此可知，HcWRKY9-2基因在红麻响应镉胁迫过程中可能通过正向/负向调控其下游基因的表达发挥作用(图7)。
图7 不同CdCl2浓度胁迫下HcWRKY9-2在叶片的表达特征
以0mol/LCdCl2基因表达量为对照。*：差异显著(P＜0.05)；**：差异极显著(P＜0.01)；下同
镉胁迫下，18个HcWRKY家族成员基因表现出了相似的表达特征即随着CdCl2浓度的升高，其表达水平先上升后下降(图8)。HcWRKY1-1、Hc?WRKY2-4、HcWRKY3-1、HcWRKY6-4、HcWRKY6-5和HcWRKY18-1的表达水平在CdCl2浓度为50μmol/L时达到峰值，随后下降。其中HcWRKY3-1对镉胁迫最敏感，在50μmol/L时其表达量达到峰值，为对照的7.0倍。与对照相比，HcWRKY6-4的表达相对稳定，没有检测到显著差异。在CdCl2浓度为100μmol/L时基因表达水平达到峰值，随后降低的家族成员有HcWRKY1-2、HcWRKY2-3、HcWRKY5、Hc?WRKY6-1、HcWRKY6-3、HcWRKY7-1、HcWRKY7-2、HcWRKY9-1、HcWRKY10-2和HcWRKY17-2。其中HcWRKY6-1对镉胁迫最敏感，在100μmol/L时其表达量达到峰值，为对照组的6.9倍。此外，HcWRKY7-4和HcWRKY10-3的表达水平在CdCl2浓度为150μmol/L时达到峰值。与0μmol/L时相比，除HcWRKY6-4以外，其他HcWRKY家族成员基因表达量上调且具有显著差异。由以上结果可知，这些HcWRKY家族成员基因的表达受镉胁迫诱导，在红麻响应镉胁迫过程中具有重要作用。
图8 18个HcWRKYs基因在不同CdCl2浓度胁迫下叶中的表达特征
镉胁迫下，HcWRKY2-2、HcWRKY6-2和Hc?WRKY10-1的表达量呈现先上升，后降低，然后再上升的趋势(图9)。与0μmol/L时相比，HcWRKY2-2和HcWRKY6-2的表达量相对稳定，没有显著差异。在CdCl2为50μmol/L时，HcWRKY10-1的表达量达到峰值，与对照相比差异显著。由此推测，Hc?WRKY2-2和HcWRKY6-2可能没有参与红麻响应镉胁迫过程。
图9 不同CdCl2浓度胁迫下HcWRKY2-2, HcWRKY6-2, HcWRKY10-1在叶片的表达特征
与对照相比，随着CdCl2胁迫浓度的上升，叶片中HcWRKY3-3表达量持续下降(图10)。由此可知，HcWRKY3-3对镉胁迫反应敏感，且基因的表达受到镉胁迫的抑制。
图10 不同CdCl2浓度胁迫下HcWRKY3-3在叶片的表达特征
由图11可知，镉胁迫下，红麻叶片中Hc?WRKY4-1基因的表达呈现出先下降后上升再下降的表达趋势。由此推测，该基因在红麻响应镉胁迫过程中具有重要作用。
图11 不同CdCl2浓度胁迫下HcWRKY4-1在叶片的表达特征
3 讨论
高等植物在进化过程中形成了复杂的调控网络以应对各种逆境胁迫?WRKY转录因子在调控网络中发挥着重要作用,能够参与植物体内多种生理生化过程,包括植物的生长发育?激素信号传导?环境胁迫响应等(Chen et al.,2012;Bakshi,Oelmüller,2014)。拟南芥(Eulgem et al.,2000),水稻(Oryzasativa)(Jimmy,Babu,2019),小麦(Triticumaestivum)(Hongetal.,2021),伴矿景天(S.plumbiz?incicola)(王剑超等,2023)等多种植物已经完成了WRKY转录因子家族成员的鉴定和分析。本研究利用BLAST和HMMER软件对红麻蛋白质库进行序列比对,同时结合WRKY保守功能结构域的鉴定,最后获得了33个HcWRKY家族成员。这一结果与Chen等(2022)的研究结果不同(46个WRKY家族成员)。可能是因为本研究使用了两种不同的软件鉴定取两者的交集,同时只保留了具有典型保守结构域的HcWRKY家族成员,而Chen等(2022)只使用了隐马尔可夫模型进行搜索鉴定。与同属锦葵科的棉花(Gossypium hirsutum)相比,红麻WRKY家族成员的数量明显少于棉花WRKY家族成员的数量(116个WRKY家族成员)(Douetal.,2014)。这可能是在红麻基因组序列拼装过程中丢失了部分WRKY家族成员的基因序列;也可能是红麻在进化过程中存在基因丢失现象;或者在红麻进化过程中没有出现同棉花一样的基因复制事件。红麻部分HcWRKY家族成员单独聚类在系统进化树的第Ⅱ组和第Ⅳ组,这可能是由于在进化过程中WRKY家族成员非保守性结构域序列发生歧化以适应不同的生长环境。不同的红麻HcWRKY家族成员在理化性质方面具有各自的特征,这可能是每个HcWRKY家族成员具有不同生物学功能的物质基础。
许多研究表明,WRKY转录因子在植物响应镉胁迫过程中具有重要的调控作用。例如,Gm?WRKY142通过激活下游基因的表达来提高大豆(Glycine max)镉耐受性(Caietal.,2020)。AtWRKY12通过抑制其下游植物螯合肽合酶1(phytochelatin s sysnthetase 1,PCS1)?PCS2?谷氨酰半胱氨酸合成酶1(glutamylcysteine synthetase 1,GSH1)和GSH2基因的表达来负调控拟南芥对Cd的积累(Han et al.,2019)。AtWRKY13通过激活转运蛋白(pleiotropic drug resistant 8,PDR8)的转录来提高拟南芥对Cd的耐受性(Shengetal.,2019)。本研究qRT-PCR结果表明,随着CdCl2胁迫浓度的升高,HcWRKY9-2基因的表达量逐渐升高,推测其功能是通过调控其下游基因的表达来提高红麻耐镉能力。同时随着CdCl2胁迫浓度的升高,HcWRKY3-3基因的表达量显著下降,推测其功能是通过抑制下游基因的表达来提高红麻耐镉能力。HcWRKY6-4?HcWRKY2-2和HcWRKY6-2基因的表达不受镉胁迫的影响,表明这3个基因不参与红麻镉胁迫的响应过程。
4 结论
本研究通过对红麻HcWRKY基因家族进行系统分析,共鉴定出33个红麻HcWRKY基因家族成员,且不均匀地分布在12条染色体上。镉胁迫下,HcWRKY1-1?HcWRKY1-2?HcWRKY2-3?HcWRKY2-4?HcWRKY3-1?HcWRKY5?HcWRKY6-1?HcWRKY6-3?HcWRKY6-4?HcWRKY6-5?HcWRKY7-1?Hc?WRKY7-2?HcWRKY9-1?HcWRKY9-2?HcWRKY10-2?HcWRKY17-2和HcWRKY18-1相对表达量显著上调;HcWRKY3-3和HcWRKY4-1相对表达量显著下调,表明这些基因可能在红麻响应镉胁迫过程中具有重要作用。HcWRKY6-4?HcWRKY2-2和Hc?WRKY6-2对镉胁迫反应不敏感。本研究将为进一步研究红麻HcWRKY家族成员在镉胁迫下的生物学功能提供了基础资料。
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