摘 要：本发明属于基因工程和纺织科学领域，具体涉及一种碱性漆酶及其在苎麻脱胶中的应用。本发明通过定点突变将来自嗜热嗜碱卡式杆菌的野生型碱性漆酶(氨基酸序列如SEQIDNO:1所示)的第190位甘氨酸突变为脯氨酸、第254位谷氨酰胺酸突变为酪氨酸、第336位甘氨突变为蛋氨酸、第510位天冬氨酸突变为苯丙氨酸，将突变后的目的基因嵌入表达质粒，转入宿主细胞，经表达纯化得到氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的突变型碱性漆酶。与野生型碱性漆酶相比，突变型碱性漆酶具有相似的最适温度、最适pΗ和更高的热稳定性，可与木聚糖酶和果胶酶复配用于碱性中温环境下的苎麻脱胶工艺，实现显著降低苎麻的残胶率，为苎麻脱胶工业复配酶制剂需求提供了一种新选择。
权利要求书
1.一种碱性漆酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
2.编码权利要求1所述碱性漆酶的基因。
3.如权利要求2所述基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
4.一种包含如权利要求2所述基因的重组载体或重组菌株。
5.如权利要求4所述的重组载体或重组菌株，其特征在于，所述重组载体的表达载体包括pET28a。
6.如权利要求4所述的重组载体或重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的宿主包括大肠杆菌BL21(ED3)。
7.如权利要求1所述碱性漆酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：构建权利要求4或5所述重组表达载体并转化至宿主细胞，获得重组表达菌株，对所述重组表达菌株进行培养、诱导表达、分离纯化，得到所述碱性漆酶。
8.如权利要求7所述制备方法，其特征在于，构建所述重组表达载体包括如下步骤：
(1)筛选得到氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的碱性漆酶，合成对应的核苷酸序列并连接至表达载体，获得重组质粒，所述核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；
(2)以所述重组质粒为模板，设计突变引物，进行重叠延伸PCR扩增反应，获得所述重组表达载体。
9.如权利要求1～8所述碱性漆酶在苎麻脱胶中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述碱性漆酶用于苎麻脱胶的温度为50℃～70℃，pH为6～10。
技术领域
本发明涉及基因工程和纺织科学领域，特别是涉及一种碱性漆酶及其在苎麻脱胶中的应用。
背景技术
苎麻是一种重要的工业纤维作物，种植历史悠久，苎麻单纤维的长度、细度和强度等一适应纺纱要求，但纤维在原麻中被胶质粘连在一起，需进行苎麻脱胶。苎麻脱胶是指将苎麻原麻脱去胶质制取苎麻纤维，是苎麻纤维加工的关键工序，脱胶效果直接影响麻纤维质量和制成率。传统的苎麻脱胶生产基本上是以烧碱为主的化学脱胶工艺，但其存在脱胶流程长、工序繁琐、劳动强度大、能耗大、环境污染等缺点。同时由于使用强酸、强碱、高温高压煮练等苛性条件，致使部分纤维素纤维分子链断裂、结晶度增高，造成精干麻制成率低、刚性强、织物手感粗糙等问题。
苎麻原料的主要组成为纤维素，其胶质主要包括果胶、半纤维素和木质素，因此可以采用采用酶法进行脱胶，而目前主要采用果胶酶、木聚糖酶或甘露聚糖酶进行酶法脱胶。由于果胶、半纤维素和木质素在无空间阻碍时，依靠游离的羟基、羧基进行物质结合、氢键连接或化学键结合，使胶质分子之间相互连接，形成更复杂的聚合体。当用单种酶进行脱胶时，由于胶质复合体形成的网络体系，酶分子很难渗透到胶质内部与其中的胶质作用，一部分胶质大分子虽被相应的酶所降解，但由于这些片断与其他大分子连接在一起而不能从胶质体系中游离出来。因此采用多种酶复配进行联合脱胶时，去除胶质的效果优于他们单独进行脱胶的总和。
碱性漆酶(Laccase)是一类含铜的多酚氧化酶，木质素分子结构中含有的酚羟基可通过碱性漆酶催化氧化而形成自由基，进而引发木质素的降解。碱性漆酶可以高效专一地催化木质素氧化分解，且其只产生水一种副产物，并且碱性漆酶可将酚式羟基转化成苯氧自由基，引发自由基反应，从而起到对苎麻本身的色素进行脱色，减少漂白剂的用量，因此碱性漆酶成为苎麻脱胶复配酶的考量之一。苎麻脱胶是在碱性中温环境下进行的，而目前被发现的碱性漆酶主要用于在纺织中脱色、降解秸秆中的木质素等方面，且大多数仅满足碱性或高温一个环境，同时满足碱性、中温以上环境的碱性漆酶数量微乎其微，且碱性中温碱性漆酶在降解苎麻的木质素中的应用尚未见报道。
基于此，本发明通过酶挖掘与改造技术获得一种热稳定性强的碱性中温漆酶，并将其用于苎麻脱胶工业降解苎麻的木质素，为苎麻脱胶工业复配酶制剂需求提供一种选择。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种碱性漆酶，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
本发明提供的碱性漆酶的最适温度为65℃，最适pH为7.5，能够在pH6.0～10.0范围内保持稳定，与对应的野生型碱性漆酶相比，本发明的碱性漆酶提升了近20％的热稳定性，并且具有更优的辅助苎麻脱胶作用，可通过与木聚糖酶和果胶酶复配，实现显著降低苎麻的残胶率，为苎麻脱胶工业复配酶制剂需求提供了一种新选择。
进一步，编码所述碱性漆酶的基因。
进一步，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
进一步，包含所述基因的重组载体或重组菌株。
进一步，所述重组载体的表达载体包括pET28a。
进一步，所述重组菌株的宿主包括大肠杆菌BL21(ED3)。
进一步，所述碱性漆酶的制备方法包括如下步骤：构建权利要求4或5所述重组表达载体并转化至宿主细胞，获得重组表达菌株，对所述重组表达菌株进行培养、诱导表达、分离纯化，得到所述碱性漆酶。
进一步，构建所述重组表达载体包括如下步骤：
(1)筛选得到氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的碱性漆酶，合成对应的核苷酸序列并连接至表达载体，获得重组质粒，所述核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；
(2)以所述重组质粒为模板，设计突变引物，进行重叠延伸PCR扩增反应，获得所述重组表达载体。
本发明还提供所述碱性漆酶在苎麻脱胶中的应用。
进一步，所述碱性漆酶用于苎麻脱胶的温度为50℃～70℃，pH为6～10。
图1为本发明的野生型碱性漆酶及突变型碱性漆酶的SDS?PAGE分析；其中，泳道M为分子量Marker，泳道1为纯化后的野生型碱性漆酶LacCT，泳道2为纯化后的突变型碱性漆酶LacCT?G190P?Q254Y?G336M?D510F。
图1
图2为本发明野生型碱性漆酶与突变型碱性漆酶的最适温度图。
图2
图3为本发明野生型碱性漆酶与突变型碱性漆酶的最适pH图。
图3
图4为本发明野生型碱性漆酶与突变型碱性漆酶的温度稳定性图。
图4
图5为本发明野生型碱性漆酶与突变型碱性漆酶的pH稳定性图。
图5
具体实施方式
如图1至图6所示，本发明包括制备罐1、升降气缸3、密封盖5、搅拌组件6、托盘8和振动组件，下面结合附图对本发明进行详细描述。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。其中，采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示碱性漆酶中突变的氨基酸，如“AxxB”表示第xx位的氨基酸由野生型酶的氨基酸A替换成氨基酸B，位置的编号对应SEQ ID No:1中野生型碱性漆酶的氨基酸序列编号。
为了获得一种新的热稳定性较强的碱性中温漆酶，使其用于苎麻脱胶工业以降解苎麻中的木质素，为苎麻脱胶工业复配酶制剂需求提供一种选择，发明人进行了以下酶挖掘和改造过程：
(1)以来源于极端环境且酶学性质为耐高温耐碱性的碱性漆酶CtLac(AVD69558.1)为探针序列在NCBI数据库中进行Blastp，收集序列相似性在40％～80％范围内的候选序列，共1254条，通过分子进化遗传学分析对以上候选序列进行系统发育分析并绘制系统发育树。
(2)根据系统发育树，在探针序列临近分支上的候选序列中筛选来源于极端环境并具有碱性漆酶保守结构域的候选序列。
(3)制备步骤(2)筛选的候选序列对应的酶并分析其酶学性质，获得一条候选序列LacCT(NCBI Reference Sequence登录号：WP_007502612.1)，其与探针序列CtLac的序列相似性为64.47％。
其中，所述氨基酸序列对应的酶的制备及其酶学性质分析过程如下：根据所述氨基酸序列，合成对应的核苷酸序列，将所述核苷酸序列连接至表达载体，获得重组质粒并转化到宿主细胞中，获得重组菌株并进行种子培养、发酵培养、诱导表达和分离纯化，获得纯度较高的重组蛋白；检测重组蛋白的酶活、最适pH、最适温度、pH稳定性和热稳定性，筛选嗜热耐碱的重组蛋白。
(4)对候选序列LacCT进行密码子优化，全基因合成获得优化后的LacCT序列即碱性漆酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。
(5)利用AlphaFold2从头计算获得LacCT序列的预测模型，利用Fireprot服务器基于能量计算和基于序列进化预测热稳定性提高的突变位点，在排除活性中心附近的位点后，获得38个突变位点。
基于上述理论分析，发明人根据探针酶筛选获得了氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型碱性漆酶LacCT，然后对该野生型碱性漆酶进行结构预测，获得38个的可能提升酶的热稳定性的突变位点。
对38个突变位点进行定点突变并制备相应的突变型碱性漆酶，检测突变型碱性漆酶的酶学性质，筛选出4个热稳定性提高的正向突变体。将获得的四个正向突变体进行组合突变，得到11种组合突变体，制备并检测这11种组合突变体的酶学性质，筛选得到一个热稳定性最佳的四点组合突变体LacCT?G190P?Q254Y?G336M?D510F，其氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。
其中，单体突变和组合突变的碱性漆酶突变体的制备和筛选方法包括如下步骤：
(1)筛选得到氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型碱性漆酶LacCT，合成对应的核苷酸序列并连接至表达载体，获得重组质粒，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
(2)以步骤(1)获得的重组质粒为模板，设计突变引物，进行定点突变PCR扩增反应，获得单体突变的重组表达载体并转化到宿主细胞中，获得重组表达菌株；
(3)对步骤(2)获得的重组菌株进行种子培养、发酵培养和诱导表达，然后离心收集菌体，提取胞内表达的重组蛋白并进行分离纯化；
(4)检测步骤(3)获得的重组蛋白的酶活、最适pH、最适温度、pH稳定性和热稳定性，筛选得到四个使重组蛋白热稳定性提升的突变位点；
(5)步骤(1)获得的重组质粒为模板，利用步骤(4)筛选的突变位点所对应的突变引物进行PCR扩增反应，重复步骤(2)～(4)，筛选得到热稳定性显著提升的组合突变重组蛋白，即突变型碱性漆酶LacCT?G190P?Q254Y?G336M?D510F。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
本发明实施例中的全基因合成皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
本发明实施例中的DNA测序由广州擎科生物公司完成。
本发明实施例所用试剂如下：
LB液体培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％ NaCl，121℃高压灭菌20min。
TB培养基：将12g蛋白胨，24g酵母提取物，4mL甘油溶解在0 .9L水中并进行高压灭菌。待培养基冷却到60℃，加入100mL灭菌的KH2PO4/K2HPO4的溶液。
KH2PO4/K2HPO4的溶液：2.31g KH2PO4和12.54g K2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100mL，121℃高压灭菌20min。
本发明实施例中所使用的其他材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂；未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：野生型碱性漆酶的制备
(1)重组质粒pET28a?LacCT的构建
通过NCBI获得嗜热嗜碱卡式杆菌来源的候选序列LacCT，其氨基酸序列如SEQ IDNo:1所示。将候选序列LacCT进行密码子优化后得到如SEQ ID No:3所示的核苷酸序列，全基因合成优化后的核苷酸序列并亚克隆到大肠杆菌基因表达载体pET28a，得到重组质粒pET28a?LacCT。
(2)菌落PCR鉴定和测序
将重组质粒pET28a?LacCT转化至Top10感受态细胞，将细胞涂布在含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，于37℃培养箱过夜培养。从平板中挑取阳性单菌落进行菌落PCR初步鉴定和DNA测序，得到重组质粒pET28a?LacCT。将含有正确重组质粒的克隆菌株E.coli Top10/pET28a?LacCT加50％甘油于?80℃保存。
(3)酶的诱导表达及纯化
将构建成功的重组质粒pET28a?LacCT加入E .coli BL21(DE3)感受态细胞，轻轻吹打混匀，冰浴5min。将转化产物涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养。
将重组表达菌株接种到10mL的LB液体培养基，37℃，200rpm震荡培养过夜。将过夜培养菌液按1:100接种到500mL的LB液体培养基，37℃，220rpm震荡培养至OD600为0.6～1，加入终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG，并将培养基置于16℃，200rpm过夜诱导表达。
诱导表达结束后，离心收集菌体，向离心好的菌沉淀中分别加入一定体积的Tris?HCl buffer并用超声波破碎细胞，然后离心以提取、收集胞内表达的重组蛋白。用Ni2+柱对重组蛋白进行纯化，获得野生型碱性漆酶WT(LacCT )。
实施例2：突变型碱性漆酶的制备
(1)重组质粒pET28a?G190P?Q254Y?G336M?D510F的构建
对核苷酸序列如SEQ ID No:3所示的野生型碱性漆酶LacCT基因进行组合突变，得到碱性漆酶突变体，具体步骤如下：以表1所示序列为引物，pET28a?LacCT为模板，通过重叠延伸PCR获得完整的引入突变位点的突变基因。
表1 引入突变碱基的引物及其序列
(2)菌落PCR鉴定和测序
用QIAquick Gel Extration Kit试剂盒对步骤(1)所得PCR产物进行切胶回收和纯化，用Dpn I消除原始模板，然后转化至Top10感受态细胞，将细胞涂布在含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，于37℃培养箱过夜培养。从平板中挑取阳性单菌落进行菌落PCR初步鉴定和DNA测序，得到重组质粒pET28a?G190P?Q254Y?G336M?D510F。将含有正确重组质粒的克隆菌株E.coli Top10/pET28a?G190P?Q254Y?G336M?D510F加50％甘油于?80℃保存。
(3)酶的诱导表达及纯化
将构建成功的重组质粒pET28a?G190P?Q254Y?G336M?D510F加入E .coli BL21(DE3)感受态细胞，轻轻吹打混匀，冰浴5min。将转化产物涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养。
将重组表达菌株接种到LB液体培养基，37℃震荡培养过夜。将过夜培养菌液接种到的LB液体培养基，37℃震荡培养至OD600为0.6～1，加入诱导剂IPTG，于16℃，200rpm过夜诱导表达。
诱导表达结束后，离心收集菌体，向离心好的菌沉淀中分别加入Tris?HCl buffer并用超声波破碎细胞，然后离心以提取、收集胞内表达的重组蛋白。用Νi2+柱对重组蛋白进行纯化，获得突变型碱性漆酶Mutant(LacCT?G190P?Q254Y?G336M?D510F)，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
效果例1：野生型和突变型碱性漆酶的酶学性质测定
(1)碱性漆酶的酶活测定
碱性漆酶的酶活测定以愈创木酚(465＝12100M?1cm?1)为底物，反应体系为：适度稀释的酶液，终浓度2mM的愈创木酚，终浓度10μM的CuSO4，用50mM Tris?HCl缓冲液补充反应体系体积至1mL；测定条件为：利用酶标仪检测碱性漆酶与底物反应5min前后在465nm处吸光值的变化，以计算碱性漆酶活力。
将每分钟催化氧化1μmol底物所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
碱性漆酶酶活力单位计算公式如下：酶活(U/L)＝n×Vt× Δ OD/(×5×Ve/106)。式中n为酶液稀释倍数；Vt为酶反应体系的总体积；Ve为酶反应体系中酶液体积；ΔOD为反应前后吸光值的变化；为底物的摩尔吸光系数。
(2)最适温度的测定
以愈创木酚为底物，在最适pH条件下，测定不同温度条件下野生型和突变型碱性漆酶的酶活力，以最高酶活为100％计算相对酶活。
参阅图2，突变型碱性漆酶Mutant(LacCT ?G190P?Q254Y?G336M?D510F)的最适温度与野生型碱性漆酶WT(LacCT)的最适温度均为65℃。
(3)最适pH的测定
以愈创木酚为底物，在酶的最适反应温度下，测定pΗ值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5时野生型和突变型碱性漆酶的酶活力，以最高酶活为100％计算相对酶活。
参阅图3，突变型碱性漆酶Mutant的最适pH与野生型碱性漆酶WT的最适pH均为7.5。
(4)温度稳定性的测定
取适当稀释的酶液，在60℃分别处理15、30、45、60min后，以愈创木酚为底物测定酶的残余活性，以未经热处理酶液的酶活为100％计算相对酶活。
参阅图4，与野生型碱性漆酶WT相比，突变型碱性漆酶Mutant的热稳定性显著提升。60℃处理30min后，野生型碱性漆酶WT剩余52％的残余活性，而突变型碱性漆酶Mutant剩余74％的残余活性。60℃处理60min后，野生型碱性漆酶WT仅剩余34％的残余活性，而突变型碱性漆酶Mutant还剩余53％的残余活性。因此，突变型碱性漆酶Mutant在原有的野生型碱性漆酶WT的基础上提高了近20％的热稳定性。
(5)pH稳定性的测定
分别用50mmol/L柠檬酸缓冲液(pH4.0～6.0)、50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0～8.0)、50mmol/L Tris?HCl缓冲液(pH7.0～9.0)和50mmol/L甘氨酸氢氧化钠缓冲液(pH9.0～10.0)配制酶液，使反应体系的pH在4.0～10.0范围内，将上述反应体系置于4℃孵育12h，测定酶的残余活性，以最高酶活为100％计算相对酶活。
参阅图5，野生型及突变型碱性漆酶在pH6.0～10.0范围内保持超过85％以上的活性，因此野生型及突变型碱性漆酶具有相似的pH稳定性，可以在较宽的pH范围内保持稳定。
效果例2：野生型和突变型碱性漆酶的苎麻脱胶分析
碱性漆酶能够有效降解苎麻中难以去除的木质素，利于纤维分离从而可应用于苎麻脱胶，但苎麻中木质素含量仅为4％左右，采用单一碱性漆酶进行脱胶时脱胶效果微弱，因此将碱性漆酶与常用的果胶酶、木聚糖酶复配，共同用于苎麻脱胶。
(1)苎麻脱胶工艺流程
实验共分为4组，实验组1为未经苎麻脱胶工艺处理的原麻，实验组2～4的区别在于酶脱胶过程所用复合酶的种类不同，其中，实验组2仅使用果胶酶和木聚糖酶复配，实验组3使用野生型碱性漆酶WT、木聚糖酶和果胶酶复配，实验组4使用突变型碱性漆酶Mutant、木聚糖酶和果胶酶复配。
使用上述复合酶进行苎麻脱胶的工艺流程如下：将苎麻进行5次机械碾压，然后于5g/L尿素、3g/LJFC?6溶液中浸渍24h，苎麻和溶液的浴比为1:10，将浸渍后的苎麻置于软垫上用橡胶锤反复敲打至纤维分散，然后将10g苎麻纤维按浴比1:10完全浸没于生物复合酶溶液中，在50℃浸泡16h，所述生物酶复合溶液为16g/L果胶酶、8g/L木聚糖酶和1.5U/mL野生型或突变型碱性漆酶复配，溶于含1g/LJFC?6的50mMTris?HCl缓冲液(pH7.5)。其中，实验组2不含碱性漆酶，仅为果胶酶和木聚糖酶复配。
然后对苎麻纤维进行碱氧处理：将苎麻纤维置于含6mL/L30％H2O2，4g/LNaOH，3g/LTF?122H的溶液中，将温度从40℃升温到60℃；然后加入6mL/L30％H2O2，将温度从60℃升温到98℃并保温30min后，使用80～85℃热水洗麻；然后将苎麻置于2g/L乙酸浸泡10min后水洗；再将苎麻置于2g/LJMN?6，50℃浸渍10min后水洗。将碱氧处理后的苎麻置于5g/L乳化油JM?D1、5g/L乳化油JM?D2中，于40℃保温45min，浴比1：10，然后进行烘干处理。
(2)失重率和残胶率测定
将原麻烘至恒重，冷却后称重(记为m0)，经过脱胶处理后将其再次烘干，记录脱胶后苎麻的干重(记为m1)，计算失重率，失重率＝(m0?m1)/m0×100％。
另外，参考GB/T18147.2—2008《大麻纤维试验方法第2部分：残胶率试验方法》测定苎麻纤维的残胶率。
(3)束纤维强度测定
将脱胶后的苎麻纤维在(21±1)℃、湿度65％±2％调湿24h后，用钢梳(10根/cm)对纤维进行梳理使其平行顺直；将束纤维切割至10cm，称量后计算束纤维细度，再采用YG(B)?026D?250型电子织物强力机(温州大荣)测试强度，拉伸速率为300mm/min，拉伸隔距为25mm。
(4)束纤维白度测定
根据GB/T5885—1986《苎麻纤维白度试验方法》，整理试样麻束，去除麻结，使纤维平直，在WSDⅢ型织物白度仪(北京康光仪器有限公司)上测定苎麻纤维的蓝光白度。
参阅表4，与实验组2相比，实验组3～4即加入碱性漆酶复配的复合酶脱胶处理显著降低苎麻的残胶率，同时将苎麻的束纤维强度保持同样水平，说明酶脱胶处理时加入碱性漆酶可将苎麻中木质素去除，利于纤维分离，从而更有利于胶质的去除。
实验组4的苎麻白度和束纤维强度与实验组3保持一致水平，但与实验组3相比，其残胶率更低，说明突变型碱性漆酶Mutant(LacCT?G190P?Q254Y?G336M?D510F)比野生型碱性漆酶WT辅助脱胶效果更优。
表4不同酶复配处理对苎麻纤维性能的影响
综上，本发明提供的野生型及突变型碱性漆酶属于碱性中温酶，其最适温度为65℃，最适pH为7.5并且能够在较宽的pH范围内(即pH6.0～10.0)保持稳定，其中突变型碱性漆酶在野生型碱性漆酶的基础上提升了近20％的热稳定性。另外，本发明的野生型或突变型碱性漆酶可与木聚糖酶和果胶酶复配用于碱性中温环境下的苎麻脱胶工艺，实现显著降低苎麻的残胶率，因此本发明的野生型或突变型碱性漆酶具有辅助苎麻脱胶的作用，为苎麻脱胶工业复配酶制剂需求提供了一种新选择，其中，突变型碱性漆酶辅助苎麻脱胶的效果比野生型碱性漆酶更优。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
