摘 要：目的 对工业大麻植株花叶和大麻加工产品中的Δ9-四氢大麻酚进行提取分离，建立Δ9-THC的液相色谱-质谱（LC-MS）定性定量检验方法和液相色谱（LC）定量检验方法。方法 样品自然晾干后经过研磨，加入甲醇提取后进样分析，采用ACQUITYUPLC®BEHC18色谱柱，液相色谱以水、乙腈进行梯度洗脱，检测波长：215nm，带宽：4.8nm。液相色谱-质谱以0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈进行梯度洗脱，电喷雾离子源、扫描方式：正离子模式，多个特征离子对进行定性分析，外标标准曲线法进行定量分析。结果 工业大麻植株花叶和大麻加工产品在液相色谱中Δ9-THC在0.001~0.1mg/mL范围内线性良好，液相色谱-质谱中在5~100ng/mL的范围内线性良好，R2均>0.999。液相色谱和液质联用检验方法的测量值相对误差均在±2%以内，精密度均<2%。结论 本文建立的方法可应用于工业大麻植株花叶和大麻加工产品中Δ9-THC的检验，可为实验室针对工业大麻植株花叶和大麻加工产品中四氢大麻酚的检验提供技术支持。
关键词:法医毒物分析；Δ9-四氢大麻酚；工业大麻；液相色谱；液相色谱-质谱
我国是大麻的重要起源地之一，不仅拥有丰富的野生资源，同时也是最早栽培利用大麻的国家，资源类型非常丰富。工业大麻是指四氢大麻酚含量低于0.3%的大麻属原植物及其提取产品。随着工业大麻产业化的快速发展，工业大麻中四氢大麻酚含量的检测技术面临着新的挑战。由于工业大麻中四氢大麻酚含量甚微，采用毒品大麻的检验方法很不适用，常出现气相色谱法与液相色谱法定量结果相互矛盾的问题，专门针对工业大麻检测技术的标准尚未建立，凸显了公安机关对工业大麻监管工作的鉴定技术滞后和管理力量比较薄弱的问题。
目前，对大麻毒品的溯源，可采用DNA分子手段对大麻的DNA分型和遗传相关信息进行研究[1,2]，主流的大麻快速检测方法有免疫胶体金法和量子点荧光免疫层析法。大麻实验室检验鉴定主要依靠气相色谱法（GC）[3,4]、气相色谱—质谱联用法（GC-MS）[5]和液相色谱法（LC）[6-9]，但由于GC分析时需要衍生化将酸性大麻素热脱羧转变为中性大麻素，分析结果通常是酸性和中性大麻素的总和，因此存在一定的局限性。由于大麻素类物质结构相似，使HPLC分析时难以准确分离所有的大麻素，因此近年来常常与质谱联用（LC-MS）[10,11]实现对大麻素类物质的精确、快速定量分析。LC-MS分析不需对样品进行衍生化处理，可同时实现对中性和酸性大麻素的准确定性定量，该项技术在大麻植物和大麻制品的检测中具有广阔的应用前景。目前暂无检验工业大麻植株花叶和大麻加工产品中的Δ9-四氢大麻酚的LC-MS定性定量检验方法和LC定量检验方法，建立该方法可切实加强工业大麻种植及其加工产业的监督管理，推进依法行政，严密防范工业用大麻流入非法制毒渠道，消除毒品危害，推动工业大麻产业健康发展具有重要意义。
1实验部分
1.1仪器和试剂
ACQUITYUPLC超高相液相色谱仪，ACQUITYUPLC-TQS超高相液相色谱质谱联用仪，色谱柱：ACQUITYUPLC®BEHC18（2.1mm×50mm，1.7μm）（美国沃特世公司），刀式研磨仪（德国莱驰）。
甲醇、乙腈（色谱纯、德国Merck公司），甲酸（色谱纯、德国Honeywell公司），纯水（由Milli-Q制备、德国Merck公司）。
1.2标准溶液的配制
1mg/mL的单一标准物质储备溶液（甲醇）：-18℃保存，有效期使用期限。0.1mg/mL的混合标准物质工作溶液：分别移取1mg/mL的单一标准物质储备溶液，用甲醇配置成0.1mg/mL的混合标准物质工作溶液，密封，-18℃避光保存，有效期6个月。1μg/mL的混合标准物质工作溶液∶移取0.1mg/mL的混合标准物质工作溶液，用甲醇配置成1μg/mL的混合标准物质工作溶液，0℃~4℃冷藏避光保存，有效期1个月。
1.3样品前处理
1.3.1选取和晾干
选取工业大麻植株顶端30cm长度内的花叶组织，置于阴凉处晾干，充分脱水后备用。
1.3.2粉碎研磨
将晾干后的植物置于刀式研磨仪内，充分研磨成细粉状，保证样本均匀性备用。
1.3.3提取
称量适量研磨后的植物样本检材，置于50mL离心管内后加入甲醇溶液，超声、振荡、离心后提取上清液，滤膜过滤至2mL进样瓶，得到样本提取液。大麻加工产品如大麻啤酒、大麻油等，直接称量或移取部分检材，置于50mL离心管内后加入甲醇溶液，同上述步骤操作。
1.3.4进样
样本提取液可直接进行进样分析。
1.4前处理方法优化
1.4.1提取液考察
分别考察了水、甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正己烷、环己烷、异丙醇、正庚烷9种不同溶剂对Δ9-THC的提取效果（图1），综合考虑基线稳定、杂质量、重复性等因素，选择甲醇作为最佳提取溶剂。
图1不同溶剂相对提取效率
1.4.2提取方式和时间考察
本研究对超声和振荡时间进行了考察，平行称取均质化后的样品，分别对超声5min、10min、15min、20min、25min、30min的提取效果进行了考察。结果显示，在超声10min后提取效率没有明显提升，最终选择超声10min。对振荡的时间进行了考察，通过比较分别振荡了10min、20min、30min、40min后的提取效果，发现振荡30min后提取效果最好，且实验偶然发现，在有阳光光照环境下振荡时，会显著降低Δ9-THC含量，怀疑是阳光直照射造成的影响，建议在避免阳光照射条件下进行振荡实验。
1.5液相色谱法和液相色谱质谱法
1.5.1色谱条件
液相色谱分析：色谱柱：ACQUITYUPLC®BEHC18(2.1mm×50mm，1.7μm)（美国沃特世公司）
流动相：A：水，B：乙腈。梯度洗脱程序：0~5min，25%A；5~6min，0%A；6~8min，0%A；8~9min，25%A；9~11min，25%A。柱温：35℃;进样体积：1μL；流速：0.3mL/min；检测波长：215nm，带宽：4.8nm。
液相色谱质谱分析：色谱柱：ACQUITYUPLC®BEHC18(2.1mm×50mm，1.7μm)（美国沃特世公司）。
流动相：A：0.1%甲酸水，B：0.1%甲酸乙腈。梯度洗脱程序：0~5min，25%A；5~6min，0%A；6~8min，0%A；8~9min，25%A；9~11min，25%A。柱温：35℃;进样体积：1μL；流速：0.3mL/min。
1.5.2质谱参数
离子源：电喷雾离子源，扫描方式：正离子模式；毛细管电压：3000V；离子源温度：150℃;去溶剂气：995L/h；去溶剂气温度：500℃;锥孔气：150L/h，碰撞气为氩气。主要化合物质谱参数如表1所示。
表1质谱参考条件
注：*定量离子
2方法学验证
2.1选择性
在选定的色谱条件下，液相色谱Δ9-THC的最佳吸收波长为215nm。液相色谱-质谱分析中采用正离子模式扫描，Δ9-THC出峰时间为2.3min，空白溶剂无色谱峰干扰。
2.2检出限、定量限和线性范围
2.2.1检出限和定量限
在液相色谱条件下，根据10倍信噪比计算，Δ9-THC方法的定量限为0.50μg/mL。在液相色谱-质谱条件下，由于工业大麻规范中要求其THC总量低于0.3%即可认定为工业大麻，因为液相色谱-质谱方法检测灵敏度高，为降低仪器污染等客观因素，根据10倍信噪比计算将Δ9-THC的检出限和定量限均定为1.0ng/mL。
2.2.2线性范围
分别配制浓度为0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.01mg/mL、0.005mg/mL、0.001mg/mL和5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL、100ng/mL的Δ9-THC标准溶液，以上样品各进行检验三次。以标准溶液峰面积平均值为Y轴，以标准溶液浓度为X轴，进行线性拟合。Δ9-THC在0.001mg/mL~0.1mg/mL的浓度范围内线性相关性良好，R2=0.99994（图2）。
图2Δ9-THC液相标准工作曲线
液相色谱-质谱中Δ9-THC在5ng/mL~100ng/mL的浓度范围内线性相关性良好，R2=0.99961（图3）。
图3 Δ9-THC液相色谱-质谱标准工作曲线
2.3准确度和稳定性
2.3.1准确度
LC-UV采用外标标准曲线法测量0.05mg/mLΔ9-THC，进样10次，含量结果准确，测量值相对误差在±2%以内（表2）。
表2 LC-UV方法准确度
LC-MS采用外标标准曲线法测量50ng/mLΔ9-THC，进样10次，含量结果准确，测量值相对误差在±2%以内（表3）。
表3 LC-MS方法准确度
2.3.2精密度和稳定性
LC-UV在不同时间用标准工作曲线测定0.05mg/mL的Δ9-THC标准溶液浓度，方法精密度良好，RSD为0.66%。
LC-MS在不同时间用标准工作曲线测定50ng/mL的Δ9-THC标准溶液浓度，方法精密度良好，RSD为1.18%。
3讨论与结论
应用本研究建立的液相色谱、液相色谱-质谱检验方法，分别对工业大麻及其加工产品中的Δ9-THC含量进行检测，两种检测方法的结果相对相差为0.06%，两种方法相互进行了验证，确保了检验结果的准确性。
目前，国内尚没有针对工业大麻植株花叶和大麻加工产品中Δ9-THC分别进行定性定量的检验标准，本研究在国内尚属首次提出，具有较好的推广应用价值，对贯彻落实国家禁毒委“关于加强工业大麻管控工作的通知”要求，严防四氢大麻酚含量高于0.3%而流入非法渠道，提升公安机关对工业大麻种植和加工的监管能力水平，具有重要的社会意义。
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文章摘自：刘悦鑫,闻武,贾群,等.UPLC和UPLC-MS/MS法检验工业大麻及其加工产品中Δ~9-四氢大麻酚[J].中国法医学杂志,2024,39(03):335-338+367.DOI:10.13618/j.issn.1001-5728.2024.03.016.
