摘 要：斑马纹病是剑麻的主要病害之一，严重影响了剑麻产业的发展，目前关于斑马纹病的致病机制尚不清楚。为了培育出剑麻斑马纹病抗病新品种，本研究分别以剑麻斑马纹病抗病品种粤西114和感病品种H.11648为父母本进行回交，获得回交后代热麻1号剑麻。利用常规方法对热麻1号剑麻叶形、叶色、叶缘刺有无、叶缘刺类型、叶顶刺类型、叶长、叶宽、叶基厚度、顶刺长、顶刺基部宽、株高、花序形状、花轴高、花梗数、花、果实、种子、年展叶数、周期展叶数、生命周期、纤维率等进行分析，采用壁低渗火焰干燥法、流式细胞术结合菌斑接种法对热麻1号剑麻倍性、基因组大小以及对烟草疫霉的抗性等进行鉴定。结果表明：热麻1号剑麻叶片剑形、肉质、刚硬、叶片灰绿，叶面平整有蜡粉，叶顶有1.2-2.0 cm锐刺，叶缘无刺，叶片绕茎呈螺旋状排列上升。叶长约130 cm，叶宽约16 cm，叶基厚度约3.5 cm。株高1.8-2.5 m，圆锥形花序，花轴高3-7 m，花梗数20-32个，完全花、花黄色、花瓣6枚。蒴果、长圆形、成熟时黑褐色，种子半月形，黑色、纸质。周期展叶360～400片；纤维率约3.5％，纤维长约100 cm。生命周期6-9年。热麻1号剑麻为四倍体（2X=4n），染色体数目为104-118，2C DNA含量为11.69 pg，对烟草疫霉高度抗病或免疫，有望成为剑麻斑马纹病发病区的先锋品种。
关键词：热麻1号剑麻；斑马纹病
剑麻是重要的热带经济作物之一，其纤维质地坚韧、富于弹性、拉力强、抗撕裂、耐磨、防腐以及耐低温等，广泛应用于国防、渔业、交通运输以及冶金等领域[1,2]，随着材料科学技术的飞速发展，通过添加剑麻纤维改进新型复合材料及其衍生材料的性能[3]，扩大复合材料在军事以及多种民用制造业中的应用，对推动我国经济快速发展起到了非常重要的作用。同时剑麻在食品科学[4,5,6]、医学[7]、生物质能源[8]以及作物遗传改良[9]等方面应用广泛，因此，加快剑麻种质创新，对推动我国经济长期稳定发展具有重要的经济价值。
斑马纹病是剑麻的主要病害之一，主要由烟草疫霉（Phytophthora nicotianae Breda）引起，因斑马纹病导致大面积麻园被毁，纤维产量下降，严重影响了国内外剑麻产业的发展[10,11]。国内外学者对该病进行了大量研究，目前已形成了一套完整的病原菌分离、鉴定和防治技术[12]。同时，在剑麻种质资源抗性鉴定、抗斑马纹病生理生化机制、功能基因挖掘以及转基因等方面也开展了研究[13,14,15,16,17]，取得了一定进展，但抗病机制和致病机理仍不清楚。由于长期大量使用化学药剂对环境和生物多样性破坏严重，因此，培育出抗斑马纹病新品种，仍然是育种学家们一直以来的的首要目标。20世纪80年代初，育种学家们以主栽品种H.11648为母本，普通剑麻为父本，通过有性杂交培育出来F1代杂交品种粤西114，粤西114的特点是抗斑马纹病，对茎腐病也有一定抗性，但该品种叶基厚、叶缘有刺、生命周期短，在后续试验中发现对斑马纹病抗性不稳定[18]。为了稳定和提高粤西114的优良性状，本研究利用粤西114与H.11648回交，获得杂交F2代，通过对杂交F2代叶缘刺有无、叶长、叶宽、株高、叶基厚度、年产叶数、周期产叶数、纤维率、抗病性、抗寒性等多个性状综合评价，初步筛选出叶缘无刺、长势良好、抗性比亲本粤西114和H.11648强的优良单株、然后在广东、广西等剑麻主产区开展品比试验和区域性试验，进一步筛选出了综合长势良好，叶缘无刺、对斑马纹病高度抗病的剑麻新品种-热麻1号剑麻。该品种2015年获得广东省品种登记权。由于热麻1号剑麻生命周期比主栽品种H.11648短，周期产业数比主栽品种H.11648少，热麻1号剑麻目前常用于剑麻斑马纹病病区补植品种和优良杂交亲本，还未广泛推广应用。
1 材料与方法
1.1 材料
H.11648、粤西114和热麻1号保存在中国热带农业科学院南亚热带作物研究所剑麻种质圃。Zea mays cv. CE777玉米种子由Dole?el友情提供。
1.2 实验方法
1.2.1 亲本选择及杂交
以斑马纹病抗病品种粤西114为母本，以主栽品种H.11648为父本进行人工杂交，待果实成熟后取出种子并播种育苗，待植株生长到30公分左右，根据植株的表型特征如叶缘有/无刺，叶长，叶宽，叶片数、株型，叶基厚度等，结合育种目标初步筛选出候选材料，作为进一步鉴定的优株。
1.2.2 形态学特征观测
随机选取10株成龄麻，每株3片叶片，对热麻1号株型、叶片伸展模式、叶形、叶色、叶缘刺有无、叶缘刺类型、叶顶刺类型、叶片有无蜡粉、叶长、叶宽、叶基厚度、顶刺长、顶刺基部宽、株高、花轴高、花梗数、花、果实、种子等性状进行观测，其中质量性状用肉眼观测，数量性状用卷尺进行测定。其中叶长为叶基部到顶刺的距离（包括顶刺），叶宽为叶片最宽处的宽度。株高为植株基部到叶片顶端的高度，株高、花轴高，花梗数、花色、花序形状等在植株开花后测量，果实以及种子等数据在果实成熟时收集，所有数据用EXCEL软件进行分析统计。
1.2.3 纤维特性测定
待叶片成熟后，收割叶片，称量鲜叶重量，然后加工收获纤维，待纤维晾干后称取干纤维重量，计算纤维率，同时用拉力测量仪测量纤维拉力大小。纤维率=干纤维重/鲜叶重×100%。
1.2.4 斑马纹病抗性鉴定
大田抗病性测定：以热麻1号剑麻为试验对象，以H.11648和粤西114为对照，在雨季来临前种植于斑马纹病重病发病区，雨季过后调查斑马纹病发病情况，具体参考赵艳龙等[12]的方法进行。室内抗病性鉴定：采用盆栽和离体叶片两种方式接种方式，取斑马纹病病菌接种于提前准备好的H.11648、粤西114和热麻1号叶片上，用棉花保湿，分别在接种24、48、72h和7d测定病班大小，具体参考张燕梅等[2]的方法进行。
1.2.5 根尖染色体检测
分别取热麻1号、H.11648和粤西114根尖约1cm，先用0.002mol/L浓度的8-羟基喹啉预固定2h，然后用卡诺固定液（无水乙醇：冰乙酸=3:1）固定过夜，用5%纤维素酶和果胶酶（纤维素酶：果胶酶=1:1）37℃孵育1h后快速涂片并火焰干燥，最后用5%Giemsa染色10-15min,在显微镜（ZEISS Axiolmager M2）下观察染色体数目，并拍照保存。
1.2.6 基因组大小测定
取热麻1号、H.11648和粤西114组培苗叶片，以玉米（Zea mays cv. CE777）为标准样品（standard plant），用流式细胞仪（Partec）测定基因组大小，具体参照Palomino等[14]的流式细胞仪方法测定，待测样品2C DNA含量=待测样品G0/G1值÷（标准样品G0/G1）×标准样品2C DNA含量（pg）。
1.3 数据分析
病斑大小用尺子测量并EXCEL软件分析处理和作图。
2 结果与分析
2.1 表型特征及纤维特性
热麻1号剑麻植株高大，约1.9m，叶片向上螺旋排列，灰绿色，肉质刚直，叶剑形，表面平整，有少量蜡粉，叶缘无刺，叶尖有1.6-2.0cm黑褐色坚硬的锐刺，叶长120-135cm，叶宽15-17cm，叶基厚度约3.5cm，年展叶45-55片，周期展叶数360-400片。圆锥花序，花轴高5.1-5.5m，花梗数20-32个，完全花，花黄色，花被浅淡黄色，下部联合形成萼筒，上部分裂成6片花瓣，雌蕊一枚，柱头3裂，子房下位，自交结实。蒴果，长圆形，果实大小约5cm×6cm,早期为绿色，成熟后为黑褐色。每个果实里约300枚种子，种子半月形，成熟后为黑色，纸质扁平，有光泽。生命周期6-9年，叶片纤维含量3.5%，纤维细而均匀，长度110cm、纤维拉力66.2kg、束纤维强力649牛顿（图1）。
2.2 倍性和基因组大小测定
根尖染色体观测和流式细胞仪分析表明，热麻1号剑麻染色体数目为104-118，长染色体和中等长度的染色体共计20条，其余染色体为棒状或点状，为四倍体，基因组大小2C=11.69±0.02pg。H.11648染色体数目为48-60条，长染色体和中等长度的染色体共10条，为二倍体，基因组大小2C=7.07±0.02pg。粤西114染色体数目为101-112条，其中长染色体和中等长度的染色体共20条，为四倍体，基因组大小2C=11.74±0.21pg（图2）。
图1 热麻1号剑麻
A1: 开花植株；A2：叶片；A3：叶顶刺；A4:花；A5：果；A6：种子
图2 H.11648，粤西114和热麻1号剑麻根尖染色体
图3 H.11648，粤西114和热麻1号剑麻DNA含量检测
2.3 斑马纹病抗性检测
大田抗病试验表明，H.11648、粤西114和热麻1号剑麻抗病指数分别为78.1、63.2和22.4，对斑马纹病菌表现为高度感病，中度感病和高度抗病（赵艳龙等，2014）。盆栽试验和离体叶片接种后发现，H.11648病斑最大，2019-2021年连续三年接种烟草疫霉，每年接种1周后观测发现病斑大小均超过15cm，粤西114次之，2019年约10cm，2021年约15cm，2020年约2cm，抗性极不稳定，热麻1号剑麻除伤口处有与伤口相同大小的约0.6cm褐斑外，随着接种时间延长，病斑没有进一步扩展，检测结果与大田试验一致，且2019、2020和2021接种结果均不变，即热麻1号剑麻对烟草疫霉的抗性远超过亲本H.11648和粤西114，对斑马纹病菌表现为高度抗病（图4）。
图4 H.11648，粤西114和热麻1号剑麻2019、2020、2021年接种烟草疫霉后病斑大小
3 讨论
培育抗病高产剑麻新品种一直是剑麻育种的首要目标，采取的方式方法也多种多样，比如人工杂交、化学诱变、细胞融合、单倍体育种、基因工程以及基因编辑等，其中人工杂交是较为常用方法之一，在此过程中，亲本的选择尤为重要。H.11648是目前剑麻产业中唯一的主栽品种，平均年长叶60-70片，周期长叶560-650片，纤维率5%以上，生长周期10年以上，综合性状优良，常常作为重要的亲本材料广泛应用于剑麻育种，但H.11648易感斑马纹病。粤西114是H.11648与普通剑麻的杂交F1代，通过长期试验观察发现，该品种对斑马纹病菌表现为较强的抗病性，但抗性不稳定，因此，利用粤西114和H.11648为亲本进行杂交，有望获得抗病高产的新品种。热麻1号剑麻是粤西114和H.11648回交子代，对斑马纹病菌高度抗病甚至免疫，并且抗性稳定，此外，热麻1号剑麻耐旱耐寒，速生粗长，本研究室前期在云南元谋干热河谷区的品种试验发现，热麻1号剑麻在云南干热河谷区生长较其它品种要好，因此，可以广泛应用于云南干热河谷区生态恢复。由于热麻1号剑麻生产周期短，纤维含量比H.11648低，目前常作为抗性杂交亲本使用，暂时还未推广应用。随着育种工作的不断推进，目前已从热麻1号剑麻的自交子代和杂交后代中相继筛选出部分优良单株，进一步的品种区域试验正在进行，有望获得产量高抗性强的剑麻优良品种，因此，有一定的应用前景。
根尖分生组织细胞生长旺盛，常用于染色体观察，并且相对于流式细胞仪倍性分析而言，染色体观察能更直观地观察到染色体数目，形态特征等。本研究结果显示粤西114染色体数目为102-114条，根据中长染色体数目，结合流式细胞仪分析结果判定为四倍体，染色体形态正常，未检测到三倍体和丝状小染色体，这与吕玲玲等研究结果有一定差异[19]，可能与剑麻复杂的倍性，以及自然条件下容易变异有关[20,21,22,23]。建议扩大观测样本数量，防止实验结果出现偏差。此外，粤西114的母本H.11648为二倍体，父本普通剑麻为五倍体，有望获得三倍体和四倍体的子代粤西114。四倍体的粤西114和二倍体的H.11648回交获得四倍体热麻1号剑麻，一方面说明剑麻遗传的复杂性，同时也证实了剑麻多倍体和非整倍体广泛存在，变异频繁而且比例还很高的观点[20,21]，因此，建议在杂交亲本选择时，尽量不选或少选多倍体。
流式细胞术作为一种高效快速的倍性鉴定和DNA含量分析方法，在剑麻种质资源鉴定与评价中应用广泛[22,23]。该方法能快速直观地检测出目标样本的倍性，而且灵敏度高，尤其对于大样本，省时省力。由于流式细胞术无法直观展示染色体的核型特征，染色体是否丢失或结构发生变化等信息，建议在进行分析时，将流式检测技术与常规的染色体制片技术相结合，进一步分析染色体形态结构特征及倍性。
前人研究表明剑麻染色体基数为30，其中5条长染色体，25条相对小染色体，随着倍性增加，染色体条数成比例增加[20]。热麻1号和粤西114染色体数目存在较大出入，一方面可能是实验操作过程中小染色体降解或丢失，也可能是不正常减数分裂如丢失，交换等，或非整倍体存在等多种因素所致，同时这也会导致在加倍过程中基因组变小[25]。Robert等[20]以洋葱（Allium cepa cv. Ailsa Craig）为参考基因组，对H.11648等龙舌兰属剑麻7个品种进行基因组大小分析，结果显示H.11648基因组4C DNA为15.23 pg，本研究以玉米（Zea mays cv. CE777）为参考基因组，显示H.11648基因组2C DNA为7.07 pg，另外，从理论而言，热麻1号和粤西114为四倍体，2C DNA为H.11648的2倍，约14.14 pg，实际分析结果分别为11.69 pg和11.74 pg，出入较大，可能与参考基因组的选择有关。Moreno-Salazar[26]、Palomino[27]和Robert等[20]分别在对Agave angustifolia Haw进行基因组大小分析时，以玉米（Zea mays cv. CE777）为参考基因组分析结果为2C DNA为8.499 pg[26]和8.477 pg[27]，以洋葱（Allium cepa cv. Ailsa Craig）为参考基因组大小为7.45pg[20]。Dole?el & Bartos等[24]认为，为了降低试验结果误差，应选取与研究对象基因组大小相近的物种作为参考基因组。
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文章摘自：张燕梅，李俊峰，陆军迎等．剑麻斑马纹病抗病新品种－热麻１号剑麻[J/OL].热带作物学报，1-7[2023-12-27]http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1019.S.20231206.1528.002.html.
