摘 要：本发明涉及植物提取技术领域，具体提供了一种汉麻籽多肽的制备方法及其应用。该方法包括：用碱提酸沉法制得汉麻籽蛋白；对汉麻籽蛋白进行蛋白酶酶解处理、灭酶处理，干燥，得到汉麻籽多肽；所述蛋白酶包括中性蛋白酶；所述酶解处理时，酶解的温度为50℃～65℃，pH为6.0～7.0，时间为60min～120min。与现有技术相比，本发明的方法步骤简单、成本较低，得到的汉麻籽多肽，对促进胶原蛋白分泌有显著的效果。
技术要点
1.一种汉麻籽多肽的制备方法，其特征在于，包括：用碱提酸沉法制得汉麻籽蛋白；对汉麻籽蛋白进行蛋白酶酶解处理、灭酶处理，干燥，得到汉麻籽多肽；
所述蛋白酶包括中性蛋白酶；
所述酶解处理时，酶解的温度为50℃～65℃，pH为6.0～7.0，时间为60min～120min。
2.根据权利要求1所述的汉麻籽多肽的制备方法，其特征在于，所述中性蛋白酶的用量为所述汉麻籽蛋白的8～15wt％。
3.根据权利要求1所述的汉麻籽多肽的制备方法，其特征在于，所述酶解在超声条件下进行。
4.根据权利要求3所述的汉麻籽多肽的制备方法，其特征在于，所述超声的功率为100W～300W，温度为30℃～50℃，时间为20min～40min。
5.根据权利要求1所述的汉麻籽多肽的制备方法，其特征在于，所述灭酶处理的温度为90℃～100℃，时间为15min～25min。
6.根据权利要求1所述的汉麻籽多肽的制备方法，其特征在于，所述碱提酸沉法包括以下步骤：
将汉麻籽与水混合，调节pH至9.0～9.5进行碱提处理，得到提取液；调节提取液的pH至3.5～4.0进行酸沉处理。
7.根据权利要求6所述的汉麻籽多肽的制备方法，其特征在于，所述碱提处理的温度为30℃～50℃，时间为1h～3h；
所述酸沉处理的时间为60min～90min。
8.权利要求1～7任一项所述的汉麻籽多肽的制备方法得到的汉麻籽多肽。
9.权利要求8所述的汉麻籽多肽在制备促进胶原蛋白分泌的产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述汉麻籽多肽包括分子量＜10kD的汉麻籽多肽和/或分子量＞100kD汉麻籽多肽；
所述汉麻籽多肽在产品中的浓度为50～100μg/ml。
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域，更具体地说，涉及一种汉麻籽多肽的制备方法及其应用。
背景技术
汉麻(Cannabis sativa L.)也称为火麻。汉麻籽具有较高的营养价值，含有丰富的氨基酸、不饱和脂肪酸、矿物质元素以及生物活性成分，其开发前景已经越来越受到人们的关注。汉麻全籽的蛋白质含量一般在20～25％之间，而脱壳后籽仁的蛋白质含量超过40％。汉麻种子是一种十分优异的蛋白质来源，具有很高的开发研究价值。
植物蛋白生产经济成本低，无动物养殖场地限制，不产生温室气体，伴随着世界人口增长，耕地面积减少、全球变暖等问题出现，使用植物蛋白替代动物蛋白正逐渐被越来越多的人所关注。植物蛋白常见的方法包括有机溶剂提取法、盐溶提取法、反胶束萃取法等。有机溶剂提取法主要针对不溶于水、酸液、碱液和稀盐溶液的蛋白质，因为这类蛋白质和脂质结合牢固，只溶解于乙醇、丙酮等亲脂性较强的有机溶剂，且必须在低温下进行操作以防止蛋白质变性。
植物蛋白多肽是植物蛋白在特定条件下水解后形成的一种小分子多肽。汉麻籽多肽是植物蛋白多肽的一种，目前还未有汉麻籽多肽在促进胶原蛋白分泌的相关报导。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种汉麻籽多肽的制备方法及其应用，本发明的方法步骤简单、成本较低，得到的汉麻籽多肽，对促进胶原蛋白分泌有显著的效果。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种汉麻籽多肽的制备方法，包括：用碱提酸沉法制得汉麻籽蛋白；对汉麻籽蛋白进行蛋白酶酶解处理，干燥，得到汉麻籽多肽；
所述蛋白酶包括中性蛋白酶；
所述酶解处理时，酶解的温度为50℃～65℃，pH为6.0～7.0，时间为60min～120min。
优选的，所述中性蛋白酶的用量为所述汉麻籽蛋白的8～15wt％，优选为8wt％、10wt％或15wt％。
优选的，所述酶解处理在超声条件下进行；所述超声的功率为100W～300W，温度为30℃～50℃，时间为20min～40min。
优选的，所述酶解处理包括以下步骤：将汉麻籽蛋白的水分散液与蛋白酶混合后进行酶解反应；所述汉麻籽蛋白的水分散液的制备方法包括以下步骤：将汉麻籽蛋白粉末和水混合；所述汉麻籽蛋白粉末和水的料液比为1：(6～10)g/mL。
优选的，所述汉麻籽蛋白粉末为脱脂汉麻籽蛋白粉末；所述脱脂汉麻籽蛋白粉末的制备方法包括：将汉麻籽粉末和石油醚按照1：(5～8)(g/mL)的比例混合，干燥。
优选的，所述汉麻籽蛋白粉末的细度为80目；所述汉麻籽蛋白粉末的制备方法，包括以下步骤：将汉麻籽进行粉碎过80目筛；所述汉麻籽优选为脱壳汉麻籽，更优选为干燥成熟的脱壳汉麻籽，长为4-5.5mm，直径为2.5-4mm。
优选的，所述酶解处理还包括以下步骤：对酶解后的体系进行灭酶处理。灭酶处理的温度为90℃～100℃，时间为15min～25min；
所述酶解处理还包括以下步骤：将灭酶处理后的体系进行离心处理，收集上清液得到酶解产物；灭酶处理后的离心的转速为4000r/min～8000r/min，时间为10min～20min。
优选的，所述碱提酸沉法包括以下步骤：
将汉麻籽与水混合，调节pH至9.0～9.5进行碱提处理，得到提取液；调节提取液的pH至3.5～4.0进行酸沉处理。
优选的，用氢氧化钠进行所述碱提处理；所述碱提处理的温度为30℃～50℃，时间为1h～3h。
优选的，所述碱提酸沉法还包括以下步骤：对碱提处理后的提取液进行离心处理，收集上清液；碱提处理后的离心的转速为4000r/min～8000r/min，时间为10min～20min。
优选的，酸沉处理采用加入酸溶液的方法调节pH，酸溶液优选为柠檬酸溶液；柠檬酸溶液的浓度优选为0.5mol/L～1mol/L；所述酸沉处理的时间为60min～90min；所述酸沉处理还包括以下步骤：对酸沉处理后的提取液进行离心处理，酸沉处理后的离心的转速为4000r/min～8000r/min，时间为10min～20min。
优选的，所述灭酶处理后的干燥为真空冷冻干燥；真空冷冻干燥具体为：将灭酶处理后的体系在-80℃～-60℃下预冻4h～6h，再在真空度≤40Pa下干燥处理18h～20h。
本发明还提供了上述汉麻籽多肽的制备方法得到的汉麻籽多肽。
本发明还提供了上述汉麻籽多肽在制备促进胶原蛋白分泌的产品中的应用。
优选的，所述胶原蛋白包括I型胶原蛋白。
优选的，本发明提供了汉麻籽多肽在制备促进细胞胶原蛋白分泌的产品中的应用；所述细胞包括HFF-1细胞。
优选的，所述产品的剂型包括溶液剂、洗剂、乳剂、粉剂、软膏中的一种或多种；所述产品可以应用在药物、宠物食品、宠物洗护等领域；所述药物包括外用药物；所述宠物洗护包括宠物洗发水、宠物染发剂、宠物沐浴露中的一种或多种；所述宠物食品包括宠物干粮、宠物湿粮、宠物零食中的一种或多种。
优选的，所述汉麻籽多肽包括分子量＜10kD的汉麻籽多肽和/或分子量＞100kD汉麻籽多肽。
优选的，所述分子量＜10kD的汉麻籽多肽的制备方法包括：
用碱提酸沉法制得汉麻籽蛋白；对汉麻籽蛋白进行蛋白酶酶解处理、灭酶处理，干燥，得到汉麻籽多肽；使用截留分子量为10kD的分离装置对所述汉麻籽多肽进行分离。
优选的，所述分子量＞100kD汉麻籽多肽的制备方法包括：用碱提酸沉法制得汉麻籽蛋白；对汉麻籽蛋白进行蛋白酶酶解处理、灭酶处理，干燥，得到汉麻籽多肽；使用截留分子量为100kD的分离装置对所述汉麻籽多肽进行分离。
优选的，所述汉麻籽多肽在产品中的浓度为50～100μg/ml，优选为50μg/ml或100μg/ml。
本发明的汉麻籽多肽的制备方法步骤简单、成本较低；首先用碱提酸沉法制得汉麻籽蛋白，再对汉麻籽蛋白依次进行蛋白酶酶解处理、灭酶处理，最后进行干燥，得到的汉麻籽多肽，对促进胶原蛋白分泌有显著的效果。经过本发明试验例证实，本发明的方法制得的汉麻籽多肽(分子量大于100kD与小于10kD)对HFF-1细胞的I型胶原蛋白(COL-I)分泌量呈现显著性上调的作用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步说明本发明，下面通过以下实施例进行详细说明。本发明以下实施例所用的原料均为市售商品。
本发明实施例和对比例使用的汉麻籽购买自安国市鹏硕药材行，商品名为白火麻仁；中性蛋白酶购买自南宁东恒华道生物科技有限责任公司，货号为中性蛋白酶001，酶活力为20万U/g。
实施例1
本实施例的汉麻籽多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)选择干燥成熟、呈卵圆形的脱壳汉麻籽，长4-5.5mm，直径2.5-4mm，表面为浅黄色，机械粉碎过80目筛得到粉末，在室温下将粉末和石油醚按照1:5(g/mL)的比例混合除去脂类物质，自然风干后得到脱脂粉末。
(2)将步骤(1)中的脱脂粉末和去离子水按1：20(g/mL)的比例混合，得到混合液，加入0.1mol/L的氢氧化钠，调节pH至9.0，随后，在30℃下水浴加热3h，反应结束后，在4000r/min转速下离心20min，收集上清液。
(3)将步骤(2)中得到的上清液，用0.5mol/L的柠檬酸溶液调节pH至3.5，沉淀汉麻籽蛋白，沉淀时间为60min，沉淀反应结束后，在4000r/min的转速下离心20min，收集汉麻籽蛋白。
(4)将汉麻籽蛋白和去离子水按1：6(g/mL)的比例混合得到分散液，对分散液进行超声处理，超声的功率设置为100W，超声的温度为30℃，超声的时间为40min。
(5)向超声后的分散液中加入中性蛋白酶，中性蛋白酶的加入量为汉麻籽蛋白的10wt％，调节分散液的pH至6.5，然后在50℃下酶解120min。
(6)酶解反应结束后，在90℃下水浴加热25min进行灭酶反应处理，然后在8000r/min的转速下离心10min，取上清液。
(7)分离：
a)使用截留分子量100kD规格的超滤离心管对步骤(6)中得到的上清液进行离心(3800r/min，30min)，收集分子量大于100kD的汉麻籽多肽截留液；
b)将步骤a)的透过液，用截留分子量50kD的超滤离心管进行分离处理，收集分子量在50kD～100kD的汉麻籽多肽截留液；
c)将步骤b)的透过液，用截留分子量10kD的超滤离心管进行分离处理，即可得分子量小于10kD以及10kD～50kD的汉麻籽多肽液。
(8)将步骤(7)获得的不同分子量的汉麻籽多肽液在-80℃下预冻4h，然后在真空度40Pa条件下干燥处理20h，得到汉麻籽多肽。
实施例2
本实施例参照实施例1的方法，区别仅在于，本实施例将中性蛋白酶的加入量调整为汉麻籽的8wt％。其余步骤参照实施例1进行。
实施例3
本实施例参照实施例1的方法，区别仅在于，本实施例将中性蛋白酶的加入量调整为汉麻籽的15wt％。其余步骤参照实施例1进行。
试验例不同分子量的汉麻籽多肽对HFF-1细胞的I型胶原蛋白分泌量的影响
(1)将HFF-1细胞按10000个/孔接种于96孔板，培养24h。设置空白对照组和样品组(实施例1制得的不同分子量的汉麻籽多肽，浓度分别为50μg/ml、100μg/ml)，各组各设置6个复孔。以完全培养基为稀释液，按照样品试验浓度表配制不同浓度的样品工作液，100μL/孔，空白组加等量完全培养基，培养24h后在显微镜下观察细胞形态。
(2)取孔板中的上清，通过ELISA法检测胶原含量，操作步骤如下：
A、标准品梯度稀释：用标准品&样品稀释液将标准品倍比稀释为500，250，125，62.5，0ng/mL。
B、收集细胞培养上清液到无菌离心管中，离心取上清后，适当浓度稀释作为检测样本。
C、各反应孔中加入100μL标准品工作液及检测样本(稀释1倍)，各组均设2个复孔，于37℃孵箱孵育90min。
D、弃去液体，甩干，各反应孔中加入100μL生物素标记抗体工作液至反应孔中，于37℃孵箱孵育60min。
E、弃去液体，甩干，各反应孔中加入300μL洗涤液，浸泡1-2min后甩干。重复4次。
F、各反应孔中加入100μL HRP标记链霉亲和素工作液至反应孔中，孵育30min。
通过ELISA检测各组胶原含量，根据实验结果得到标准曲线Y＝0.0006X+0.0924，R2＝0.9951(横坐标X为样品组产生的胶原含量，纵坐标Y为吸光度)，根据标准曲线的吸光度反推胶原含量，其结果如表1所示。
表1
以空白组产生的胶原含量作为对照，不同分子量的汉麻籽多肽对HFF-1细胞的I型胶原蛋白(COL-I)分泌量都有一定的促进作用。然而，相较于其他分子量区间的汉麻籽多肽；分子量大于100kD与小于10kD的汉麻籽多肽对HFF-1细胞的I型胶原蛋白(COL-I)分泌量呈现显著性上调的作用。
所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
摘自国家发明专利，发明人：麦力艳；麦名琳；陈洁；麦勇；罗美秀，申请号：CN202410588037.4，申请日：2024.05.13
