王光磊，陈猛，刘占伟，李继航，胡新奇，田鑫，张仪华
摘 要：本发明公开了一种罗布麻叶标准汤剂的制备及其质量检测方法，涉及中药材质量研究技术领域。本发明包括如下步骤：称取罗布麻叶饮片适量，置砂锅内，煎煮两次，第一次加12倍水，浸泡30min，武火煮沸后改文火煎煮30min；第二次加10倍水，武火煮沸后改文火煎煮20min，药液200目滤过，滤液冷水浴冷却至室温，合并两次滤液，于温度为50℃条件下真空浓缩，绝对真空度为30～40mbar条件下真空浓缩，浓缩至药材与流浸膏重量比例约为1：1的流浸膏，收取浓缩液，冷冻干燥即得样品。本发明对罗布麻叶在汤剂制备后的主要含量、特征图谱及浸出物等关键质量指标，进行测定，并对转移率进行了考察，有客观质量标准来衡量饮片至汤剂后的成分转移情况，并确保汤剂的质量程度及有效性。
权利要求书
1.一种罗布麻叶标准汤剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1：称取罗布麻叶饮片，置砂锅内，煎煮两次；
步骤S2：加12倍水，浸泡30min，武火煮沸后改文火煎煮30min；
步骤S3：加10倍水，武火煮沸后改文火煎煮20min；
步骤S4：药液200目滤过，滤液冷水浴冷却至室温，合并两次滤液；
步骤S5：滤液冷水浴冷却至室温，合并两次滤液，于温度为50℃、绝对真空度为30～40mbar条件下真空浓缩；
步骤S6：浓缩至药材与流浸膏重量比例约为1：1的流浸膏；
步骤S7：收取浓缩液，冷冻干燥得到样品；
步骤S8：计算衡量中药在汤剂中的指标。
2. 根据权利要求1所述的一种罗布麻叶标准汤剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S8中，将罗布麻叶水提液经真空浓缩后，将浓缩液进行冷冻干燥至干，收集干膏粉并称定重量，计算出膏率；所述出膏率公式如下：
3.一种罗布麻叶标准汤剂的质量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤A、对照品溶液的制备：取金丝桃苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成每1ml含36μg的溶液，即得；
步骤B、供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
步骤C、参照物溶液的制备：取罗布麻叶对照药材0.5g，置具塞锥形瓶中，加70％甲醇50ml，超声处理20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；另取金丝桃苷对照品适量，加70％甲醇制成每1ml含30μg的溶液，作为对照品参照物溶液；
步骤D、建立：分别取所得对照品溶液、供试品溶液和参照物溶液各10μl注入液相色谱仪中进行检测；
所述液相色谱仪色谱检测采用的条件包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm；
色谱柱柱温：柱温25℃;
流动相：以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸为流动相B；
流动相流速：每分钟1.2mL；
检测波长：320nm；
理论板数按金丝桃苷峰计算应不低于8000；
流动相按梯度洗脱程序为：
0～10min，流动相A为11上升至15％，流动相B为89降低至85%;
10～15min，流动相A为15％，流动相B为85%;
15～25min，流动相A为15上升至20％，流动相B为85降低至80%;
25～40min，流动相A为20上升至25％，流动相B为80降低至75%;
40～55min，流动相A为25上升至40％，流动相B为75降低至60％。
4.根据权利要求1所述的一种罗布麻叶标准汤剂的质量检测方法，其特征在于，所述供试品色谱中包括七个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中七个特征峰的相对保留时间相对应；与金丝桃苷照物相应的峰为S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1为0.272、峰2为0.408、峰3为0.443、峰4为0.541、峰6为1.025、峰7为1.194。
技术领域
本发明属于中药材质量研究技术领域，特别是涉及一种罗布麻叶标准汤剂的制备及其质量检测方法。
背景技术
现代研究表明，罗布麻叶含有多种成分，如黄酮类（金丝桃苷）、儿茶素、鞣质、有机酸类、脂肪酸醇脂、醇类和甾体类、糖类、氨基酸类、矿物质元素等，罗布麻叶中除上述成分外,还含有维生素类类、苷类及挥发性油等成分。罗布麻叶具有肝保护作用（金丝桃苷）、抗抑郁作用、抗糖尿病血管病变作用、调节血压、降血脂作用、抗氧化作用（金丝桃苷）等多种药理活性。《中国药典》2020年版将金、烷丝桃苷作为罗布麻叶质量控制的指标成分，因此，本研究选择金丝桃苷作为罗布麻叶标准汤剂的质量控制指标成分。
中药的临床使用多以传统汤剂为主。中药汤剂的物质基础，是中医理论指导下防治疾病的基础。现行的法定标准仅针对单一成分进行定量控制，量效关系不能全面反映中药成分的整体作用。在现阶段，中药绝大多数有效成分未明确的情况下，中药指纹图谱/特征图谱的建立能大大提高中药质量控制的技术水平及科技含量。
目前文献研究报道的关于罗布麻叶指纹图谱多采用的是常规的HPLC法，且均只针对原药材的物质基础，指标成分多以脂溶性成分为研究对象；主要用于中药材真伪、产地、品质差异的定性鉴别，不能全部反映中药汤剂的物质基础特征。
发明内容
本发明的目的在于提供一种罗布麻叶标准汤剂的制备及其质量检测方法，通过对罗布麻叶在汤剂制备后的主要含量、特征图谱及浸出物等关键质量指标，进行测定，并对转移率进行了考察，对药材主含量的转移率范围进行判断，对汤剂的有效性进行检测，解决了现有的罗布麻叶汤剂难以评定和控制药效质量的问题。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明为一种罗布麻叶标准汤剂的制备，包括如下步骤：
步骤S1：称取罗布麻叶饮片，置砂锅内，煎煮两次；
步骤S2：加12倍水，浸泡30min，武火煮沸后改文火煎煮30min；
步骤S3：加10倍水，武火煮沸后改文火煎煮20min；
步骤S4：药液200目滤过，滤液冷水浴冷却至室温，合并两次滤液；
步骤S5：滤液冷水浴冷却至室温，合并两次滤液，于温度为50℃、绝对真空度为30～40mbar条件下真空浓缩；
步骤S6：浓缩至药材与流浸膏重量比例约为1：1的流浸膏；
步骤S7：收取浓缩液，冷冻干燥得到样品；
步骤S8：计算衡量中药在汤剂中的指标。
作为一种优选的技术方案，所述步骤S8中，将罗布麻叶水提液经真空浓缩后，将浓缩液进行冷冻干燥至干，收集干膏粉并称定重量，计算出膏率；所述出膏率公式如下：
。
本发明为一种罗布麻叶标准汤剂的质量检测方法，包括如下步骤：
步骤A、对照品溶液的制备：取金丝桃苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成每1ml含36μg的溶液，即得；
步骤B、供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
步骤C、参照物溶液的制备：取罗布麻叶对照药材0.5g，置具塞锥形瓶中，加70%甲醇50ml，超声处理（功率600W，频率40kHz）20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；另取金丝桃苷对照品适量，加70%甲醇制成每1ml含30μg的溶液，作为对照品参照物溶液；
步骤D、建立：分别取所得对照品溶液、供试品溶液和参照物溶液各10μl注入液相色谱仪中进行检测；
所述液相色谱仪色谱检测采用的条件包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm；
色谱柱柱温：柱温25℃;
流动相：以乙腈为流动相A，以0.2%磷酸为流动相B；
流动相流速：每分钟1.2mL；
检测波长：320nm；
理论板数按金丝桃苷峰计算应不低于8000；
流动相按梯度洗脱程序为：
0～10min，流动相A为11上升至15%，流动相B为89降低至85%；
10～15min，流动相A为15%，流动相B为85%；
15～25min，流动相A为15上升至20%，流动相B为85降低至80%
25～40min，流动相A为20上升至25%，流动相B为80降低至75%；
40～55min，流动相A为25上升至40%，流动相B为75降低至60%。
作为一种优选的技术方案，所述供试品色谱中包括七个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中七个特征峰的相对保留时间相对应；与金丝桃苷照物相应的峰为S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1为0.272、峰2为0.408、峰3为0.443、峰4为0.541、峰6为1.025、峰7为1.194。
本发明具有以下有益效果：
本发明对罗布麻叶在汤剂制备后的主要含量、特征图谱及浸出物等关键质量指标，进行测定，并对转移率进行了考察，对药材主含量的转移率范围进行判断，对汤剂的有效性进行检测，提高了中药质量控制的技术水平及科技含量。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
图1为本发明的一种罗布麻叶标准汤剂的制备流程图。
图1
图2为对照特征图谱。
图2
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1所示，本发明为一种罗布麻叶标准汤剂的制备，包括如下步骤：
步骤S1：称取罗布麻叶饮片，置砂锅内，煎煮两次；
步骤S2：加12倍水，浸泡30min，武火煮沸后改文火煎煮30min；
步骤S3：加10倍水，武火煮沸后改文火煎煮20min；
步骤S4：药液200目滤过，滤液冷水浴冷却至室温，合并两次滤液；
步骤S5：滤液冷水浴冷却至室温，合并两次滤液，于温度为50℃、绝对真空度为30～40mbar条件下真空浓缩；
步骤S6：浓缩至药材与流浸膏重量比例约为1：1的流浸膏；
步骤S7：收取浓缩液，冷冻干燥得到样品；
步骤S8：计算衡量中药在汤剂中的指标；将罗布麻叶水提液经真空浓缩后，将浓缩
液进行冷冻干燥至干，收集干膏粉并称定重量，计算出膏率；出膏率公式如下：
本发明为一种罗布麻叶标准汤剂的质量检测方法，包括如下步骤：
步骤A、对照品溶液的制备：取金丝桃苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成每1ml含36μg的溶液，即得；
步骤B、供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
步骤C、参照物溶液的制备：取罗布麻叶对照药材0.5g，置具塞锥形瓶中，加70%甲醇50ml，超声处理（功率600W，频率40kHz）20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；另取金丝桃苷对照品适量，加70%甲醇制成每1ml含30μg的溶液，作为对照品参照物溶液；
步骤D、建立：分别取所得对照品溶液、供试品溶液和参照物溶液各10μl注入液相色谱仪中进行检测；
液相色谱仪色谱检测采用的条件包括：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm；
色谱柱柱温：柱温25℃;
流动相：以乙腈为流动相A，以0.2%磷酸为流动相B；
流动相流速：每分钟1.2mL；
检测波长：320nm；
理论板数按金丝桃苷峰计算应不低于8000；
流动相按梯度洗脱程序为：
0～10min，流动相A为11上升至15%，流动相B为89降低至85%；
10～15min，流动相A为15%，流动相B为85%；
15～25min，流动相A为15上升至20%，流动相B为85降低至80%
25～40min，流动相A为20上升至25%，流动相B为80降低至75%；
40～55min，流动相A为25上升至40%，流动相B为75降低至60%。
供试品色谱中包括七个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中七个特征峰的相对保留时间相对应；与金丝桃苷照物相应的峰为S峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1为0.272、峰2为0.408、峰3为0.443、峰4为0.541、峰6为1.025、峰7为1.194。
实施例
实施例一
罗布麻叶标准汤剂的制法如下：称取罗布麻叶饮片适量，置砂锅内，煎煮两次，第一次加12倍水，浸泡30min，武火煮沸后改文火煎煮30min；第二次加10倍水，武火煮沸后改文火煎煮20min，药液200目滤过，滤液冷水浴冷却至室温，合并两次滤液，于温度为50℃条件下真空浓缩，绝对真空度为30～40mbar条件下真空浓缩，浓缩至药材与流浸膏重量比例约为1：1的流浸膏，收取浓缩液，冷冻干燥即得样品。
罗布麻叶水提液经真空浓缩后，将浓缩液进行冷冻干燥至干，收集干膏粉并称定重量，计算出膏率。出膏率公式如下：
;
出膏率范围：18.6%～25.0%。
浸出物为：以乙醇为溶剂，照醇溶性浸出物测定法（中国药典2020年版四部通则2201）项下的热浸法测定。标准汤剂浸出物范围为22.0%～40.8%。
进行含量测定：
金丝桃苷照高效液相色谱法（中国药典2020年版通则0512）测定。
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈一0.2%磷酸溶液（18∶82）为流动相；检测波长为256nm。理论板数按金丝桃苷峰计算应不低于6000。
对照品溶液的制备：取金丝桃苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含36μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50ml，称定重量，超声处理（功率600W，频率40kHz）20分钟，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
；本品每1g含金丝桃苷应为6.6mg/g～10.9mg/g。
药材到标汤汤剂的金丝桃苷含量转移率范围为19.2%～35.6%。
特征图谱：照高效液相色谱法（中国药典2020年版四部通则0512）测定。
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以乙腈为流动相A，以0.2%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为25℃；检测波长为320nm。理论板数按金丝桃苷峰计算应不低于8000。
参照物溶液的制备：取罗布麻叶对照药材0.5g，置具塞锥形瓶中，加70%甲醇50ml，超声处理（功率600W，频率40kHz）20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取金丝桃苷对照品适量，加70%甲醇制成每1ml含30μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取0.3g，置具塞锥形瓶中，加30%甲醇100ml，密塞，超声处理（功率200W，频率50kHz）30分钟，取出，放冷，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
供试品色谱中应呈现7个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，与金丝桃苷对照品参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内。规定值为：0.272（峰1）、0.408（峰2）、0.443（峰3）、0.541（峰4）、1.025（峰6）、1.194（峰7）。
如图2所示，峰1：新绿原酸；峰2：绿原酸；峰3：隐绿原酸；峰6：异绿原酸B；峰7：异绿原酸A；峰8：异绿原酸C；峰10（S）：金丝桃苷每毫克供试品约相当于0.035克饮片。
实施例二
根据《中药配方颗粒质量控制与标准定技术要求》，研究用样品应具有代表性，覆盖种上市拟采药材的道地产或主区，每个药材产地不少于3批。罗布麻叶为栽培品，在全国各地均有分布。主产于我国的广州、河南等地，其种植已形成规模化，也是罗布麻叶商品的主要来源，根据原料质量、资源可持续性供应等多方面的综合评估，大生产用原料产地初步定为广州番禺、河南南阳南召、河南驻马店泌阳、河南南阳桐柏县、河南洛阳汝阳。最终选择合格的15批开展标准汤剂的研究。
15批罗布麻叶标准汤剂转移率如下表：
结合15批罗布麻叶饮片含量、标准汤剂含量及出膏率数据，计算标准汤剂含量转移率平均值为27.4%；
采用均值加减3倍SD计算的范围值为：23.9%～30.9%；
采用均值70%～130%计算的范围值为：19.2%～35.6%；
结合实际范围25.8%～29.6%；
建议取均值70%～130%的范围值即19.2%～35.6%作为标准汤剂转移率上下限范围。
实施例三
选择实验批号为BT（LBMY）220301的罗布麻叶标准汤剂图谱为参照图谱，建立对照特征图谱。根据数据分析结果最终选定7个共有峰作为特征峰，生成的标准图谱见图2，选择金丝桃苷为参照峰，计算色谱图中特征峰的相对保留时间。通过与对照品色谱图比较，可知罗布麻叶标准汤剂特征图谱7个特征峰中，峰1：新绿原酸；峰2：绿原酸；峰3：隐绿原酸；峰4：咖啡酸；峰5(S)：金丝桃苷峰6：异槲皮苷；峰7：紫云英苷。通过《罗布麻叶配方颗粒》国家药品标准YBZ-PFKL-2021179可知。
5批罗布麻叶标准汤剂相对保留时间如下表：
结果表明，5批罗布麻叶标准汤剂供试品特征图谱均呈现与对照药材中的6个主要特征峰保留时间相对应的色谱峰，峰1～峰4、峰6～峰7相对保留时间RSD小于5%，说明各批次间各峰的出峰时间一致（备注：标准汤剂批号选择原则为与饮片批次相对应，以证明经过制备后的样品对饮片特征图谱几乎无影响）；
国家所发布的《罗布麻叶配方颗粒》YBZ-PFKL-2021179的规定，仅对峰1～峰7的保留时间应与对照饮片的保留时间相应，以及峰1～峰4、峰6、峰7的相对保留时间，以进行了规定。结合15批蜜枇杷叶标准汤剂的测定结果及方法学中重复性与精密度试验中的保留时间的数据（见下表4-17、4-18），可知峰1～峰4、峰6、峰7的保留时间稳定，与相应的对照饮片参照物保留时间相应，1～峰4、峰6、峰7相对出峰漂移很小，基本在±7%的范围内,说明各特征峰保留时间稳定。因此规定为：供试品色谱中应呈现7个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，与金丝桃苷对照品参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内。规定值为：0.272（峰1）、0.408（峰2）、0.443（峰3）、0.541（峰4）、1.025（峰6）、1.194（峰7）。
依照《罗布麻叶配方颗粒》YBZ-PFKL-2021141【浸出物】项，要求颗粒成品包含【浸出物】测定项。参考颗粒成品浸出物的测定方法，15批罗布麻叶的浸出物测定结果如下表：
测定15批标准汤剂醇溶性的浸出物，平均值为31.4%，
采用均值加减3倍SD计算的范围值为：22.5%～40.3%；
采用均值70%～130%计算的范围值为：22.0%～40.8%；
结合实际范围18.6%～37.9%；
建议取30.9%～42.0%作为标准汤剂浸出物上下限范围。
值得注意的是，上述系统实施例中，所包括的各个单元只是按照功能逻辑进行划分的，但并不局限于上述的划分，只要能够实现相应的功能即可；另外，各功能单元的具体名称也只是为了便于相互区分，并不用于限制本发明的保护范围。
另外，本领域普通技术人员可以理解实现上述各实施例方法中的全部或部分步骤是可以通过程序来指令相关的硬件来完成，相应的程序可以存储于一计算机可读取存储介质中。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
