摘 要:本发明涉及基因工程与分子育种技术领域，尤其涉及一种苎麻MYB转录因子及其应用。所述MYB转录因子为BnMYB6，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码其氨基酸的基因序列如SEQ ID NO.2所示。转录因子蛋白BnMYB6能够特异性负调控植物木质素的生物合成，在抑制植物木质素合成、促进根系生长发育、维持干旱胁迫下根系活力等相关性状方面具有应用价值。
权利要求书
1.一种苎麻MYB转录因子，其特征在于：所述MYB转录因子为BnMYB6，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种苎麻MYB转录因子的基因，其特征在于：编码如权利要求1所述的苎麻MYB转录因子。
3.如权利要求2所述的苎麻MYB转录因子的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于：包含权利要求3所述的苎麻MYB转录因子的基因。
5.一种宿主细胞，其特征在于：包含权利要求1所述的苎麻MYB转录因子、权利要求2或3所述的苎麻MYB转录因子的基因或权利要求4所述的重组表达载体。
6.如权利要求1所述的苎麻MYB转录因子、权利要求2或3所述的苎麻MYB转录因子的基因、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的宿主细胞在调控植物木质素生物合成、木质素合成相关基因表达、植物木质素沉积和/或植物表型中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述调控植物木质素生物合成包括：负向调控植物木质素生物合成。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述调控木质素合成相关基因表达包括：负向调控木质素生物合成相关基因的表达；所述木质素生物合成相关基因包括AtPAL2、AtCAD4、AtCAD6、AtCCoAOMT1、At4CL5或AtCOMT中的一种或多种。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述调控植物木质素沉积包括：负向调控植物木质素沉积。
10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述调控植物表型包括：正向调控植物根长或植物在干旱胁迫条件下的根系活力。
技术领域
本发明涉及基因工程与分子育种技术领域，尤其涉及一种苎麻MYB转录因子及其应用。
背景技术
木质素是植物次生细胞壁的主要组分之一，对植物体的机械支撑、水分运输和抗逆防御起关键作用。然而，在特定应用场景下，过高的木质素含量却成为不利因素。例如：在纤维作物（如苎麻、亚麻）中，高木质素能使纤维粗硬变脆，影响纤维强力、色泽及弹性；在饲用作物（如苜蓿、饲用玉米）中，高木质素含量会严重降低饲料的消化率和营养价值；在果蔬作物中，木质化会影响口感与食用品质。因此，有效降低特定植物组织或特定生长阶段的木质素含量，具有重要的经济价值和生态意义。
目前，降低植物木质素含量的策略主要包括传统育种和基因工程。基因工程手段常通过抑制或敲除木质素合成通路中的关键酶基因（如PAL、C4H、4CL、CCR、CAD等）来实现。然而，直接抑制结构基因常导致木质素合成严重受阻，引起植物生长发育畸形、植株矮小、育性降低甚至致死等严重负面表型，且易因代谢补偿效应而导致其他酚类物质异常积累。因此，寻找能够在降低木质素的同时，维持甚至增强植物生长力（特别是根系发育）的基因资源，成为该领域的重要挑战。
转录因子作为上游调控元件，能够以更精细、更协调的方式调控整个代谢通路。利用负调控转录因子来抑制木质素合成，相比直接敲除木质素合成关键酶基因，可能实现对木质素含量的“微调”，在达到降低木质素目的的同时，最大程度减轻对植物正常生长发育的负面影响。目前，已报道的负调控木质素合成的MYB转录因子（如EgMYB1、TaMYB4等）数量有限，且其抑制效果、作用谱系和在不同物种中的保守性有待进一步挖掘与应用。
因此，从特定植物（如具有优质纤维、木质素含量相对较低的苎麻）中发掘新的、高效的负调控木质素合成的转录因子，对于开发新型的木质素改良技术，培育低木质素含量的优质作物品种，具有重要的理论与应用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种来源于苎麻的、新的负调控转录因子蛋白BnMYB6及其编码基因，该转录因子能够特异性抑制木质素合成通路关键基因的表达，从而有效降低植物的木质素含量；同时，还对植物的表型，尤其是植物根长和植物在干旱胁迫下根系活力具有显著的调控作用，对培育优质作物品种具有极大的应用价值。
本发明的技术方案是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种苎麻MYB转录因子，所述MYB转录因子为BnMYB6，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1序列具体为：
MGRSPCCEKAHTNKGAWTKDEDQRLIDYIRVHGEGCWRSLPKAAGLLRCGKSCRLRWINYLRPDLKRGNFTEEEDELIIKLHGLLGNKWSLIAGRLPGRTDNEIKNYWNTHIKRKLISRGLDPQTHRPLNDAAPPPPPPAAAAAKLHASARLDFRNASPAPAPADKRNNLSAPNTNTKLAIHPKAETIVFDEAARSNCTSSGTTTEEEDQRHDNIAHQHAHHRHVMTSDLHVAVNLELSIGLAPFQSRDQAHDSAAATRLSFANSAESKPLRVGNGVNSNGNNCNNYGQLFGGVGVCLCCQLGHQSSTELCRNCQASNAFFRFHNLPLNS。
在SEQ ID NO.1序列中的氨基酸经过取代、缺失，或添加一个或几个氨基酸，即与SEQ ID NO.1序列具有95%以上同源性且具有与SEQ ID NO.1相同调控效果的氨基酸序列也属于本发明保护范围。
第二方面，提供了一种苎麻MYB转录因子的基因，其编码如上所述的苎麻MYB转录因子。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2序列具体为：
ATGGGAAGGTCTCCTTGCTGCGAGAAAGCTCACACCAACAAAGGCGCTTGGACCAAAGACGAAGATCAACGCCTCATCGACTACATCCGCGTTCACGGTGAGGGCTGCTGGCGCTCCCTCCCCAAGGCCGCAGGGTTACTTAGATGCGGCAAGAGTTGCAGGCTGAGGTGGATAAACTACCTCCGACCCGACCTCAAGCGAGGGAATTTCACCGAAGAGGAAGACGAATTGATCATCAAGCTTCACGGCTTACTCGGAAATAAATGGTCACTGATAGCGGGAAGATTGCCGGGAAGAACTGACAACGAGATAAAAAACTACTGGAACACGCACATCAAGCGGAAACTCATAAGCCGCGGCCTCGACCCTCAGACGCACCGCCCCCTAAACGACGCCGCACCGCCGCCGCCACCACCCGCCGCCGCCGCCGCTAAATTACACGCCTCGGCCCGCTTGGACTTCAGAAACGCCTCCCCCGCGCCCGCGCCCGCCGATAAGCGCAACAACTTATCGGCACCCAATACCAATACCAAGCTTGCGATACACCCGAAAGCGGAAACCATAGTGTTCGACGAAGCCGCCAGGTCGAACTGCACGAGCAGCGGAACGACAACCGAGGAGGAGGACCAGCGACACGATAATATTGCCCACCAGCACGCTCACCACCGCCACGTGATGACCAGCGACCTCCACGTGGCGGTCAACCTGGAGCTCTCCATCGGCCTCGCGCCGTTCCAGTCACGTGACCAAGCCCACGACTCGGCCGCCGCGACTCGGCTGTCGTTCGCCAACTCGGCCGAGTCGAAACCGCTCCGAGTCGGTAACGGCGTGAATAGTAATGGCAATAACTGTAATAACTACGGTCAGTTGTTTGGTGGCGTTGGCGTGTGCCTGTGTTGCCAGTTGGGGCACCAAAGCAGCACCGAGTTGTGCAGGAATTGCCAAGCCTCAAATGCCTTCTTCAGATTTCACAATTTGCCTCTTAATTCATAG。
第三方面，提供了一种重组表达载体，其包含如上所述的苎麻MYB转录因子的基因。
第四方面，提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的苎麻MYB转录因子、如上所述的苎麻MYB转录因子的基因或如上所述的重组表达载体。
第五方面，提供了如上所述的苎麻MYB转录因子、如上所述的苎麻MYB转录因子的基因、如上所述的重组表达载体或如上所述的宿主细胞在调控植物木质素生物合成、木质素合成相关基因表达、植物木质素沉积和/或植物表型中的应用。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述调控植物木质素生物合成包括：负向调控植物木质素生物合成。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述调控木质素合成相关基因表达包括：负向调控木质素生物合成相关基因的表达；所述木质素生物合成相关基因包括AtPAL2、AtCAD4、AtCAD6、AtCCoAOMT1、At4CL5或AtCOMT中的一种或多种。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述调控植物木质素沉积包括：负向调控植物木质素沉积。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述调控植物表型包括：正向调控植物根长或植物在干旱胁迫条件下的根系活力。
本发明中还提供了一种降低植物木质素含量或改善植物相关品质的方法，所述方法包括：将编码所述BnMYB6转录因子的多核苷酸导入目标植物或植物细胞中，并使其过量表达或异源表达，从而负调控木质素合成相关基因的表达，降低所述植物的木质素含量；进一步优选的，通过农杆菌介导的遗传转化技术实现所述多核苷酸的导入与表达。
本发明的苎麻MYB转录因子相对于现有技术具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种来源于苎麻的、新的负调控转录因子蛋白BnMYB6及其编码基因，该转录因子能够特异性地调控植物木质素生物合成、木质素合成相关基因表达、植物木质素沉积和植物表型。
2、与野生型植物相比，本发明的转基因植物中：木质素合成通路关键基因（AtPAL2、AtCAD4、AtCAD6、AtCCoAOMT1、At4CL5、AtCOMT）的转录水平显著下调，转基因幼苗及成熟叶片木质素染色程度显著高于野生型，转基因植物中幼苗根系长度显著高于野生型对照植物，表现出增强的养分吸收潜力，此外，在模拟干旱胁迫下转基因植物幼苗根系活力显著高于野生型对照植物，表现出维持干旱胁迫下根系活力的潜力。在拟南芥、苎麻等植物新品种培育中具有极大的应用价值。
附图说明
图1为本发明转录因子BnMYB6基因克隆PCR电泳图，M：Marker、泳道1：BnMYB6基因扩增结果；
图1
图2为本发明转录因子BnMYB6蛋白的保守结构域预测和保守氨基酸分析图，其中的（A）图为SMART在线分析BnMYB6保守结构域图，（B）图为BnMYB6及其同源蛋白R2R3结构域的氨基酸序列比对结果图；
图2
图3为本发明转录因子BnMYB6转录激活活性检测图，其中的（A）图表示完整BnMYB6及其与VP16融合构建体在酵母体系中的转录活性检测图，（B）图表示BnMYB6不同结构域（N端与C端）分别与pGBKT7及pGBKT7-VP16融合后的酵母转录活性分析图；
图3
图4为本发明不同茎皮木质素沉积情况下BnMYB6及相关木质素合成基因表达水平图，其中的（A）图表示低木质素茎秆、茎秆横切及茎皮纤维木质素染色图，（B）图表示高木质素茎秆、茎秆横切及茎皮纤维木质素染色图，（C）图表示BnMYB6及苎麻木质素合成关键基因在高、低木质素茎皮中的表达模式图；
图4
图5为本发明转基因拟南芥植株PCR鉴定及BnMYB6基因过表达检测图，其中的（A）图表示PCR检测图，(B)图表示RT-PCR检测图，(C)图表示RT-qPCR检测图；
图5
图6为本发明转基因拟南芥植株与野生型植株的表型对比图，其中的（A）图表示野生型与转基因株系幼苗生长状况对比图，(B)图表示拟南芥幼苗木质素组织化学染色图，(C)图表示转基因拟南芥植株与野生型植株根系长度分析图，(D）图和（E）图表示成熟期野生型与转基因植株移栽后的生长情况比对图；
图6
图7为本发明转基因植株中木质素合成关键基因的表达水平图；
图7
图8为本发明转基因植株与野生型植株在干旱胁迫下的根系活力测定图。
图8
实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例1：本发明转录因子BnMYB6基因的克隆与序列分析
1.1 苎麻RNA的提取与cDNA合成
选取苎麻华苎5号嫩叶为材料，采用RNAprepPure多糖多酚总RNA提取试剂盒提取总RNA(TIANGEN，DP441)。采用反转录试剂盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物技术股份有限公司，AT311-03)反转录获得cDNA。具体步骤严格参照产品说明书进行。
1.2 BnMYB6基因的克隆与测序
以苎麻转录因子BnMYB6的CDS序列为参照设计特异性引物BnMYB6-F和BnMYB6-R，设计特异性引物序列如下：
BnMYB6-F：5’-ATGGGAAGGTCTCCTTGCT-3’（SEQ ID NO.3）；BnMYB6-R，5’-CTATGAATTAAGAGGCAAATTGTG-3’（SEQ ID NO.4）。
以步骤1.1获得的cDNA为模版，进行BnMYB6基因片段扩增，高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase扩增的反应体系如表1所示(25ul体系)：
表1
反应条件如表2所示：
表2
采用1.5%TAE琼脂糖凝胶电泳对反应液进行电泳检测，电泳检测结果(图1)显示，PCR扩增得到的目的片段的大小显示约为1000bp，与BnMYB6基因的大小相符。将检测正确的PCR产物送武汉天一华煜基因科技有限公司测序，得到测序结果，基因DNA序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
1.3 苎麻华苎5号BnMYB6氨基酸序列分析
将BnMYB6氨基酸序列提交到SMART在线分析工具进行保守蛋白结构域分析(http://smart.embl-heidelberg.de/)。结果显示（图2中的（A）图），苎麻华苎5号基因BnMYB6含有两个保守结构域。使用ClustalX软件对氨基酸序列进行多重序列比对，结果显示（图2中的（B）图），BnMYB6在N端具有高度保守的R2R3结构域，此外，在C端还鉴定出一个C1抑制基序。这些结果表明，BnMYB6可能是一个R2R3 MYB转录抑制因子。
实施例2：苎麻华苎5号BnMYB6转录激活活性分析
2.1 pGBKT7与pGBKT7-VP16载体酶切与回收
基因克隆引物接头序列中有EcoRⅠ与BamHI的酶切位点，对pGBKT7载体使用限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHI进行双酶切。双酶切体系(20μl)如表3所示：
表3
反应条件如表4所示：
表4
基因克隆引物接头序列中有BamHI的酶切位点，对pGBKT7-VP16载体使用限制性核酸内切酶BamHI进行单酶切。单酶切体系(20μl)如表5所示：
表5
反应条件同表4。
使用琼脂糖凝胶电泳分离双酶切反应后的长短两条片段，并采用胶回收试剂盒Wizard®SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega，A9281)进行PCR，对长片段进行切胶回收，具体步骤严格参照产品说明书进行。
2.2 含酶切位点的BnMYB6全长及截短片段载体构建
依据BnMYB6结构域特征将其截短为两个片段：BnMYB6N（包含N端及R2R3DNA结合域）与BnMYB6C（包含C1抑制基序及C端序列）。根据步骤1.7扩增的BnMYB6基因序列设计加接头引物。设计引物序列如表6所示：
表6
以步骤1.1获得cDNA为模版，以高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase扩增的反应体系与条件同步骤1.2。采用核酸纯化试剂盒Wizard® SV Gel and PCRClean-Up System(Promega，A9281)进行PCR产物纯化，具体步骤严格参照产品说明书进行。
采用同源重组试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme，C112)，将步骤2.2获得的基因片段通过同源重组的方式与步骤2.1获得的线性化载体连接，具体步骤严格参照产品说明书进行。用热激法导入大肠杆菌DH5α感受态并在卡那霉素平板上筛选阳性克隆，送武汉天一华煜基因科技有限公司完成测序。
2.3 转录激活活性分析
利用PEG/LiAC方法将阴性对照pGBKT7、阳性对照pGBKT7-VP16及步骤2.5获得的重组质粒pGBKT7-BnMYB6N、pGBKT7-BnMYB6C、pGBKT7-BnMYB6、pGBKT7-VP16-BnMYB6、pGBKT7-VP16-BnMYB6N、pGBKT7-VP16-BnMYB6C转入酵母AH109感受态细胞(Coolaber，CC300)中，具体步骤严格参照产品说明书进行。
挑取阳性酵母菌落点板于SD/-Trp和SD/-Ade-His-Trp平板上，暗培养3-5d。结果显示（如图3所示），在SD/-Trp平板上，包括阴性对照在内的所有转化子生长良好；在SD/-Ade-His-Trp上，只有pGBKT7-VP16-BnMYB6与pGBKT7-VP16-BnMYB6C可恢复酵母生长，但两者菌落形成能力均弱于阳性对照。表明BnMYB6具有转录抑制活性，且其N端与R2R3结构域是发挥转录抑制功能所必需的。
实施例3：BnMYB6基因在高和低木质素沉积的苎麻茎皮中的表达水平分析
分别选取将高木质素沉积和低木质素沉积的苎麻茎秆，FAA固定液（70%乙醇：冰醋酸：甲醛=90：5：5）固定24h。乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡浸蜡后包埋。旋转切片机切取横切或纵切片（8-12μm），40℃展片烘片固定。二甲苯脱蜡，乙醇梯度复水。木质素组织化学染色采用Wiesner染色法，2%间苯三酚溶液浸泡10min，18%盐酸反应5min，在显微镜下观察并拍照。结果如图4所示（图4的（A）和（B）图），与高木质素沉积的苎麻茎皮相比，低木质素沉积的苎麻茎皮颜色更浅，木质素染色强度更低。
以高木质素沉积和低木质素沉积的苎麻茎皮为材料提取总RNA，反转录获得cDNA，步骤同1.1。
将获得的cDNA为模板，采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，Q711-02)、BnMYB6基因荧光定量引物及木质素合成基因荧光定量引物进行荧光定量PCR。同时以Bne1Fα基因为内参基因。设计引物序列如表7所示：
表7
反应体系(10ul)如表8所示：
表8
反应条件如表9所示：
表9
图4中的（C）图显示，与高木质素沉积的苎麻茎皮相比，低木质素沉积的苎麻茎皮中木质素合成相关基因BnPAL、BnCCR1、BnCCoAOMT、BnCOMT1、BnCAD的表达水平显著降低，但BnMYB6基因表达水平显著增加。这些结果表明，BnMYB6可能负调控木质素生物合成。
实施例4：植物过表达载体的构建
4.1 过表达载体pCAMBIA2300双酶切及纯化
基因克隆引物接头序列中有BamHI与XbaⅠ的酶切位点，实验使用限制性核酸内切酶BamHI、XbaⅠ进行双酶切。双酶切体系(20μl)如表10所示：
表10
反应条件如表11所示：
表11
对长片段进行切胶回收(同步骤2.1)。
4.2 含酶切位点的BnMYB6过表达载体构建
根据实例1扩增的BnMYB6基因序列设计加接头引物，上游引物加入BamHⅠ酶切位点，下游引物加入XbaⅠ酶切位点。设计引物序列如下：OE-BnMYB6-F：5’-CTTGGAATTCCTGCTGGATCCATGGGAAGGTCTCCTTGCT-3’（SEQ ID NO.31），OE-BnMYB6-R：5’-CTCTTCGAACCCGGGTCTAGACTATGAATTAAGAGGCAAATTGTGA-3’（SEQ ID NO.32）。
以步骤1.1获得cDNA为模版，以高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase扩增的反应体系与条件同步骤1.2。采用核酸纯化试剂盒Wizard ® SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega，A9281)进行PCR产物纯化，具体步骤严格参照产品说明书进行。
采用同源重组试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme，C112)，将步骤4.2获得的基因片段通过同源重组的方式与步骤4.1获得的线性化载体连接，具体步骤严格参照产品说明书进行。用热激法导入大肠杆菌DH5α感受态并在卡那霉素平板上筛选阳性克隆，送武汉天一华煜基因科技有限公司完成测序。
实施例5：转基因拟南芥的获得与鉴定
5.1 转基因拟南芥的获得
将步骤4.2获得的重组载体pCAMBIA2300-35S::BnMYB6转入农杆菌GV3101感受态细胞中，具体步骤严格参照产品说明书进行。通过花序浸染法将野生型拟南芥花序浸入含有pCAMBIA2300-35S::BnMYB6重组载体的农杆菌GV3101菌液中，轻微振荡20-30s，正常培养条件下将侵染后的拟南芥培养至种子成熟，即可收获种子。收获转化过后成熟的拟南芥种子在MS/Kana（Kana 100mg/L）固体培养基上进行筛选，生长状态正常，幼苗呈绿色的即可判定为初筛阳性株系。待阳性植株成熟并收获T1代种子。经过两代筛选之后，阳性植株率达到较高比例，逐渐获得T3代纯合株系。
5.2 转基因拟南芥的PCR鉴定
选取T3代转基因拟南芥纯合体及野生型拟南芥叶片为材料，采用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(上海生工，B518261-0100)提取基因组，具体步骤严格参照产品说明书进行。
将基因组DNA和pCAMBIA2300-35S::BnMYB6质粒DNA稀释到100ng/μl，用作扩增基因模板，以p2300-F/p2300-R为引物，扩增目的基因。引物序列如下：p2300-F：5’-GGCAAGCTTGGAATTCCTGCT-3’（SEQ ID NO.33），p2300-R：5’-CTCTTCGAACCCGGGTCTAGA-3’（SEQ ID NO.34）。
反应体系(25μl)如表12所示：
表12
反应条件如表13所示：
表13
采用1.5%TAE琼脂糖凝胶电泳对反应液进行检测。电泳结果（如图5中的（A）图）显示，除野生型对照外，所检测的8个独立转基因株系中均扩增出目的基因特异性条带，证实获得阳性转基因株系。
5.3 转基因拟南芥的半定量PCR鉴定
选取T3代转基因拟南芥纯合体及野生型拟南芥叶片为材料，采用Trizol法提取总RNA，反转录获得cDNA，步骤同1.1。将获得的cDNA为模板，以qBnMYB6F/qBnMYB6R为引物，进行半定量PCR。反应体系与条件同步骤5.2。
采用1.5%TAE琼脂糖凝胶电泳对反应液进行检测。电泳结果（如图5中的（B）图）显示，除野生型对照外，所检测的8个独立转基因株系中均扩增出目的基因特异性条带，进一步证实获得阳性转基因株系。
5.4 BnMYB6基因表达水平检测
为检测整合到基因组上目的基因BnMYB6在转基因拟南芥株系中表达情况，将步骤5.3获得的cDNA为模板，采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，Q711-02)和引物qBnMYB6F/qBnMYB6R进行荧光定量PCR，反应体系与条件同实例3。同时以AtActin基因为内参基因。设计引物序列如下：qAtActin-F：5’-GCCATCCAAGCTGTTCTCTC-3’（SEQ ID NO.35），qAtActin-R：5’-CAGTAAGGTCACGTCCAGCA-3’（SEQ ID NO.36）。
结果显示（如图5中的（C）图）：BnMYB6在转基因拟南芥株系中的表达量均显著高于野生型，表明BnMYB6基因在拟南芥中成功过表达。
实施例6：转基因拟南芥的表型与木质素分析
6.1 转基因拟南芥的表型
选取饱满的T3代转基因拟南芥纯合体株系与野生型拟南芥种子为材料，将转基因拟南芥种子点播在添加100mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上培养5d，野生型拟南芥种子点播在1/2MS培养基上培养5d后，将幼苗转移至1/2MS培养基上垂直培养3d，拍照记录，测量根长度，进行统计分析。结果显示（如图6中的（A）和（C）图），转基因拟南芥的根长显著长于野生型拟南芥。表明BnMYB6过表达能促进拟南芥幼苗根的伸长。
同时，选取饱满的T3代转基因拟南芥纯合体株系与野生型拟南芥种子为材料，培养10天后移栽至营养土中继续生长。3周后观察成苗表型，结果显示（如图6中的（D）和（E）图），转基因拟南芥与野生型拟南芥的成苗形态无明显差异。表明BnMYB6过表达不影响拟南芥成苗形态。
6.2 转基因拟南芥中木质素染色
木质素组织化学染色采用Wiesner染色法，步骤同实例3。结果显示（如图6中的（B）图），转基因拟南芥株系幼苗木质素染色程度较野生型显著减弱，表明BnMYB6基因对拟南芥幼苗木质素沉积具有负向调控作用。
6.3 转基因拟南芥中木质素合成相关基因的表达情况
将步骤5.3获得的cDNA为模板，采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，Q711-02)进行荧光定量PCR。同时以AtActin基因为内参基因。设计引物序列如表14所示：
表14
反应体系与条件同实例3。结果显示（如图7），相比于野生型拟南芥，转基因植株中木质素合成关键基因AtPAL2、AtCAD4、AtCAD6、AtCCoAOMT1、At4CL5、AtCOMT的表达水平显著下调。这些结果表明，过表达BnMYB6抑制了木质素生物合成相关基因的表达。
实施例7：过表达BnMYB6增强植株对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性根系长度及活性测定
7.1 根系活力标准曲线的制作
(1)制备0.1mol/L磷酸缓冲液PBS(pH=7.0-7.2)：取约61mLA液(0.2mol/LNa2HPO4)与39mLB液(0.2mol/LNaH2PO4)混合，用pH计调节至pH=7.0-7.2，加蒸馏水稀释至总体积200mL，即得0.1mol/LPBS。4℃保存备用。
(2)制备TTC工作液(0.4%，w/v)：称取0.4gTTC粉末，用上述0.1mol/LPBS溶解并定容至100mL棕色容量瓶。此为储备液，4℃避光保存，一周内有效。
(3)制备TTF储备液：取500μL0.4%TTC(需2mgTTC粉末)加入2mL0.1MPBS。然后加入过量Na2S2O4（一勺尖），确保TTC被全部还原。再加入5mL乙酸乙酯萃取1min，确保无机相无色，将有机相转移至新的10mL离心管中，用乙酸乙酯定容至10mL，4℃保存。MTTC：334.39g/mol，MTTF：340.37g/mol；mTTF=2.0·(340.37/334.39)=2.036mg；c储=2.036/10=0.2036mg/mL=203.6μg/mL。
(4)梯度稀释TTF，用乙酸乙酯定容至1mL。
(5)吸光值测定：分别吸取200μLTTF标准稀释液至96孔板中，测定485nm处吸光值，记为A标准；吸取200μL乙酸乙酯至96孔板中，测定485nm处吸光值，记为A空白；计算ΔA标准=A标准-A空白。注：各浓度标准管和空白管只需测定1-2次。
(6)标准曲线的建立：以40μg/mL、30μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mLTTF标准稀释液浓度为横坐标(x)，以其对应的ΔA标准为纵坐标(y)，绘制标准曲线，得到线性回归方程y=kx+b（R2≥0.99）。
7.2 过表达BnMYB6植株对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性根系长度及活性测定
选取饱满的T3代转基因拟南芥纯合体株系与野生型拟南芥种子为材料，将转基因拟南芥种子点播在添加100mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上培养7d，野生型拟南芥种子点播在1/2MS培养基上培养7d后，将幼苗转移至干旱胁迫(1/2MS+200mM甘露醇)培养基上垂直培养10d后测量其根系活力。
步骤如下：
(1)样品：取幼苗根系，三株幼苗为一组，称量根重，放入10mL离心管中，每组5个重复，做好标记；
(2)反应：向各管中加入5.0mL0.1MPBS和5.0mL0.4%TTC工作液，放入37℃培养箱中，避光培养3-4h；
(3)终止：向各管加入1.0mL1MH2SO4；
(4)倒掉液体，取出根系；取出部分根系用体式显微镜拍照，其余的用滤纸吸干水分；
(5)将根装入2mL离心管中，冷冻研磨，研磨后加入乙酸乙酯，定容至2mL。4000rpm离心10min，取上清液，485nm波长测定吸光值；
根据计算公式：根系活力[μgTTF/(g·h)]=(X·VSE)/(W·T)；注释：X：根据标准曲线得出的TTF理论浓度；VSE：反应体系中使用乙酸乙酯定容的总体积；W：反应体系中加
入待测样本的质量；T：37℃避光反应时间。
结果如图8所示，在干旱胁迫条件下（200mM甘露醇），转基因拟南芥的根系活力显著高于野生型拟南芥。表明BnMYB6过表达正向调控拟南芥在干旱胁迫条件下的根系活力。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
文章摘自国家发明专利，一种苎麻MYB转录因子及其应用，发明人:贾郭平安，石文静，易旸，汪文学，付珊，陈亮，申请号:202610303051.4，申请日:2026.03.13。
