摘 要：试验从新疆维吾尔自治区伊犁哈萨克自治州采集的亚麻枯萎病病株上分离获得了亚麻枯萎病病菌，经菌落形态鉴定、孢子检测、ITS检测、科赫氏法则鉴定，该病原为尖孢镰刀菌。测定了亚麻枯萎病菌对亚麻种子发芽率和幼苗生长的影响，结果表明，亚麻枯萎病菌抑制亚麻种子的萌发和亚麻幼苗生长。选取12种杀菌剂对亚麻枯萎病菌进行了室内毒力测定，结果表明，EC50值最低的是98%多菌灵原药，为1.2002mg/L，其次为97%咪鲜胺原药（6.0109mg/L），最高的为97.1%嘧菌酯原药（1080.7229mg/L），而生物农药2亿CFU/mL沼泽红假单胞菌PSB-S悬浮剂的EC50值为7.3919×105CFU/mL。由此可见，多菌灵、咪鲜胺和2×108CFU/mL沼泽红假单胞菌PSB-S悬浮剂这3种杀菌剂可以作为田间防治亚麻枯萎病的备选药剂。
关键词：亚麻枯萎病；分离鉴定；杀菌剂药剂筛选
亚麻（Linum usitatissimum L.）是一种一年生草本植物，属金虎尾目亚麻科亚麻属。亚麻原产于地中海地区，目前欧亚温带多地有栽培。中国各地都有栽培，目前主要栽培产地在东北、云南、新疆等地[1]。
亚麻枯萎病是发生在亚麻上的重大病害之一，由真菌半知菌亚门瘤座孢目镰孢属的亚麻镰孢（学名：Fusarium lini Bolley）引起[2]，一般田间发病率为20%~30%，严重的田块可超过50%，主要为害幼苗、叶片、根和茎，从苗期到成株期都可受害，幼苗受害萎蔫枯死，轻的造成缺苗断行，重则成片或全田毁坏。幼株发病时多从顶部开始，叶下垂发黄，以至全株萎凋，茎基部以下有时腐烂缢缩，倒状而死。成株发病时自上部叶片开始呈黄绿色，萎凋下垂，后变成黄色以至褐色，全株干枯，但仍直立而不倒伏。病株根系腐烂，很容易从土中拔出。在田间比较潮湿的情况下，茎基部产生淡红色的粉状霉层，为病菌的分生孢子梗和分生孢子，剖开病茎，可见到维管束变成褐色[3]。
作者在新疆调查亚麻生产期间发现亚麻枯萎病发生比较严重，而且目前生产中仍是用多菌灵等杀菌剂作为种衣剂处理，苗期再喷施多菌灵等杀菌剂防治。因此，目前亚麻枯萎病防治存在药剂使用单一且使用年限较久，危害严重时防治效果不显著等问题。为了寻找亚麻枯萎病防治效率高的化学药剂及生物药剂，采集新疆亚麻枯萎病样本进行分离鉴定及室内药剂筛选，以期为亚麻枯萎病的化学防控提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
亚麻枯萎病病株采集自新疆伊犁哈萨克自治州，亚麻田间症状（见图1和图2）和文献报道的症状一样，不同发病程度植株茎部溢缩程度、茎部变褐的范围不同。
图1 亚麻田间枯萎死亡症状 图2 亚麻田间枯萎死亡症状
PDA培养基（北京索莱宝科技有限公司），供试杀菌剂原药11种：97%噁霉灵原药、93.7%百菌清原药、96%吡唑醚菌酯原药、98%咯菌腈原药、98%多菌灵原药（江西禾益化工股份有限公司），97%咪鲜胺原药（乐斯化学有限公司），97.1%嘧菌酯原药（湖南化工研究院），90%精甲霜灵原药、94.7%菌核净原药、97.2%异菌脲原药、97%甲基硫菌灵原药（自购），生物农药1种：2×108CFU/mL沼泽红假单胞菌PSB-S悬浮剂（湖南新长山农业发展股份有限公司）。本试验所用亚麻品种为中亚3号，由中国农业科学院麻类研究所提供。
1.2 试验方法
1.2.1 亚麻枯萎病菌的分离和鉴定
取采自新疆伊犁自治州的亚麻病株根部，在实验室消毒处理后（取根部组织,在70%乙醇中浸10s后，用灭菌水冲洗3次），置于PDA培养基平板培养，约3d，挑取病根部组织长出的菌丝置于新的PDA培养基平板上培养，约7d菌丝长满平板。取培养的平板，加入无菌水冲洗，显微镜下吸取单个孢子置于PDA平板中培养，如此重复3次。观察纯化后的平板的颜色和菌落形态。取纯化后的平板，加入无菌水冲洗即获得孢子悬浮液，取孢子悬浮液在显微镜下放大20倍，观察孢子形态及其大小。取纯化的平板送上海生工，用通用引物ITS1和ITS4扩增测序，测序结果拼接后用BLAST比对。将分离鉴定的亚麻枯萎病菌接种到亚麻幼苗，发病后取发病组织再按照亚麻病株分离步骤分离，观察新分离菌落形态，进行柯赫氏法则验证。
1.2.2 亚麻枯萎病菌菌丝对亚麻种子和幼苗的影响
取亚麻枯萎病菌菌丝加入无菌的PDA液体培养基中，30℃摇床100r/min，摇48h后备用。将亚麻种子100粒放入培养皿中，分别用清水和亚麻枯萎病菌孢子悬浮液（浓度为2×105个/mL）浸泡处理，每个处理重复3次，观察亚麻种子发芽情况，第3天和第7天分别统计菌液处理组和清水对照处理组的发芽率。取亚麻种子100粒直接播种到盆中，待发芽长出第一片真叶时接种亚麻枯萎病菌液（浓度为2×105个/mL），没有接种菌液的亚麻幼苗作为空白对照，每个处理播种3盆，接种30d后，每盆随机抽取30株，调查各处理的幼苗株高，并计算平均株高。
1.2.3 不同药剂对亚麻枯萎病菌室内毒力测定
采用菌丝生长速率法，测定11种杀菌剂原药和1种生物农药对亚麻枯萎病菌菌丝的抑制活性。按照每50mLPDA液体培养基计算，制作不同质量浓度梯度的含药平板，药剂质量浓度梯度见表1。每种药剂设置5个浓度梯度处理，每个处理重复3次。以加等量无菌水的不含药平板作为对照。含药平板制作方法：先将装有50mLPDA培养基的锥形瓶中样品融化并冷却至55℃左右，然后加入不同药量的杀菌剂原药母液，充分摇匀后倒入灭菌的培养皿（直径9cm）中，凝固后形成含药平板。将亚麻枯萎病菌活化后，在长满菌丝的培养皿上，用直径为1cm的打孔器打孔取新鲜菌饼，分别接种到含药及不含药平板中央，置于28℃培养箱中培养7d，待空白对照平板长满菌丝后，用十字交叉法测量各个处理的菌落直径，并计算各药剂处理的抑菌率。抑菌率=(对照菌落直径—处理菌落直径)/(对照菌落直径—1.0)×100%。根据浓度和抑制率数据，用DPS7.05软件统计求毒力回归方程和相关系数，计算有效中浓度EC50值。
表1 亚麻枯萎病病菌室内生物活性测定所用药剂的质量浓度
2 结果
2.1 亚麻枯萎病分离鉴定结果
亚麻枯萎菌经组织消毒培养，孢子纯化培养后的平板菌丝呈粉紫色，背面有粉紫色色素（图3）。
图3 亚麻枯萎菌菌落形态
将菌落测序的结果进行BLAST比对发现，分离的菌种与尖孢镰刀菌相似度为97%。取培养的孢子悬浮液，在显微镜下镜检，发现存在两种孢子（图4）：大型分生孢子为镰刀型，两头比较尖，3~5隔；小型分生孢子，卵型或肾型，无隔。
图4 亚麻枯萎病菌孢子显微镜图
将分离纯化鉴定的亚麻枯萎病菌接种到亚麻幼苗，幼苗有菌丝生长，取菌丝培养纯化，菌丝的形态菌落形态和孢子形态与2.1中初始分离的一致。
2.2 亚麻枯萎病菌对亚麻种子发芽及其幼苗生长的影响
亚麻枯萎病菌处理组第3天的亚麻种子平均发芽率为0，空白对照组亚麻种子平均发芽率为92%；处理组第7天平均发芽率56%，对照组平均发芽率为100%。由图5可见，亚麻枯萎病菌菌液处理种子可以明显抑制亚麻种子的发芽。
图5 亚麻枯萎病菌对亚麻种子发芽的影响（3 d）
亚麻发芽后接种亚麻枯萎菌菌液，30d后测量平均株高为21.3cm，空白对照组平均株高为41.6cm，菌液处理组比空白对照组株高减少了48.80%。图6可见，与空白对照组相比，亚麻枯萎病菌液处理后的亚麻幼苗株高生长明显受到抑制。
图6 亚麻枯萎病菌对亚麻幼苗生长的影响（30 d）
2.3 室内药剂筛选结果
从表2可以看出，各个浓度的杀菌剂对亚麻枯萎菌有不同程度的抑制作用，其中500mg/L的97%噁霉灵原药平均抑制率最高，达到99.17%，其次是400mg/L98%多菌灵原药，平均抑制率达到98.06%，最低的为浓度5mg/L的96%吡唑醚菌酯原药，平均抑制率为5.97%。生物农药2亿CFU/mL沼泽红假单胞菌PSB-S悬浮剂的平均抑菌率在33.75%~83.05%，高浓度的PSB-S表现出较好的抑制效果。
表2 杀菌剂对亚麻枯萎病菌室内毒力平均抑制率
注：大写字母代表差异极显著（p<0.01），小写字母代表差异显著（p<0.05）。
根据抑制率计算毒力回归方程及其EC50值，由表3结果可以看出，EC50值最低的是98%多菌灵原药，为1.2002mg/L，其次为97%咪鲜胺原药（6.0109mg/L）。最高的为97.1%嘧菌酯原药（1080.7229mg/L），而生物农药2×108CFU/mL沼泽红假单胞菌PSB-S悬浮剂的EC50值为7.3919×105CFU/mL，说明多菌灵、咪鲜胺及其2亿CFU/mL沼泽红假单胞菌PSB-S悬浮剂可以作为田间防治亚麻枯萎病的备选药剂。
表3 亚麻枯萎病菌室内抑菌毒力
3 讨论与结论
亚麻枯萎病是一种全球性病害,在全国种麻区均有不同程度发生，一般发病率为20%~30%，严重时可达50%以上，甚至绝产，严重影响亚麻产量和纤维质量，枯萎病发病率每增加1个百分点，相当于原茎产量降低0.50%，纤维降低0.66%，种子降低0.75%。该病病情发展快，并有逐年加重趋势，给亚麻生产带来较大损失。关于亚麻枯萎病菌的防治研究，以杨学等[1,3-5]报道的较多，但是国内近十年内，仅2015年杨学等[5]对亚麻枯萎病菌进行了分离鉴定，并筛选了室内和田间的药剂，其中田间应用效果最好的是枯萎灵0.3%拌种，其防治效果可以达到85%。之后国内对于亚麻枯萎病的报道都是综述性报道[7]，鲜少见研究性的报道。根据中国农药信息网查询结果显示，目前用于防治枯萎病的药剂主要集中于西瓜、茄子、辣椒，尚无针对亚麻枯萎病的农药进行登记推广应用；且已经登记用于防治枯萎病的农药主要包括噁霉灵、春雷霉素、氟啶胺、混合氨基酸铜、嘧菌酯、多菌灵等。本试验结果表明：浓度为25mg/L的98%多菌灵原药对亚麻枯萎病菌的室内抑制率就可以达到82.78%，浓度为400mg/L对亚麻枯萎病菌的抑制率达到98.06%，对比宋喜霞[7]报道的71.1%，具有显著差异。而且98%多菌灵原药抑制中浓度EC50值为11种供试化学杀菌剂中最低为1.2002mg/L，说明多菌灵对亚麻枯萎病亦有良好防效。
本研究从新疆采集的亚麻枯萎病的病株上分离获得了亚麻枯萎病病菌，经菌落形态鉴定、孢子检测、ITS测序比对、科赫氏法则鉴定病原为尖孢镰刀菌。虽然分离的菌株不是完全未接触过药剂的野生型菌株，但鉴于新疆地区还未有亚麻枯萎病病菌防治的报道，因此可以把本研究中获得了效果比较好的3种杀菌剂：多菌灵、咪鲜胺及2亿CFU/mL沼泽红假单胞菌PSB-S悬浮剂，这3种杀菌剂作为田间防治亚麻枯萎病的备选药剂。
关于病原菌属于半知菌亚门丛梗孢目镰孢属尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的一些作物枯萎病药剂筛选有很多报道，本文对比文献资料进行分析比较，试图找出防治作物枯萎病药剂的共同点和区别，为亚麻枯萎病的药剂防控应用提供数据和技术支撑。本试验结果多菌灵原药对亚麻枯萎病EC50值1.2002mg/L，与文献报道的多菌灵原药对西瓜枯萎病菌的EC50值为1.8847mg/L[8]及50%多菌灵可湿性粉剂对苦瓜枯萎病EC50值为0.3037mg/L[9]的效果相当。另外多菌灵200μg/mL时对麻疯树枯萎病菌丝的抑制率为98.49%[10]，50%多菌灵可湿性粉剂对甜瓜枯萎病防治效果也比较好[11]，表明多菌灵对作物枯萎病菌的防效都比较显著。本试验结果97%噁霉灵原药对亚麻枯萎病EC50值为261.2808mg/L，显著高于文献报道99%噁霉灵原药对苦瓜枯萎病EC50值为0.0352mg/L[9]；与30%噁霉灵水剂对金盏菊枯萎病盆栽防治效果88.09%[12]防效更差。本试验97%咪鲜胺原药对亚麻枯萎病EC50值为6.0109mg/L低于报道的450g/L咪鲜胺乳油对甜瓜枯萎病EC50为0.019mg/L[13]，可能由于剂型不同导致EC50值相差较大。本试验97.2%异菌脲原药对亚麻枯萎病EC50值为273.563mg/L，同文献报道50%异菌脲可湿性粉剂对草莓枯萎病EC50值为229.09mg/L[13]两者差异不大，但是远高于异菌脲对西瓜枯萎病的EC50值4.89336mg/L[14]。本试验97.1%嘧菌酯原药对亚麻枯萎病EC50值为1080.7229mg/L，远高于报道的草莓枯萎病60%嘧菌酯水分散粒剂的EC50值5.91mg/L[13]。本试验93.7%百菌清原药对亚麻枯萎病EC50值为57.7688mg/L，稍低于草莓枯萎病的7.5%百菌清可湿性粉剂的EC50值78.54mg/L[13]，效果均较好。本试验98%咯菌腈原药对亚麻枯萎病EC50值为233.4452mg/L，显著低于25g/L咯菌腈悬浮剂对百合枯萎病EC50值（89.294mg/L）[15]，可能制剂中存在增效剂导致的结果。根据文献报道比较结果表明：多菌灵和咪鲜胺对亚麻枯萎病和其他枯萎病的效果均比较好，本试验供试的其他药剂对亚麻枯萎病效果均低于报道的其他枯萎病，因此，亚麻枯萎病田间防控可以选用多菌灵和咪鲜胺作为备选的化学药剂。
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文章摘自：朱春晖,程菊娥,张正,等.新疆亚麻枯萎病菌分离鉴定及室内药剂筛选[J].中国麻业科学，2024，46(05)：284-290.
