摘 要:本发明涉及微生物提取技术领域,尤其涉及一种利用微生物复配工业大麻高效提取大麻二酚的方法?上述提取大麻二酚的方法,将大麻植物粉碎过筛,采用低温等离子处理;产物与复合菌剂加入至水中,30?40℃发酵4?8h,灭活;然后加入无水乙醇,回流提取后过滤,合并滤液,浓缩得到浸膏;将磁性分子印迹微球加入至水中超声分散均匀,向其中加入浸膏超声处理;磁分离,采用乙醇水溶液洗涤微球;收集洗涤液上样至树脂柱,洗脱过程中,采用不同质量分数乙醇水溶液依次进行洗脱除杂并获得目标产物洗脱液;将目标产物洗脱液进行分子蒸馏法特异性吸附去除剩余四氢大麻酚,收集馏分并浓缩,结晶,洗涤,真空干燥?
技术要点
1.一种利用微生物复配工业大麻高效提取大麻二酚的方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1?将大麻植物粉碎过筛,采用低温等离子处理4?6min,等离子体功率50?80W,频率13.56MHz;产物与复合菌剂加入至水中,调节体系pH值为5?6,30?40℃发酵4?8h,高温瞬时灭活微生物;然后加入无水乙醇,回流提取1?3h,过滤得到滤渣a与滤液a;再将滤渣a加入至无水乙醇中,回流提取1?2h,过滤得到滤液b;接着将滤液a与滤液b合并,浓缩得到浸膏;
S2?将磁性分子印迹微球加入至水中超声分散均匀,向其中加入浸膏超声处理1?2min;磁分离,洗涤磁性分子印迹微球;收集洗涤液上样至AB?8树脂柱,洗脱过程中,采用质量分数为30?40%的乙醇水溶液洗脱除杂,然后采用质量分数为50?60%的乙醇水溶液洗脱获得目标产物洗脱液;
S3?将目标产物洗脱液进行分子蒸馏法特异性吸附去除剩余四氢大麻酚,收集馏分并浓缩,5?12℃采用乙醇过饱和结晶,0℃采用纯化水洗涤,真空干燥?
2.根据权利要求1所述方法,其特征在于,S1中,大麻植物?复合菌剂的质量比为10?30:0.1?1?
3.根据权利要求1所述方法,其特征在于,S1中,复合菌剂包括里氏木霉与黑曲霉;其中,里氏木霉的活菌数为3?6×108cfu/g,黑曲霉的活菌数为1?4×108cfu/g?
4.根据权利要求1所述方法,其特征在于,S1中,浸膏的50℃相对密度为1.06?1.08?
5.根据权利要求1所述方法,其特征在于,S2中,加入浸膏后超声处理的频率为40?45kHz,超声温度为30?50℃?
6.根据权利要求1所述方法,其特征在于,S2中,磁分离后采用质量分数为70?80%的乙醇水溶液洗涤磁性分子印迹微球?
7.根据权利要求1所述方法,其特征在于,S2中,磁性分子印迹微球与浸膏的质量比为5?10:20?30,磁性分子印迹微球的粒径为50?100μm?
8.根据权利要求1所述方法,其特征在于,S2中,磁性分子印迹微球采用如下步骤制取:将纳米四氧化三铁?聚乙二醇加入至水中超声分散均匀,向其中加入氯化1?丁基?3?甲基咪唑离子液体,氮气保护下搅拌5?15min,依次加入甲基丙烯酸?乙二醇二甲基丙烯酸酯?偶氮二异丁腈,50?70℃搅拌5?10h,洗涤,磁分离,真空干燥,粉碎?
9.根据权利要求8所述方法,其特征在于,纳米四氧化三铁?聚乙二醇?氯化1?丁基?3甲基咪唑离子液体?甲基丙烯酸?乙二醇二甲基丙烯酸酯?偶氮二异丁腈的质量比为20?40:1:1?5:1?5:1?3:0.5?1?
10.根据权利要求1所述方法,其特征在于,S3中,收集馏分并浓缩至50℃相对密度为1.1?1.15?
技术领域
本发明涉及微生物提取技术领域,尤其涉及一种利用微生物复配工业大麻高效提取大麻二酚的方法?
背景技术
工业大麻作为一种重要的工业原料和药用植物,其植株中富含多种生物活性成分,尤其以大麻二酚(CBD)的药理活性最为突出?CBD具有抗炎?抗焦虑?抗惊厥及神经保护等作用,且不具备神经毒性,在生物医药?功能性食品等领域展现出广阔应用前景?
然而,工业大麻中CBD的提取面临多重技术瓶颈:一方面,大麻植株中同时存在四氢大麻酚(THC)等具精神活性的酚类物质,其分离难度大;另一方面,传统提取工艺依赖石油醚?二氯甲烷等有毒有机溶剂,易造成环境污染及产品残留风险,严重制约产业可持续发展?
目前,工业大麻中CBD的提取主要采用溶剂萃取?超临界流体萃取或柱层析等技术?虽然,溶剂萃取法操作简单,但存在溶剂残留问题,且CBD在高温或极性溶剂中易氧化降解;而超临界CO2萃取虽能避免溶剂污染,但设备成本高且对THC的选择性分离效果有限;柱层析技术则依赖大孔树脂或硅胶分离,但存在分离效率低?树脂再生困难等缺陷?更为关键的是,现有工艺对大麻植物细胞壁的破坏不够彻底,导致CBD等目标成分的溶出率低,需反复多次提取,进一步增加溶剂消耗和生产成本?
近年来,生物法辅助提取技术逐渐受到关注,利用微生物发酵分解大麻植物细胞壁中的木质素和纤维素,可提高目标成分的释放效率?然而,菌种对复杂植物组织的降解能力有限,而且发酵过程中易受杂菌污染,影响产物稳定性?目前针对CBD的高效分离提取工艺仍有待突破?
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点,而提出的一种利用微生物复配工业大麻高效提取大麻二酚的方法?
一种利用微生物复配工业大麻高效提取大麻二酚的方法,包括如下步骤:
S1?将大麻植物粉碎过筛,采用低温等离子处理4?6min,等离子体功率50?80W,频率13.56MHz;产物与复合菌剂加入至水中,调节体系pH值为5?6,30?40℃发酵4?8h,高温瞬时灭活微生物;然后加入无水乙醇,回流提取1?3h,过滤得到滤渣a与滤液a;再将滤渣a加入至无水乙醇中,回流提取1?2h,过滤得到滤液b;接着将滤液a与滤液b合并,浓缩得到浸膏;
S2?将磁性分子印迹微球加入至水中超声分散均匀,向其中加入浸膏超声处理12min;磁分离,洗涤磁性分子印迹微球;收集洗涤液上样至AB?8树脂柱,洗脱过程中,采用质量分数为30?40%的乙醇水溶液洗脱除杂,然后采用质量分数为50?60%的乙醇水溶液洗脱获得目标产物洗脱液;
S3?将目标产物洗脱液进行分子蒸馏法特异性吸附去除剩余四氢大麻酚,收集馏分并浓缩,5?12℃采用乙醇过饱和结晶,0℃采用纯化水洗涤,真空干燥?
优选地,S1中,大麻植物?复合菌剂的质量比为10?30:0.1?1?
优选地,S1中,复合菌剂包括里氏木霉与黑曲霉;其中,里氏木霉的活菌数为3?6×108cfu/g,黑曲霉的活菌数为1?4×108cfu/g?
优选地,S1中,浸膏的50℃相对密度为1.06?1.08?
优选地,S2中,加入浸膏后超声处理的频率为40?45kHz,超声温度为30?50℃?
优选地,S2中,磁分离后采用质量分数为70?80%的乙醇水溶液洗涤磁性分子印迹微球?
优选地,S2中,磁性分子印迹微球的粒径为50?100μm?
优选地,S2中,磁性分子印迹微球与浸膏的质量比为5?10:20?30?
优选地,S2中,磁性分子印迹微球采用如下步骤制取:将纳米四氧化三铁?聚乙二醇加入至水中超声分散均匀,向其中加入氯化1?丁基?3?甲基咪唑离子液体,氮气保护下搅拌5?15min,依次加入甲基丙烯酸?乙二醇二甲基丙烯酸酯?偶氮二异丁腈,50?70℃搅拌5?10h,洗涤,磁分离,真空干燥,粉碎?
更优选地,纳米四氧化三铁?聚乙二醇?氯化1?丁基?3?甲基咪唑离子液体?甲基丙烯酸?乙二醇二甲基丙烯酸酯?偶氮二异丁腈的质量比为20?40:1:1?5:1?5:1?3:0.5?1?
优选地,S3中,收集馏分并浓缩至50℃相对密度为1.1?1.15?
有益效果:
本发明将大麻植物粉碎后,结合低温等离子体处理,精准调控细胞膜通透性,再配合复合菌剂进一步充分分解,促进大麻二酚(CBD)溶出,相较于传统高压均质,不仅使细胞内容物释放率显著提升,而且大麻二酚保留率高?
本发明等离子处理后配合复合菌剂作用,可显著增加磁性分子印迹微球的有效接触面积,磁性分子印迹微球预吸附有效缓解了后续AB?8层析的负荷压力,有效提高柱效,大大提高大麻二酚的分离效率,产物纯度极高,而且产品品质稳定,适用于大规模工业化生产?本发明所用磁性分子印迹微球以甲基丙烯酸为功能单体,通过离子液体增强的π?π作用特异性吸附大麻二酚,通过配合AB?8树脂进一步层析,使最终产品纯度从68%提升至98%以上?
本发明提取大麻二酚工艺,全程采用乙醇作为主要提取溶剂,并结合改进的提取工艺,经过试验发现:大麻二酚的得率?纯度均有明显提高,同时未检出四氢大麻酚成分,使产品的安全性得到了保障,利于工业化生产?
本发明可在保证高纯度的基础上显著提高大麻二酚的收率,而且提高生产过程的安全性以及提取得到的大麻二酚的安全性?本发明将大麻二酚制品用于前列腺增生的药物,经试验发现可对由丙酸睾酮所致大鼠前列腺体积增加均有抑制作用,还可提高SOD活性?降低MDA含量,本发明有较好的抑制前列腺增生效果?
附图说明
图1为采用实施例5?对比例1?2提取方法,大麻二酚提取率?产物中大麻二酚含量和四氢大麻酚含量对比图?
图1
图2为空白组?模型组?阳性对照组?实施例5组?对比例2组大鼠的前列腺体积和前列腺指数对比图?
图2
图3为空白组?模型组?阳性对照组?实施例5组?对比例2组大鼠的丙二醛含量?超氧化物歧化酶含量对比图?
图3
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说?
实施例1
一种利用微生物复配工业大麻高效提取大麻二酚的方法,包括如下步骤:
S1?将100g大麻植物粉碎过40目筛,在温度30℃采用低温等离子处理4min,等离子体功率50W,频率13.56MHz;产物与1g复合菌剂(其中,里氏木霉的活菌数为3×108cfu/g,黑曲霉的活菌数为1×108cfu/g)加入至500g水中,调节体系pH值为5?6,在温度30℃发酵4h,高温瞬时灭活微生物;然后加入800g无水乙醇,回流提取1h,过滤,得到滤渣a与滤液a;将滤渣a加入至300g无水乙醇中,回流提取1h,过滤,得到滤液b;将滤液a与滤液b合并,浓缩至相对密度(50℃)为1.06,得到浸膏;
S2?将50g磁性分子印迹微球加入至500g去离子水中超声分散均匀,向其中加入200g浸膏,超声处理1min,超声频率为40kHz,超声温度为30℃;磁分离,采用质量分数为70%的乙醇水溶液洗涤磁性分子印迹微球;收集洗涤液上样至AB?8树脂柱,洗脱过程中,采用质量分数为30%的乙醇水溶液洗脱除杂,然后采用质量分数为50%的乙醇水溶液洗脱获得目标产物洗脱液,最后采用质量分数为95%的乙醇水溶液洗脱使层析柱再生;
其中,磁性分子印迹微球采用如下步骤制取:将200g纳米四氧化三铁?10g聚乙二醇加入至400g去离子水中超声分散均匀,向其中加入10g[BMIM]Cl离子液体,氮气保护下搅拌5min,搅拌速度为5000r/min,接着依次加入10g甲基丙烯酸?10g乙二醇二甲基丙烯酸酯?5g偶氮二异丁腈,在温度50℃搅拌5h,采用乙醇洗涤2次,磁分离,真空干燥,粉碎;
S3?将目标产物洗脱液进行分子蒸馏法特异性吸附去除剩余四氢大麻酚,收集馏分并浓缩至相对密度(50℃)为1.10,在温度5℃采用乙醇过饱和结晶,在温度0℃采用纯化水洗涤,真空干燥?
实施例2
一种利用微生物复配工业大麻高效提取大麻二酚的方法,包括如下步骤:
S1?将300g大麻植物粉碎过40目筛,在温度40℃采用低温等离子处理6min,等离子体功率80W,频率13.56MHz;产物与10g复合菌剂(其中,里氏木霉的活菌数为6×108cfu/g,黑曲霉的活菌数为4×108cfu/g)加入至600g水中,调节体系pH值为5?6,在温度40℃发酵8h,高温瞬时灭活微生物;然后加入1000g无水乙醇,回流提取3h,过滤,得到滤渣a与滤液a;将滤渣a加入至500g无水乙醇中,回流提取2h,过滤,得到滤液b;将滤液a与滤液b合并,浓缩至相对密度(50℃)为1.08,得到浸膏;
S2?将100g磁性分子印迹微球加入至1000g去离子水中超声分散均匀,向其中加入300g浸膏,超声处理2min,超声频率为45kHz,超声温度为50℃;磁分离,采用质量分数为80%的乙醇水溶液洗涤磁性分子印迹微球;收集洗涤液上样至AB?8树脂柱,洗脱过程中,采用质量分数为40%的乙醇水溶液洗脱除杂,然后采用质量分数为60%的乙醇水溶液洗脱获得目标产物洗脱液,最后采用质量分数为98%的乙醇水溶液洗脱使层析柱再生;其中,磁性分子印迹微球采用如下步骤制取:将400g纳米四氧化三铁?10g聚乙二醇加入至600g去离子水中超声分散均匀,向其中加入50g[BMIM]Cl离子液体,氮气保护下搅拌15min,搅拌速度为10000r/min,接着依次加入50g甲基丙烯酸?30g乙二醇二甲基丙烯酸酯?10g偶氮二异丁腈,在温度70℃搅拌10h,采用乙醇洗涤4次,磁分离,真空干燥,粉碎;
S3?将目标产物洗脱液进行分子蒸馏法特异性吸附去除剩余四氢大麻酚,收集馏分并浓缩至相对密度(50℃)为1.15,在温度12℃采用乙醇过饱和结晶,在温度0℃采用纯化水洗涤,真空干燥?
实施例3
一种利用微生物复配工业大麻高效提取大麻二酚的方法,包括如下步骤:
S1?将150g大麻植物粉碎过40目筛,在温度37℃采用低温等离子处理5min,等离子体功率60W,频率13.56MHz;产物与7g复合菌剂(其中,里氏木霉的活菌数为4×108cfu/g,黑曲霉的活菌数为3×108cfu/g)加入至520g水中,调节体系pH值为5?6,在温度37℃发酵5h,高温瞬时灭活微生物;然后加入950g无水乙醇,回流提取1.5h,过滤,得到滤渣a与滤液a;将滤渣a加入至450g无水乙醇中,回流提取80min,过滤,得到滤液b;将滤液a与滤液b合并,浓缩至相对密度(50℃)为1.07,得到浸膏;
S2?将90g磁性分子印迹微球加入至700g去离子水中超声分散均匀,向其中加入280g浸膏,超声处理2min,超声频率为41kHz,超声温度为45℃;磁分离,采用质量分数为73%的乙醇水溶液洗涤磁性分子印迹微球;收集洗涤液上样至AB?8树脂柱,洗脱过程中,采用质量分数为37%的乙醇水溶液洗脱除杂,然后采用质量分数为52%的乙醇水溶液洗脱获得目标产物洗脱液,最后采用质量分数为97%的乙醇水溶液洗脱使层析柱再生;
其中,磁性分子印迹微球采用如下步骤制取:将250g纳米四氧化三铁?10g聚乙二醇加入至550g去离子水中超声分散均匀,向其中加入20g[BMIM]Cl离子液体,氮气保护下搅拌12min,搅拌速度为7000r/min,接着依次加入40g甲基丙烯酸?15g乙二醇二甲基丙烯酸酯?9g偶氮二异丁腈,在温度55℃搅拌9h,采用乙醇洗涤3次,磁分离,真空干燥,粉碎;
S3?将目标产物洗脱液进行分子蒸馏法特异性吸附去除剩余四氢大麻酚,收集馏分并浓缩至相对密度(50℃)为1.12,在温度10℃采用乙醇过饱和结晶,在温度0℃采用纯化水洗涤,真空干燥?
实施例4
一种利用微生物复配工业大麻高效提取大麻二酚的方法,包括如下步骤:
S1?将250g大麻植物粉碎过40目筛,在温度33℃采用低温等离子处理5min,等离子体功率70W,频率13.56MHz;产物与3g复合菌剂(其中,里氏木霉的活菌数为5×108cfu/g,黑曲霉的活菌数为2×108cfu/g)加入至580g水中,调节体系pH值为5?6,在温度33℃发酵7h,高温瞬时灭活微生物;然后加入850g无水乙醇,回流提取2.5h,过滤,得到滤渣a与滤液a;将滤渣a加入至350g无水乙醇中,回流提取100min,过滤,得到滤液b;将滤液a与滤液b合并,浓缩至相对密度(50℃)为1.07,得到浸膏;
S2?将70g磁性分子印迹微球加入至900g去离子水中超声分散均匀,向其中加入220g浸膏,超声处理2min,超声频率为43kHz,超声温度为35℃;磁分离,采用质量分数为77%的乙醇水溶液洗涤磁性分子印迹微球;收集洗涤液上样至AB?8树脂柱,洗脱过程中,采用质量分数为33%的乙醇水溶液洗脱除杂,然后采用质量分数为58%的乙醇水溶液洗脱获得目标产物洗脱液,最后采用质量分数为96%的乙醇水溶液洗脱使层析柱再生;
其中,磁性分子印迹微球采用如下步骤制取:将350g纳米四氧化三铁?10g聚乙二醇加入至450g去离子水中超声分散均匀,向其中加入40g[BMIM]Cl离子液体,氮气保护下搅拌8min,搅拌速度为9000r/min,接着依次加入20g甲基丙烯酸?25g乙二醇二甲基丙烯酸酯?7g偶氮二异丁腈,在温度65℃搅拌7h,采用乙醇洗涤3次,磁分离,真空干燥,粉碎;
S3?将目标产物洗脱液进行分子蒸馏法特异性吸附去除剩余四氢大麻酚,收集馏分并浓缩至相对密度(50℃)为1.14,在温度6℃采用乙醇过饱和结晶,在温度0℃采用纯化水洗涤,真空干燥?
实施例5
一种利用微生物复配工业大麻高效提取大麻二酚的方法,包括如下步骤:
S1?将200g大麻植物粉碎过40目筛,在温度35℃采用低温等离子处理5min,等离子体功率65W,频率13.56MHz;产物与5g复合菌剂(其中,里氏木霉的活菌数为5×108cfu/g,黑曲霉的活菌数为3×108cfu/g)加入至550g水中,调节体系pH值为5?6,在温度35℃发酵6h,高温瞬时灭活微生物;然后加入900g无水乙醇,回流提取2h,过滤,得到滤渣a与滤液a;将滤渣a加入至400g无水乙醇中,回流提取90min,过滤,得到滤液b;将滤液a与滤液b合并,浓缩至相对密度(50℃)为1.07,得到浸膏;
S2?将80g磁性分子印迹微球加入至800g去离子水中超声分散均匀,向其中加入250g浸膏,超声处理2min,超声频率为42kHz,超声温度为40℃;磁分离,采用质量分数为75%的乙醇水溶液洗涤磁性分子印迹微球;收集洗涤液上样至AB?8树脂柱,洗脱过程中,采用质量分数为35%的乙醇水溶液洗脱除杂,然后采用质量分数为55%的乙醇水溶液洗脱获得目标产物洗脱液,最后采用质量分数为97%的乙醇水溶液洗脱使层析柱再生;
其中,磁性分子印迹微球采用如下步骤制取:将300g纳米四氧化三铁?10g聚乙二醇加入至500g去离子水中超声分散均匀,向其中加入30g[BMIM]Cl离子液体,氮气保护下搅拌10min,搅拌速度为8000r/min,接着依次加入30g甲基丙烯酸?20g乙二醇二甲基丙烯酸酯?8g偶氮二异丁腈,在温度60℃搅拌8h,采用乙醇洗涤3次,磁分离,真空干燥,粉碎;
S3?将目标产物洗脱液进行分子蒸馏法特异性吸附去除剩余四氢大麻酚,收集馏分并浓缩至相对密度(50℃)为1.13,在温度8℃采用乙醇过饱和结晶,在温度0℃采用纯化水洗涤,真空干燥?
将上述所用磁性分子印迹微球分散于纯化水中,采用粒径分析仪对上述所用磁性分子印迹微球的粒径予以测定,其平均粒径为75±15μm?
采用上述所用磁性分子印迹微球对大麻二酚(CBD)吸附测试,具体如下:精准取0.01?0.02?0.05?0.10?0.15?0.20g磁性分子印迹微球,分别加入浓度为5mg/L大麻二酚乙醇溶液中,调节体系pH值至7.0,在25℃?150r/min的恒温摇床中振荡15min?待反应结束后,对体系进行磁分离,然后取上清液用液相色谱测其剩余大麻二酚的浓度?发现磁性分子印迹微球加入量达0.15g时,吸附量达到最高,达26.1mg/g;进一步提高磁性分子印迹微球加入量,但吸附量未能进一步提高?
然后采用质量分数为75%的乙醇水溶液对上述吸附并磁分离后的磁性分子印迹微球进行洗脱30min,利用液相色谱测量洗脱液中大麻二酚含量,计算磁性分子印迹微球的洗脱率,达98.35%?证实所用磁性分子印迹微球能有效对大麻二酚进行吸附和洗脱?
对比例1
一种利用微生物复配工业大麻高效提取大麻二酚的方法,包括如下步骤:
S1?将200g大麻植物粉碎过40目筛,采用常规高压均质处理工艺予以处理;产物与5g复合菌剂(其中,里氏木霉的活菌数为5×108cfu/g,黑曲霉的活菌数为3×108cfu/g)加入至550g水中,调节体系pH值为5?6,在温度35℃发酵6h,高温瞬时灭活微生物;然后加入900g无水乙醇,回流提取2h,过滤,得到滤渣a与滤液a;将滤渣a加入至400g无水乙醇中,回流提取90min,过滤,得到滤液b;将滤液a与滤液b合并,浓缩至相对密度(50℃)为1.07,得到浸膏;
S2?将80g磁性分子印迹微球加入至800g去离子水中超声分散均匀,向其中加入250g浸膏,超声处理2min,超声频率为42kHz,超声温度为40℃;磁分离,采用质量分数为75%的乙醇水溶液洗涤磁性分子印迹微球;收集洗涤液上样至AB?8树脂柱,洗脱过程中,采用质量分数为35%的乙醇水溶液洗脱除杂,然后采用质量分数为55%的乙醇水溶液洗脱获得目标产物洗脱液,最后采用质量分数为97%的乙醇水溶液洗脱使层析柱再生;
其中,磁性分子印迹微球采用如下步骤制取:将300g纳米四氧化三铁?10g聚乙二醇加入至500g去离子水中超声分散均匀,向其中加入30g[BMIM]Cl离子液体,氮气保护下搅拌10min,搅拌速度为8000r/min,接着依次加入30g甲基丙烯酸?20g乙二醇二甲基丙烯酸酯?8g偶氮二异丁腈,在温度60℃搅拌8h,采用乙醇洗涤3次,磁分离,真空干燥,粉碎;
S3?将目标产物洗脱液进行分子蒸馏法特异性吸附去除剩余四氢大麻酚,收集馏分并浓缩至相对密度(50℃)为1.13,在温度8℃采用乙醇过饱和结晶,在温度0℃采用纯化水洗涤,真空干燥?
对比例2
一种利用微生物复配工业大麻高效提取大麻二酚的方法,包括如下步骤:
S1?将200g大麻植物粉碎过40目筛,在温度35℃采用低温等离子处理5min,等离子体功率65W,频率13.56MHz;产物与5g复合菌剂(其中,里氏木霉的活菌数为5×108cfu/g,黑曲霉的活菌数为3×108cfu/g)加入至550g水中,调节体系pH值为5?6,在温度35℃发酵6h,高温瞬时灭活微生物;然后加入900g无水乙醇,回流提取2h,过滤,得到滤渣a与滤液a;将滤渣a加入至400g无水乙醇中,回流提取90min,过滤,得到滤液b;将滤液a与滤液b合并,浓缩至相对密度(50℃)为1.07,得到浸膏;
S2?将250g浸膏加入至800g去离子水中超声处理2min,超声频率为42kHz,超声温度为40℃;上样至AB?8树脂柱,洗脱过程中,采用质量分数为35%的乙醇水溶液洗脱除杂,然后采用质量分数为55%的乙醇水溶液洗脱获得目标产物洗脱液,最后采用质量分数为97%的乙醇水溶液洗脱使层析柱再生;
S3?将目标产物洗脱液进行分子蒸馏法特异性吸附去除剩余四氢大麻酚,收集馏分并浓缩至相对密度(50℃)为1.13,在温度8℃采用乙醇过饱和结晶,在温度0℃采用纯化水洗涤,真空干燥?
对大麻植物(原花叶药材)的大麻二酚含量检测,具体如下:
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈为流动相A,以水为流动相B,按A(%):B(%)=80:20进行等度洗脱;检测波长为210nm;理论板数按CBD峰计算应不低于2500;
对照品溶液的制备精密称取大麻二酚对照品,加甲醇(1:1)制成每1mL各含0.1mg的对照品溶液;
精密称取四氢大麻酚对照品,加甲醇(1:1)制成每1mL各含0.01mg的对照品溶液;
取大麻植物约1g,精密称定,加甲醇25mL,超声处理15min,过滤,再加甲醇25mL,超声处理15min,合并滤液,定容至50mL,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液;
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定;
分别采用1g大麻植物按实施例5和对比例1?2方法得到产物,同样采用液相色谱对各组产物中大麻二酚和四氢大麻酚予以测定;
统计各组大麻二酚?四氢大麻酚含量,计算各组大麻二酚提取率?
如图1所示,采用实施例5方法所得产物的大麻二酚提取率和大麻二酚含量最高,而四氢大麻酚含量最低,优于对比例1?2(P<0.05)?
鉴于实施例5和对比例1所得产物的大麻二酚含量相近,故采用实施例5和对比例2所得产物进行大鼠(雄性健康SD大鼠,SPF级,6?8周龄,体重200g±20g)试验,具体如下:大鼠适应性饲养5天,随机取6只作假手术处理为空白组,其余大鼠在无菌条件下,用异氟烷呼吸麻醉,经阴囊摘除双侧睾丸,术口开放,碘伏消毒;自由饮食,单笼饲养,恢复一周;去势第8天,将去势大鼠按体重随机分成4组,每组6只,分别为模型组?阳性对照组?实施例5组?对比例2组,分组及给药情况见表1(采用含0.1%吐温?80和0.5%羧甲基纤维素钠的水溶液作为溶媒);从去势第9天上午灌胃给药1次,给药周期为21天;给药期间模型组和实施例5组?对比例2组同时皮下注射造模剂丙酸睾酮,注射剂量为2.0mg/kg/天,溶媒为橄榄油,注射体积为1mL/kg,造模周期为21天?
表1分组及给药情况
于末次给药24h后,断颈处死大鼠,迅速取出前列腺各叶组织(腹叶和背侧叶),用滤纸吸除表面液体,剥离脂肪组织,电子天平称其湿重,计算大鼠前列腺指数?
前列腺指数=前列腺质量÷体重?
随后将其放入含有生理盐水的计量管测量体积?取同质量同部位组织用组织匀浆机做出组织匀浆,采用试剂盒分别测定组织中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量?
如图2和图3所示,模型组大鼠的前列腺体积和前列腺指数均为最大,而丙二醛含量最高?超氧化物歧化酶含量最少,表明造模成功;实施例5组大鼠的前列腺体积?前列腺指数?丙二醛含量均低于对比例2组(P<0.05),而超氧化物歧化酶含量高于对比例2组(P<0.05),但与阳性对照组缺乏显著差异(P>0.05)?
本申请人认为:这是由于本发明将大麻植物粉碎后,结合低温等离子体处理,精准调控细胞膜通透性,再配合复合菌剂进一步充分分解,促进大麻二酚(CBD)溶出,相较于传统高压均质,不仅使细胞内容物释放率显著提升,而且大麻二酚保留率高;同时,本发明等离子处理后配合复合菌剂作用,可显著增加磁性分子印迹微球的有效接触面积,磁性分子印迹微球预吸附有效缓解了后续AB?8层析的负荷压力,有效提高柱效,大大提高大麻二酚的分离效率,产物纯度极高,而且产品品质稳定,适用于大规模工业化生产?本发明所用磁性分子印迹微球以甲基丙烯酸为功能单体,通过离子液体增强的π?π作用特异性吸附大麻二酚,通过配合AB?8树脂进一步层析,使最终产品纯度从68%提升至98%以上?
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内?
文章摘自国家发明专利,一种利用微生物复配工业大麻高效提取大麻二酚的方法,发明人:闫博巍,隋月,张元野,张利国,郑楠,房郁妍,张明,常传义,申请号:202510600193.2,申请日:2025.05.12
