摘 要: 本发明适用于植物繁殖技术领域，提供了一种促进汉麻种子无菌萌发的处理方法，包括三种方法，分别为浸种萌发、群体效应和Box?Behnken响应面法优化汉麻无菌萌发条件。本发明采用赤霉素、氯化钙、硝酸钾在室温下浸种，一方面可以使种皮溶胀，增加了种皮透性，利于外源物质的进入；另一方面提高了种子萌发率，克服了种子萌发休眠的问题。本发明确定了最适合汉麻种子无菌萌发的消毒方式，在保证种子低污染率的同时，种子无菌萌发率上有极大提高。本发明采用的无菌萌发方法保证了种子在无菌萌发过程中污染率低。本发明所用的仪器简单，操作方便，易于进行工厂化汉麻种苗生产。
权利要求书
1.一种促进汉麻种子无菌萌发的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：选取籽粒饱满、整齐一致的汉麻种子进行培养皿滤纸萌发；使用400mg/L的赤霉素、900mg/L的氯化钙和2%的硝酸钾在室温下浸种6h；完成浸种后，将30粒种子均匀摆放于铺有3层滤纸的培养皿中，然后添加适量的无菌水；最后将培养皿置于25℃的人工气候箱中进行暗培养。
2.一种促进汉麻种子无菌萌发的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：选取籽粒饱满、整齐一致的汉麻种子，用无菌水浸种5?6h；75%乙醇消毒30?60s后，用0.1%升汞消毒8min，期间过3?5次无菌水；接种10粒以上种子于1/2MS培养基。
3.一种促进汉麻种子无菌萌发的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：选取籽粒饱满未露白的汉麻种子，用无菌水浸种5?6h；用75%乙醇消毒218s后再用3%次氯酸钠消毒23min，然后用75%乙醇消毒211s后再用0.1%升汞消毒6min；消毒后用无菌水清洗3?5次；将汉麻种子接种于1/2MS培养基，每个培养基中接入10粒种子。
4.根据权利要求3所述的促进汉麻种子无菌萌发的处理方法，其特征在于，所述乙醇和次氯酸钠联合消毒期间以及乙醇和升汞联合消毒期间均用无菌水清洗。
技术领域
本发明属于植物繁殖技术领域，尤其涉及一种促进汉麻种子无菌萌发的处理方法。
背景技术
汉麻(Cannabis sativa L.)又叫火麻和线麻，是指种子、茎、叶及根部中的四氢大麻酚(Tetrahydrocannabinol,THC)含量小于0.3％的大麻。汉麻的繁殖主要包括通过种子繁殖、离体培养、茎扦插等方法。其中，汉麻无菌繁殖要优于种子繁殖、人工克隆(茎扦插)等传统方法。具有低成本高增殖率的、适应性强可扩展的和健壮的高质量的组织培养系统被证明是更具成本效益的，且能够使许多行业受益，包括园艺和谷类作物。目前利用微繁殖进行汉麻的芽体增殖、茎段再生的相关报道有很多，但实现汉麻全株再生的研究尚属空白，如何构建单细胞再生培养体系仍是一个具有挑战性的课题。离体培养已成为一种常见做法。在不久的将来，试管微繁有望成为汉麻繁殖和遗传保存的首选方法。
无菌萌发是通过组织培养技术将植物种子接种到培养基中并使其萌发，最后生长成幼苗的过程，操作培养过程中全程无菌。种子的无菌化发芽是组织培养的一项重要内容，也是组织培养和快速繁殖的第一步。如果灭菌效果不好，就会使培养基上所形成的愈伤组织在培养过程中发生感染，从而导致不能进一步分化和生长。因此，在组培过程中应尽可能地避免由于材料消毒不彻底而造成的污染。不同的消毒剂和处理时间对种子的消毒效果不同。75％乙醇、次氯酸钠和0.1％升汞都是比较常见的种子消毒剂。
影响种子萌发的因素有两个：一是内因，二是外因。其本身的条件主要有包括完整的活胚和胚胎生长所需的养分；外部条件影响因子有水、氧、适宜的温度和光照、包括浸种时间和渗透调节剂浓度等。渗透调节是一种能够调节种子生理代谢，增加种子对物质、能量的利用，从而增强种子的活力、促进种子的发芽的有效的种子诱导方法。使用不同渗透调节剂进行浸种能够更快地打破种子休眠、促进胚芽生长、缩短培育周期，从整体上提高了汉麻种子的发芽质量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进汉麻种子无菌萌发的处理方法，旨在解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种促进汉麻种子无菌萌发的处理方法，包括以下步骤：
选取籽粒饱满、整齐一致的汉麻种子进行培养皿滤纸萌发；使用400mg/L的赤霉素、900mg/L的氯化钙和2％的硝酸钾在室温下浸种6h；完成浸种后，将30粒种子均匀摆放于铺有3层滤纸的培养皿中，然后添加适量的无菌水；最后将培养皿置于25℃的人工气候箱中进行暗培养。
一种促进汉麻种子无菌萌发的处理方法，包括以下步骤：
选取籽粒饱满、整齐一致的汉麻种子，用无菌水浸种5?6h；75％乙醇消毒30?60s后，用0.1％升汞消毒8min，期间过3?5次无菌水；接种10粒以上种子于1/2MS培养基。
一种促进汉麻种子无菌萌发的处理方法，包括以下步骤：
选取籽粒饱满未露白的汉麻种子，用无菌水浸种5?6h；用75％乙醇消毒218s后再用3％次氯酸钠消毒23min，然后用75％乙醇消毒211s后再用0.1％升汞消毒6min；消毒后用无菌水清洗3?5次；将汉麻种子接种于1/2MS培养基，每个培养基中接入10粒种子。
进一步的，所述乙醇和次氯酸钠联合消毒期间以及乙醇和升汞联合消毒期间均用无菌水清洗。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明用400mg/L的赤霉素、900mg/L的氯化钙和2％的硝酸钾在室温下浸种6h，一方面可以使种皮溶胀，增加了种皮透性，利于外源物质的进入；900mg/L的氯化钙浸泡使种子的萌发率提高1.11?18.89％。2％的硝酸钾浸泡使种子萌发率提高了6.66?24.45％。另一方面，赤霉素的浸泡在提高种子萌发率方面的能力较强，种子萌发率提高了1.11?17.78％。克服了种子萌发休眠的问题。
2、本发明采用Box?Behnken响应面法优化汉麻无菌萌发条件，得到各因素对汉麻种子发芽率影响的大小为：75％乙醇消毒时间＞消毒时间＞消毒剂浓度。确定最适合汉麻种子无菌萌发的消毒方式，在保证种子低污染率的同时，种子无菌萌发率上有极大提高，种子无菌萌发率达到38.08％。
3、本发明采用的无菌萌发方法保证了种子在无菌萌发过程中污染率低，克服了在传统萌发种子因种子数目少、内生菌多，在无菌萌发过程中易污染的问题。
4、本发明所用的仪器简单，操作方便，易于进行工厂化汉麻种苗生产。
附图说明
图1为实施例2中群体效应对种子发芽势、发芽率的影响。
图2为实施例3中75％乙醇消毒时间和次氯酸钠浓度的交互作用。
图3为实施例3中75％乙醇消毒时间和次氯酸钠消毒时间的交互作用。
图4为实施例3中次氯酸钠浓度和次氯酸钠消毒时间的交互作用。
图5为实施例3中75％乙醇消毒时间和升汞浓度的交互作用。
图6为实施例3中75％乙醇消毒时间和升汞消毒时间的交互作用。
图7为实施例3中升汞浓度和升汞消毒时间的交互作用。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
本发明一个实施例提供的一种促进汉麻种子无菌萌发的处理方法，包括以下步骤：
浸种萌发：选取籽粒饱满、整齐一致的汉麻种子进行培养皿滤纸萌发；使用400mg/L的赤霉素、900mg/L的氯化钙和2％的硝酸钾在室温下浸种6h；完成浸种后，将30粒种子均匀摆放于铺有3层滤纸的培养皿中(先对滤纸、培养皿和接种用的钳子进行消毒灭菌)，然后添加适量的无菌水，使滤纸充分浸泡并保留能使种子发芽的水分；最后将培养皿置于25℃的人工气候箱中进行暗培养；
本发明一个实施例提供的一种促进汉麻种子无菌萌发的处理方法，包括以下步骤：
群体效应：选取籽粒饱满、整齐一致的汉麻种子，用无菌水浸种5?6h；75％乙醇消毒30?60s后，用0.1％升汞消毒8min，期间过3?5次无菌水；接种10粒以上种子于1/2MS培养基；
本发明一个实施例提供的一种促进汉麻种子无菌萌发的处理方法，包括以下步骤：
Box?Behnken响应面法优化：选取籽粒饱满未露白的汉麻种子，用无菌水浸种5?6h；用75％乙醇消毒218s后再用3％次氯酸钠消毒23min，然后用75％乙醇消毒211s后再用0.1％升汞消毒6min；消毒后用无菌水清洗3?5次(联合消毒期间也要过无菌水)；将汉麻种子接种于1/2MS培养基，每个培养基中接入10粒种子。
实施例1、汉麻种子的浸种萌发：
主要仪器：人工气候箱、滤纸、培养皿、镊子。
本实施例中汉麻种子的浸种萌发按照以下步骤进行：
(1)选种：选取籽粒饱满、整齐一致的汉麻种子。
(2)浸种：使用赤霉素、氯化钙、硝酸钾(见表1)在室温下浸种6h。
(3)暗培养：把浸种完毕的种子，均匀摆放30粒于铺有3层滤纸的培养皿中(先对滤纸、培养皿和接种用的钳子进行消毒灭菌)，然后添加适量的无菌水，使滤纸充分浸泡并保留能使种子发芽的水分。最后将培养皿置于25℃的人工气候箱中进行暗培养。
表1 赤霉素、氯化钙、硝酸钾浸种处理
无菌水浸种作为对照(CK)。每个品种皆13个处理，各处理均3次重复。3d后统计汉麻种子的发芽势，7d后统计发芽率。
表2 赤霉素浸种对不同品种汉麻种子的影响
表3 氯化钙浸种对不同品种汉麻种子的影响
表4 硝酸钾浸种对不同品种汉麻种子的影响
实验结果表明(见表2、表3和表4)：400mg/L的赤霉素浸泡使种子萌发率提高了1.11?17.78％。900mg/L的氯化钙浸泡使种子萌发率提高了1.11?18.89％。2％的硝酸钾浸泡使种子萌发率提高了6.66?24.45％。
实施例2、汉麻种子的无菌萌发中接种数目：
主要仪器：电磁炉、高压灭菌锅、无菌操作台、组织培养室、锥形瓶、培养皿、镊子、酒精灯、烧杯、量筒、容量瓶、移液管、玻璃棒、天平、酸度计。
本实施例中汉麻种子的浸种萌发按照以下步骤进行：
(1) 选种：选取籽粒饱满、整齐一致的汉麻种子。
(2)浸种：用无菌水浸种5?6h。
(3)消毒：75％乙醇消毒30?60s后，用0.1％升汞消毒8min，期间过3?5次无菌水。
(4)接种：接种于1/2MS培养基。(本实施例和本发明中的所有实施例中，无菌培养的培养基配制时所使用的1/2MS培养基为本领域公用的配方)。
(5)培养将接种好的培养基放置于培养室内，培养条件为25℃，暗培养。
每个处理设3个重复，每3瓶为1个重复。室温下暗培养3d后测定萌发情况，第7d测定其发芽率。
实验结果表明(见图1)：汉麻种子的发芽势、发芽率随着接种粒数的增加而上升，20粒时发芽率高达42.22％。经过单因素方差分析发现，各接种数目的种子的发芽势之间存在显著性差异，发芽率之间存在极显著差异，说明群体效应对汉麻种子发芽率具有影响，种子数目越多，种子越易发芽。10粒和15粒的发芽率分别是12.22％、13.33％，一般选择接种10粒种子，有利于种子萌发，并且方便观察。
实施例3、Box?Behnken响应面法优化汉麻无菌萌发的消毒条件：
主要仪器：电磁炉、高压灭菌锅、无菌操作台、组织培养室、锥形瓶、培养皿、镊子、酒精灯、烧杯、量筒、容量瓶、移液管、玻璃棒、天平、酸度计。
本实施例中Box?Behnken响应面法优化汉麻无菌萌发的消毒条件按照以下步骤进行：
(1)75％酒精、升汞、次氯酸钠单因素试验；
A.选种：选取籽粒饱满、整齐一致的汉麻种子。
B.浸种：用无菌水浸种5 6h。
C.消毒：选用不同消毒剂和消毒浓度及消毒时间进行消毒，消毒工作结束后，再用无菌水清洗种子3 5次。具体处理如下(如表5、表6、表7、表8、表9)。
表5 75％乙醇消毒处理
表6 次氯酸钠消毒20min处理
表7 2％次氯酸钠消毒处理
表8 升汞消毒8min处理
表9 0.1％升汞消毒处理
D.接种：将10粒汉麻种子用酒精灯加热后的镊子接种到1/2MS培养基上。本实例和本发明中的所有实施例中，无菌培养的培养基配制时所使用的1/2MS培养基为本领域公用的配方。
E.培养：培养将接种好的培养基放置于培养室内，培养条件为25℃，暗培养。
每个处理设3个重复，每3瓶为1个重复。室温(25?26℃)下暗培养7d，统计其发芽势和发芽率以及污染率。
(2) Box?Behnken响应面法优化汉麻无菌萌发条件；
A.设计Box Behnken响应面法实验：确定各因素最优水平后，再运用Design Expert13软件的Box Behnken响应面来设计优化实验，得到两个3因素3水平实验，以探究汉麻无菌萌发的最佳条件。具体实验因素与水平如下(见表10、表11)。
表10 75％乙醇、次氯酸钠消毒处理
表11 75％乙醇、升汞消毒处理
B.选种：选取籽粒饱满、整齐一致的汉麻种子。
C.浸种：用无菌水浸种5?6h。
D.消毒：利用不同消毒剂及其浓度和时间的灭菌组合进行联合消毒，消毒后用无菌水清洗3?5次。
E.接种：将10粒汉麻种子用酒精灯加热后的镊子接种到1/2MS培养基上。本实例和本发明中的所有实施例中，无菌培养的培养基配制时所使用的1/2MS培养基为本领域公用的配方。
F.培养：培养将接种好的培养基放置于培养室内，培养条件为25℃，暗培养。
每个处理设3个重复，每3瓶为1个重复。暗培养7d，统计发芽势、发芽率。
G.回归模型建立：将表12、表13中的数据录入到Design?Expert13软件中，对其进行整理并进行回归分析。在此基础上得出了两个二次回归方程a和b。并对回归模型进行方差分析及显著性检验。
表12 75％乙醇消毒时间、次氯酸钠浓度和次氯酸钠消毒时间对汉麻种子无菌萌发的影响
表13 75％乙醇消毒时间、升汞浓度和升汞消毒时间对汉麻种子无菌萌发的影响
实验结果表明(见图2至图7)：在3D响应曲面图中，所有的曲面开口都朝下，所以汉麻种子无菌萌发的发芽率具有极大值。利用Design?Expert13软件对实验数据进行分析，得到最优的消毒处理组合，使用最优的消毒处理组合对种子进行处理，得出最高的种子萌发率。即：75％乙醇消毒218s后再用3％次氯酸钠消毒23min的种子萌发率为38.08％；75％乙醇消毒211s后再用0.1％升汞消毒6min的种子萌发率为21.50％。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些均不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
文章摘自国家发明专利，一种促进汉麻种子无菌萌发的处理方法；发明人：祁宏英，徐洪国，费义莹，李文聪，张建鹏，阮金花；申请号：202410600700.8；申请日：2024.05.14。
