摘 要：本发明公开了一种工业大麻染色体加倍的方法。本发明提供了一种工业大麻染色体加倍方法，包括如下步骤：用氨磺乐灵或以氨磺乐灵为活性成分的除草剂对工业大麻幼苗进行染色体加倍处理，培养，得到染色体加倍工业大麻，实现工业大麻染色体加倍；所述氨磺乐灵的使用浓度为35µM。本发明的实验证明，使用主要成分为氨磺乐灵的商品化Surflan处理工业大麻幼苗的生长点，操作简单并且获得工业大麻四倍体的效率较高。
技术要点
1.一种工业大麻染色体加倍方法，包括如下步骤：
用氨磺乐灵或以氨磺乐灵为活性成分的除草剂对工业大麻幼苗进行染色体加倍处理，培养，得到染色体加倍工业大麻，实现工业大麻染色体加倍；所述氨磺乐灵的使用浓度为35µM。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述染色体加倍处理的时机为在所述工业大麻幼苗生长至双子叶间的生长点漏出时；或所述染色体加倍处理的时机为工业大麻的种子播种后培养60?65小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述用氨磺乐灵或以氨磺乐灵为活性成分的除草剂对工业大麻幼苗进行染色体加倍处理为将所述氨磺乐灵或以氨磺乐为活性成分的除草剂滴加到所述工业大麻幼苗的生长点。
4.根据权利要求1?3中任一所述的方法，其特征在于：所述染色体加倍处理的次数为2次，且在同一天进行2次处理。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述2次处理的时间点为在所述工业大麻幼苗一天中细胞分裂最旺盛的两个时间点；或，所述2次处理的时间点为清晨和中午。
6.根据权利要求1?5中任一所述的方法，其特征在于：
所述染色体加倍处理为将除草剂工作液滴加到所述工业大麻幼苗的生长点，所述除草剂工作液中氨磺乐灵的含量为35µM。
7.根据权利要求1?6中任一所述的方法，其特征在于：所述染色体加倍工业大麻的染色体倍数比所述工业大麻幼苗多。
8.氨磺乐灵或以氨磺乐灵为活性成分的除草剂在工业大麻染色体加倍中的应用。
9.权利要求1?7中任一所述的方法在工业大麻多倍体育种中的应用。
技术领域
本发明涉及植物育种技术领域，具体为一种工业大麻染色体加倍的方法。
背景技术
大麻（Cannabis sativa L .subsp .sativa），是桑科植物大麻亚科大麻属，一年生草本植物。大麻干品中四氢大麻酚（THC）含量低于0.3%，即为工业大麻。工业大麻主要应用于农业种植、纺织、服装、造纸、生物能源、医药和饲料等方面。工业大麻提取物中含有活性物质，可用于抗癌、抗艾滋病、治疗神经疾病等；其天然抑菌效果，可广泛应用于抗菌功能纤维、天然防腐剂、杀菌药物及喷剂、个人清洁用品等；另外，工业大麻提取物在抗紫外线，抗氧化活性上效果显著，在化妆品领域可以起到抗紫外线、去皱、祛斑等效果。
多倍体育种是根据育种目标人为地改变植物染色体倍性进而选育新种质或新品种的育种方法。对大麻进行多倍体种质的诱导，是工业大麻种质创新及新品种选育的一种有效途径，有望提高大麻的药效价值或改良其他品质性状。目前多倍体诱导多报道使用秋水仙素，其毒性大，成本高，诱变效率低，然而，直接利用商业化除草剂诱变工业大麻幼苗为四倍体尚未见报道。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供提供一种高效工业大麻染色体加倍方法，克服现有技术中在工业大麻多倍体育种过程中处理试剂毒性大，诱导效率低等问题。
为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种工业大麻染色体加倍方法，包括如下步骤：
用氨磺乐灵或以氨磺乐灵为活性成分的除草剂对工业大麻幼苗进行染色体加倍处理，培养，得到染色体加倍工业大麻，实现工业大麻染色体加倍；所述氨磺乐灵的使用浓度为35µM。
上文所述方法中，所述染色体加倍处理的时机为在所述工业大麻幼苗生长至双子叶间的生长点漏出时；或所述染色体加倍处理的时机为工业大麻的种子播种后培养60?65小时。
上文中，所述工业大麻幼苗生长至双子叶间的生长点漏出时具体可为所述工业大麻幼苗生长至双子叶没有完全伸开（用镊子拨开可以看到生长点）或者双子叶刚伸开漏出生长点时。
上文所述方法中，所述用氨磺乐灵或以氨磺乐灵为活性成分的除草剂对工业大麻幼苗进行染色体加倍处理为将所述氨磺乐灵或以氨磺乐为活性成分的除草剂滴加到所述工业大麻幼苗的生长点。
上文以氨磺乐为活性成分的除草剂的滴加量为1滴除草剂工作液。
上文所述方法中，所述染色体加倍处理的次数为2次，且在同一天进行2次处理。
上文所述方法中，所述2次处理的时间点为在所述工业大麻幼苗一天中细胞分裂最旺盛的两个时间点；
或，所述2次处理的时间点为清晨和中午。
上文中，所述2次处理的时间点具体可为中国北方的清晨和中午。
上文中，所述2次处理的时间点具体可为中国山东潍坊的清晨和中午。
上文所述方法中，所述染色体加倍处理为将除草剂工作液滴加到所述工业大麻幼苗的生长点，所述除草剂工作液中氨磺乐灵的含量为35µM。
上文中，以氨磺乐灵为活性成分的除草剂在本发明的实施例中以除草剂Surflan 为例，配置除草剂工作液：除草剂Surflan使用助溶剂稀释158倍成工作母液，再将工作母液用无菌水稀释250倍至工作液，工作液中氨磺乐灵的含量为35 µM。
上文中，所述助溶剂可为氘代二甲亚砜。
上文所述方法中，所述染色体加倍工业大麻的染色体倍数比所述工业大麻幼苗多。
上文所述方法中，所述工业大麻幼苗是通过工业大麻种子播种培养后获得。
上述播种培养的条件为每天16h光照（光照强度为2500lx），黑暗8h，培养温度22℃，空气的相对湿度为60%的条件下培养。
第二方面，本发明提供了氨磺乐灵或以氨磺乐灵为活性成分的除草剂在工业大麻染色体加倍中的应用。
第三方面，本发明提供了第一方面所述的方法在工业大麻多倍体育种中的应用。
本发明的实验证明，使用主要成分为氨磺乐灵的商品化Surflan处理工业大麻幼苗的生长点，操作简单并且获得工业大麻四倍体的效率较高。
附图说明
图1为实施例1生长点处理后培养3周植株对比。
图1
图2为实施例1流式细胞仪检测结果：其中左图：二倍体DNA含量；右图：四倍体DNA 含量。
图2
图3为实施例1生长点处理后培养10周植株对比。
图3
图4为35µM处理的结果。
图4
图5为70µM处理的结果。
图5
图6为105µM处理的结果。
图6
图7为35µM处理1次的结果。
图7
图8为35µM处理2次的结果。
图8
图9为工业大麻处理植株时期。
图9
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下面实施例中的工业大麻HYJL?18来自潍坊市华以农业科技有限公司。
下面实施例是在山东省潍坊市2023年2月进行，北纬35°41′至37°26′，东经118°10′至120°01′。
实施例1、工业大麻染色体加倍方法一、材料和试剂的处理
1、工业大麻播种
将工业大麻种子直接播种到32孔穴盘中，穴盘中培养基质是椰土基质与蛭石1:1 混合，加少许水拌匀，做到“团不滴水，散则成沙”状态，将种子埋入基质1/2处，上部用基质填满穴盘，然后用手压实基质，有利于出苗一致。在每天16 h光照（光照强度为2500 lx），黑暗8 h，培养温度22℃，空气的相对湿度为60%的条件下培养。
2、试剂配制
商业化除草剂Surflan*A.S（Dow AgroSciences LLC，D02?083?012），有效成分为质量体积比（每加仑4磅）40.4%的氨磺乐灵（分子式为 C12H18N4O6S）。
将除草剂Surflan用助溶剂氘代二甲亚砜(Sigma?Aldrich，151874)助溶至8.75 mM，再用无菌水稀释250倍至氨磺乐灵的终浓度35 µM，得到除草剂工作液，其中氨磺乐灵的浓度为35 µM。
每1mL除草剂工作液配方：0.025 µL除草剂Surflan、3.975 µL助溶剂和996 µL的水组成。
二、除草剂Surflan加倍工业大麻染色体
氨磺乐灵处理组:待观察上述一的1培养的工业大麻幼苗破土，生长至双子叶刚刚伸开漏出生长点（如图9所示，即在播种后60小时），在大麻一天细胞分裂最旺盛的两个时间点：清晨7:00和中午13:00，分别在工业大麻幼苗生长点（两个子叶之间的连接处）用10 µL 量程移液器滴加7µL（刚好1滴）上述一的2制备的除草剂工作液，继续正常培养，正常培养条件：培养光照2500 lx，16 h，黑暗8 h，培养温度22℃，空气的相对湿度为60%；正常培养3周观察。
未处理对照组：以未滴加除草剂工作液的工业大麻作为对照。
结果如图1所示，可以看出，与未处理对照组植株相比，氨磺乐灵处理组（箭头所示）得到植株明显矮小。
三、染色体倍性鉴定
将上述二获得氨磺乐灵处理组处理后5周的矮小植株移栽在培养盆正常培养，培养条件：培养光照2500 lx，16 h，黑暗8 h，培养温度22℃，空气的相对湿度为60%；正常培养10周观察。将上述二的未处理对照组的植株也进行移栽培养，得到对照组植株。
结果如图3所示，可以看出，与对照组植株相比，氨磺乐灵组处理植株移栽后植株（图中记作四倍体）仍然矮小。
将上述移栽后培养10周的各组植株进行染色体倍性鉴定，通过流式细胞仪检测。
流式细胞仪检测方法和参数：
1、取新鲜待测样本（叶片）0.2g，置于培养皿中；
2、取CyStain UV Precise P试剂盒（Sysmex，目录号05?5002）中的细胞核裂解液500µL 加于样本周围，用锋利刀片将切碎，以充分提取出完整的细胞核，提取时间60秒；
3、将培养皿中的液体用50µm celltrics滤网过滤至样品管中；
4、向样品管中加入CyStain UV Precise P试剂盒中的DAPI荧光染液2000µL，避光染色2分钟；
5、上机测试。
检测仪器：Sysmex Partec品牌的CyFlow Space流式细胞仪。
实验原理是：首先游离细胞核，然后用荧光染液将细胞核染色体上的碱基染色，再用仪器检测细胞核里被染色的碱基发出的荧光强度，结果的横坐标是荧光强度，纵坐标是细胞数量。荧光强度与DNA含量成正比，所以可计算得出样本不同的倍性。
横坐标信号值在400的为四倍体植株，横坐标信号值在200的为二倍体植株。
结果如图2所示，左图为对照组，其为二倍体DNA含量；右图为氨磺乐灵组处理组，其为四倍体DNA含量，可以看出，氨磺乐灵组移栽后的植株为四倍体植株，未处理对照组移栽后的植株为二倍体植株。
本实验共处理24株工业大麻，获得四倍体的工业大麻为3株，成功率为12.5%。
实施例2、工业大麻染色体加倍方法的条件摸索
一、除草剂工作液浓度摸索
1、材料和试剂的处理
与实施例1的方法相同，不同的仅为将实施例1的一的2中除草剂Surflan用助溶剂助溶至8.75mM，再用无菌水稀释至氨磺乐灵的终浓度分别为35µM、75µM和105µM，作为除草剂工作液。
2、除草剂Surflan加倍工业大麻染色体
按照实施例1的二的方法，仅在清晨7:00滴加1下不同浓度的除草剂工作液1次。
移栽后正常培养10周观察。
结果如图4?6和表1所示，可以看出，35µM致死率低。
表1为不同浓度除草剂工作液组
二、除草剂工作液处理次数摸索
与实施例1的方法基本相同，不同的仅为按照实施例1的二的方法，仅在清晨7:00 滴加35 µM除草剂工作液1次。以按照实施例1的二的方法滴加2次35 µM除草剂工作液作为对比。
移栽后正常培养10周观察。
结果如图7?8和表2所示，可以看出，35 µM处理2次，四倍体成功率明显提高。
表2为除草剂工作液不同处理次数
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
文章摘自国家发明专利，一种工业大麻染色体加倍的方法，发明人：王亮，孙希禄，王喜萍，张婷，申请号：202411119803.9，申请日：2024.08.15
