摘  要:一种生物酶法选择性提纯制备亚麻酸的方法，属于生物化工和酶催化领域，具体涉及以一种天然来源的混合脂肪酸为基础通过水合酶的选择性催化提纯制备亚麻酸的方法。其中，所述底物包括紫苏籽油，亚麻籽油，深海鱼油，山核桃油等富含亚麻酸的天然油的任一种或多种。将脂肪酸水合酶和混合脂肪酸进行水合反应，选择合适的具有催化速度差异的水合酶，并根据催化选择性与速度的差异，实现对混合物中油酸、亚油酸的羟基化，而对亚麻酸不反应，根据反应前后基团的变化导致物性的差异，极容易将亚麻酸与羟基脂肪酸进行有效的分离以得到高纯度的亚麻酸。本发明反应条件温和，污染小，过程简易性，收率高，处理量大，副产物羟基脂肪酸具有经济价值的优势。

 

权利要求书

1.一种使用生物酶法选择性提纯制备亚麻酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：以可再生资源混合脂肪酸为提纯底物，去除其中饱和脂肪酸；S2：使用特定的水合酶作为催化剂，采用缓冲液作为溶剂，配置反应体系如下：步骤S1去除饱和脂肪酸的混合脂肪酸、特定的催化剂、表面活性剂，恒温反应器中进行水合反应；S3：反应结束得羟基脂肪酸和亚麻酸混合物，进行硅胶柱层析后即得目标产物亚麻酸和副产物羟基脂肪酸。

2.按照权利要求1所述的一种使用生物酶法选择性提纯制备亚麻酸的方法，其特征在于，S1中所述的混合脂肪酸采用各种来源的脂肪酸紫苏籽油、亚麻籽油深海鱼油，山核桃油等富含亚麻酸的天然油的任一种或多种。

3.按照权利要求1所述的一种使用生物酶法选择性提纯制备亚麻酸的方法，其特征在于，所述方法去除其中饱和脂肪酸，如采用通过尿素包合法进行处理以除去饱和脂肪酸。

4.按照权利要求1所述的一种使用生物酶法选择性提纯制备亚麻酸的方法，其特征在于，S2中特定的水合酶选自脂肪酸水合酶FAHY2、脂肪酸水合酶LfOAH、脂肪酸水合酶BbMCRA2中的一种；优选使用短双歧杆菌来源的脂肪酸水合酶BbMCRA2作为催化剂。

5.按照权利要求1所述的一种使用生物酶法选择性提纯制备亚麻酸的方法，其特征在于，S2中所述水合催化剂的用量为所述去除饱和脂肪酸的混合脂肪酸质量的1%～100％，优选10％。

6.按照权利要求1所述的一种使用生物酶法选择性提纯制备亚麻酸的方法，其特征在于，S2中反应体系在pH为5～9的缓冲液中进行，所述缓冲液为PBS,Tris-HCl，PB，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；优选的，所述缓冲液为Tris-HCl。

7.按照权利要求1所述的一种使用生物酶法选择性提纯制备亚麻酸的方法，其特征在于，S2中催化转化反应的温度为10～50℃，优选20～30℃；S2中反应时间为1～30h小时优选4-10h。

8.按照权利要求1所述的一种使用生物酶法选择性提纯制备亚麻酸的方法，其特征在于，所述反应在常压条件下进行；反应在金属浴、搅拌、填充床、摇床条件下进行，转速为100rpm～1200rpm；优选的，反应时采用恒温金属浴，转速为200rpm-800rpm。

9.按照权利要求1所述的一种使用生物酶法选择性提纯制备亚麻酸的方法，其特征在于，S3中酶促水合催化后，根据极性差异对羟基脂肪酸和亚麻酸进使用柱层析法对二者进行分离；优选地，体积比20：1的石油醚和乙醇或体积比为40:1的二氯甲烷：无水甲醇作为分离流动相。

10.按照权利要求1所述的一种使用生物酶法选择性提纯制备亚麻酸的方法，其特征在于，还包括S4：在S3柱层析后得到的亚麻酸含量较高的物相再次进行步骤S2-S3的操作，进一步纯化

 

技术领域

本发明属于生物化工和酶催化技术领域，尤其涉及一种酶法选择性催化制备高纯度亚麻酸的方法。

 

技术背景

α-亚麻酸(αLinolenicacid,ALA)作为一种重要的OMEGA-3多不饱和脂肪酸(Polyunsaturatedfattyacid，PUFA)，是n-3多不饱和脂肪酸中唯一的必需脂肪酸，除了在食品、药品和保健品领域的应用外，它还广泛应用于化妆品、生物燃料、油漆和涂料以及纺织工业等行业。国际医学和营养学界的大量基础研究、流行病学调查、动物试验及临床观察表明，α-亚麻酸具有以下多方面的生理功效，即预防心脑血管病、抑制癌症的发生和转移、抑制过敏反应和抗炎作用、抑制衰老、增强智力和保护视力等(张军林，廖贵芹，杨阳主编；方中明，阮景军，杨阳，张军林，彭玲，廖贵芹，魏倩，矍金旺编者,简明生物化学,华中师范大学出版社,2014.06,3637)。90年代以来世界许多发达国家如美国、英国、法国、日本等国家都立法规定：在指定的食品中必须添加α-亚麻酸，方可进行销售。我国人群膳食中普遍缺乏α-亚麻酸，日摄入量不足世界卫生组织推荐的一半，我国医学界与营养学界专家纷纷呼吁国家立法专项补充α-亚麻酸。ALA的纯度直接影响其在这些领域的有效性和结果。例如，达到一定水平的不饱和脂肪酸纯度对于满足治疗某些疾病的要求至关重要，其中药品的纯度直接关系到其有效性和安全性。此外，高纯度不饱和脂肪酸在确保涂料和润滑剂的质量和稳定性方面发挥着至关重要的作用。如今，绿色天然高纯度ALA面临着更高的需求。目前，已经鉴定出多种含油量大于25％、ALA含量大于50％的植物，如亚麻、紫苏和鼠尾草等。他们将是纯化ALA的理想原料。因此，以这种工业作物为基础，开发一种高效、环保的ALA纯化方法具有重要意义。目前，ALA的主要纯化方法有尿素络合(Lee et al.，2016， High-yield methods for purification of α-linolenic acid from Perilla frutescens var .japonica oil .Appl .Biol .Chem .)、银铁络合(Ge et al .，2017， Separation and purification ofα-linolenic acid from Phyllanthus em blica L .seed oil by silver iron complexation .)、分子蒸馏 (Che n et al .，2013， Purification ofα-linolenic acid by molecular distillation from Linseed oil .Sci .Technol .Food Ind .)、超临界萃取(Pan et al .，2012，Supercritical carbon dioxide extraction of the oak silkworm(Antheraea pernyi)pupal oil:process optimization and composition determination .Int .J .Mol .Sci .)、低温结晶和柱层析(Gu et al .，2009，Concentration ofα-linoleic acid of perilla oil by gradient cooling urea inclusion .Agric .Sci .China)。其中，尿素络合似乎特别适合于大规模 ω - 3PUFA富集，因为它能够使用简单的设备、经济高效的溶剂和温和的条件(室温)处理大量的材料。Lee et al . (Lee et al .，2016，High-yield methods for purification ofα-linolenic acid from Perilla frutescens var.japonica oil .Appl .Biol .Chem .)使用尿素络合在24小时内从紫苏精油中获得了81.75％的ALA纯度。古海波等人通过梯度冷却素络合优化了紫苏油中ALA的纯化条件，纯度为91.5％ (Gu et al .，2009，Concentration of α-linoleic acid of perilla oil by gradient cooling urea inclusion.Agric.Sci.China)。然而，由于在分离具有相似C＝C键数的脂肪酸时面临挑战， 这种方法无法轻易获得高纯度的ALA。多次反应导致大量的产物损失和产率降低。尽管Wang 等人(Wang et al .，2022，Urea complexation combined with rapid preparative reversed-phase liquid chromatography to separateα-linolenic acid from perilla seed oil:Purity,yield ,and oxidation stability .Ind .Crops Prod .)通过尿素络合结合快速制备反相液相色谱成功地获得了非常高的ALA纯度(99.20％)，但可扩展性仍然存在局限性。虽然尿素络合在纯化ALA方面存在局限性，但它在分离饱和和不饱和脂肪酸(SFAs 和UFAs)方面表现出优异的性能，并得到了广泛的工业应用(Liu et al .，2023，Efficient rapid fractionation of fatty acid methyl esters (FAMEs)through evaporative urea inclusion.Chemical Engineering Journal)。不同不饱和脂肪酸分离的关键和难点在于其物理性质相似，这使得该过程在工业上的产率较低，可扩展性较差。此外，一些方法的成本很高。在大多数情况下，单一分离方法很难达到纯化要求。所以，如何将生物酶法与现有成熟技术相结合，开发一种绿色、可扩展、可工业化的新型ALA净化方法是值得关注的问题。

脂肪酸水合酶是一类可以将水选择性的加在不饱和脂肪酸C＝C双键上的一类酶，种类众多。虽然脂肪酸水合酶的催化性质较为统一，但是依然存在一部分特殊的脂肪酸水合酶，它们对不同链长，不同饱和度的不饱和脂肪酸具有不同的催化特异性，根据此特异性，本发明选择合适的水合酶并严格控制反应条件如反应时间，使其催化一些自然界的脂肪酸中的油酸和亚油酸生成羟基脂肪酸，同时维持对亚麻酸的低催化效率，能够根据基团修饰导致的物理性质变化有效地分离副产物羟基脂肪酸(HFA)和主产物亚麻酸(ALA)。此外，副产品

HFAs还可以用作合成树脂、尼龙、聚氨酯、塑料、润滑剂、生物聚合物和肥皂的起始材料(Mutlu和Meier,2010，Castor oil as a renewable resource for the chemical industry.Eur.J.Lipid Sci.Technol.)。

综上，相较于传统的工业方法，生物酶法提纯亚麻酸具有反应条件温和，污染小，易放大，能耗低，过程简单等明显的优势。同时，基于生物酶法提纯亚麻酸的工艺尚未报道。

有鉴于此，特提出本发明。

 

发明内容

本发明提出了一种酶法选择性催化制备高纯度亚麻酸的方法，本方法以天然来源广泛的可再生资源不饱和脂肪酸(油酸，亚油酸和亚麻酸)为基础，找到具有反应速度差的水合酶，并且通过控制条件加大了反应能力的差别，从而实现了根据脂肪酸水合酶的催化速度差异的亚麻酸纯化，催化油酸和亚油酸生成羟基脂肪酸，同时保持对亚麻酸的低催化活性，并根据极性差异进行分离，克服传统方法中的诸多缺陷，以一种温和环保高效的方式 制备高纯度的亚麻酸。

本发明包括以下步骤：基于寻找到的具有反应速度差异的水合酶，根据现有技术利用菌体发酵或者基因工程菌构建水合酶，根据他们对不同脂肪酸的催化差异性，控制反应条件如时间来实现理想的催化效果，之后根据物性差异(亚麻酸与羟基脂肪酸的极性)来分离主产物亚麻酸和副产物羟基脂肪酸。

一种生物酶法选择性提纯制备亚麻酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：以可再生资源混合脂肪酸为提纯底物，去除其中饱和脂肪酸；

S2：使用特定的水合酶作为催化剂，采用缓冲液作为溶剂，配置反应体系如下：步骤S1去除饱和脂肪酸的混合脂肪酸、特定的催化剂、表面活性剂，恒温反应器中进行水合反应。

S3：反应结束得羟基脂肪酸和脂肪酸(亚麻酸)混合物，进行硅胶柱层析后即得目 标产物亚麻酸和副产物羟基脂肪酸。

其中，S1中所述的混合脂肪酸采用各种来源的脂肪酸紫苏籽油、亚麻籽油深海鱼 油，山核桃油等富含亚麻酸的天然油的任一种或多种。

可选的，所述方法去除其中饱和脂肪酸，如采用通过尿素包合法进行处理以除去饱和脂肪酸。

可选的，S2中还包括，对催化剂的选择和催化条件的限定，基于不同催化剂对不同脂肪酸的催化差异性，应选择合适的反应时间。

特定的水合酶选自脂肪酸水合酶FA-HY2、脂肪酸水合酶LfOAH、脂肪酸水合酶 BbMCRA2中的一种；优选使用短双歧杆菌来源的脂肪酸水合酶BbMCRA2作为催化剂。

优选地，所述水合催化剂的用量为所述去除饱和脂肪酸的混合脂肪酸质量的1‰~100％，优选10％。催化剂可以提供更多的脂肪酸底物结合位点，利于反应的进行，但是过多的催化剂会使体系粘稠度增加，不利于传质，同时也会增加成本。

在本发明实施方式中，反应体系在pH为5～9的缓冲液中进行，所述缓冲液为PBS, Tris-HCl，PB，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；优选的，所述缓冲液为 Tris-HCl。

催化转化反应的温度为10～50℃ , 优选20～30℃ , 水合反应温度过低会使反应进行过慢，过高则会影响酶的活性，在优选温度范围内催化性的选择性最好。

反应时间为1～30h小时优选4-10h。

所述反应在常压条件下进行；反应在金属浴、搅拌、填充床、摇床条件下进行，转速为100rpm～1200rpm；优选的，反应时采用恒温金属浴，转速为200rpm-800rpm。

S3中酶促水合催化后，根据极性差异对羟基脂肪酸和亚麻酸进使用柱层析法对二者进行分离；

优选地，体积比20：1的石油醚和乙醇或体积比为40:1的二氯甲烷：无水甲醇作为分离流动相。

进一步还包括S4：在S3柱层析后得到的亚麻酸含量较高的物相再次进行步骤S2- S3的操作，进一步纯化。

在本发明实施方式中，将分离后的产物(ALA)通过如上所述体系，再进行一次酶催化和极性分离法，该过程简单且容易放大，无污染，通过催化-分离交替法多次分离，更进一步提高亚麻酸的纯度。

有益效果

本发明针对现有的亚麻酸提纯工艺中存在的处理当量小，纯度和收率低，过程中存在污染，副产物多的问题，提供了一种酶促水合纯化亚麻酸的过程，以实现在温和水性条件下对亚麻酸进行提纯，创造性的使用生物酶的选择性来分离不饱和脂肪酸，其具有过程无污染，操作简便，能耗低，纯度和收率高以及副产物羟基脂肪酸同样具有经济价值(其广泛应用于树脂、化妆品、润滑油和涂料中的添加剂等的生产之中)的优点。经过两次催化可使ALA的纯度提升至94.71％，且收率维持在高收率85.34％，其纯度和收率都优于其它报道。同时，此方法的批次处理当量相较于其他报道也更大，可用于实际工业生产。

本发明提出生物酶法提纯亚麻酸的新方法，结合催化-分离交替法，经过一次催化提纯可将亚麻酸纯度提升至79％以上，经过两次提纯可将纯度提升至93％以上。

 

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1所示，为亚麻酸拆分提纯路径图。

  

图2所示，为实施例4生物酶法提纯前后亚麻酸气相色谱图。

  

 

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明所述的混合脂肪酸可以采用紫苏，亚麻，大豆等各种来源的脂肪酸。以下实施例中涉及的催化剂可以是脂肪酸水合酶中的任意一种。

实施例1

根据本发明提供的亚麻酸提纯方法，使用一般尿素包合法进行饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的分离，将不饱和脂肪酸进行酶法催化，之后进行亚麻酸和羟基脂肪酸的分离。具体步骤如下:

S1：以紫苏籽油为提纯底物，通过尿素包合法去除饱和脂肪酸。

S2：使用嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus NTV001)来源的脂肪酸水合酶 FA-HY2，通过菌株发酵制取酶体以进行催化提纯。以pH7.5的Tris-HCl溶液为缓冲液，配置反应体系如下：200mg混合脂肪酸，FA-HY2酶添加量为5％ (w/w)，0.5％ (v/v)表面活性剂吐温 20，25℃ ,800rpm恒温金属浴反应器中进行水合反应30h，定时取样，利用气相测得亚麻酸纯度。

S3：反应结束得羟基脂肪酸和脂肪酸(亚麻酸)混合物，以二氯甲烷：无水甲醇(v:v)＝40:1为展开剂进行硅胶柱层析后即得目标产物亚麻酸和副产物羟基脂肪酸。经测算，本实例中经单次纯化-分离ALA的纯度75.09％，两次纯化-分离ALA的纯 度为83.65％和收率为75.42％。

实施例2

与实施例1的不同之处在于：

S1：以亚麻籽油为提纯底物。

S2：使用梭形杆菌(Lysinibacillus fusiformis)来源的脂肪酸水合酶LfOAH；缓冲液以及 pH为：PBS缓冲液，pH为8.0，进行水合反应26h。

S3：以石油醚：无水乙醇(v:v)＝20:1为展开剂进行硅胶柱层析后即得目标产物亚麻酸和副产物羟基脂肪酸。

经测算，本实施例中经单次纯化-分离ALA的纯度84.35％，两次纯化-分离ALA的纯度为91.06％和收率为82.93％。

实施例3

与实施例1的不同之处在于：

S2：构建工程菌生产脂肪酸水合酶BbMCRA2 (Bifidobacterium breve NCIMB 702258)，表达载体为pET-28a(+)。100g混合脂肪酸，酶添加量为10％(w/w)；反应温度为25℃ , 使用搅拌桨与圆底烧瓶进行反应，转速为300rpm。

S3：使用丙酮低温冷冻结晶法后即得目标产物亚麻酸和副产物羟基脂肪酸。经测算，本实施例中经单次纯化-分离ALA的纯度77 .20％，两次纯化-分离ALA的纯度为86 .99% 和收率为84.36％。

实施例4

与实施例1的不同之处在于：

S1：以亚麻籽油为提纯底物。

S2：构建工程菌生产脂肪酸水合酶BbMCRA2 (Bifidobacterium breve NCIMB 702258)，表达载体为pET-22b(+)。100g混合脂肪酸，酶添加量为12％(w/w)；反应温度为25 ℃，使用搅拌桨与圆底烧瓶进行反应，转速为280rpm。

S3：以二氯甲烷：无水甲醇(v:v)＝40:1为展开剂进行硅胶柱层析后即得目标产物亚麻酸和副产物羟基脂肪酸。

经测算，本实施例中经单次纯化-分离ALA的纯度89.12％，两次纯化-分离ALA的纯度为94.71％和收率为85.34％。

实施例5

与实施例4的不同之处在于：

S2：使用短双歧杆菌(Bifidobacterium breve NCIMB 702258)来源的脂肪酸水合酶BbMCRA2。反应温度为22℃，转速为500rpm。

 S3：以石油醚：无水甲醇(v:v)＝25:1为展开剂进行硅胶柱层析后即得目标产物亚麻酸和副产物羟基脂肪酸。

经测算，本实施例中经单次纯化-分离ALA的纯度76.0510％， 两次纯化-分离ALA的纯度为90.44％和收率为82.06％。

通过控制时间的对照案例：

对照例1

与实施例1的不同之处在于：

S2：反应时间为8h。

经测算，本实施例中两次纯化-分离ALA的终纯度为81.36％和收率为87.39％。

对照例2

与实施例2的不同之处在于：

S2：反应时间为10h。

经测算，本实施例中两次纯化-分离ALA的终纯度为80.64％和收率为90.14％。

对照例3

与实施例3的不同之处在于：

S2：反应时间为4h。

经测算，本实施例中两次纯化-分离ALA的终纯度为86.42％和收率为93.51％。

对照例4

与实施例4的不同之处在于：

S2：反应时间为5h。

经测算，本实施例中两次纯化-分离ALA的终纯度为92.62％和收率为96.98％。

对照例5

与实施例5的不同之处在于：

S2：反应时间为7h。

经测算，本实施例中两次纯化-分离ALA的终纯度为92.05％和收率为87.20％。

通过对照例1-5，过长的时间会造成较多的脂肪酸被催化成羟基脂肪酸，降低了产物的收率，同时增加了工业生产成本；较短的时间则可能无法达到理想的纯度，无法满足对于高纯度亚麻酸的提纯要求。根据酶的催化选择性与速度的差异，通过对时间的控制可以有效提高收率，并将反应纯度维持在理想的水平。

通过改变不同来源的水合酶的对照案例：

对照例6

与实施例1的不同之处在于：

S2：使用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)来源的脂肪酸水合酶OhyA。

经测算，本实施例中ALA的终纯度为69.55％和收率为24.15％。

对照例7

与实施例1的不同之处在于：

S2：使用脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingia Meningoseptica)来源的脂肪酸水合酶Em-OAH。

经测算，本实施例中ALA的终纯度为64.09％和收率为20.42％。

通过对照例6-7，大部分的水合酶没有拆分能力，实验结果表明他们并不能有效的提升亚麻酸的纯度且收率极低(大部分亚麻酸都被催化为了羟基脂肪酸)，他们不能实现对亚麻酸的纯化和拆分，只有找到具有反应速度差的水合酶，并且通过控制条件加大其反应能力的差别，才能实现对亚麻酸的催化动力学差异的拆分。

 

文章摘自国家发明专利，发明人：聂开立，芦东，金淑铭，刘佳豪，邓利，王芳；申请号：202311737533.3；申请日：2023.12.17