摘 要：本申请涉及工业大麻分子标记辅助育种技术领域，特别是一种与工业大麻子叶数关联的KASP标记及其应用，本发明提供的分子标记位于工业大麻的第9号染色体上，为CanS900003和/或CanS900004；所述CanS900003的序列如SEQ IDNO .1所示，从5’端起的201bp处呈现G/A多态性；所述CanS900004的序列如SEQ ID NO .2所示，从5’端起的201bp处呈现A/C多态性。本发明通过挖掘3子叶大麻相关的优异等位变异SNP分子标记位点，成功开发KASP分子标记技术。这一技术的应用，不仅能有效辅助工业大麻性状改良选择，还能避免传统育种筛选过程繁杂耗时，缩短育种周期，从而大幅度提提升工业大麻分子育种的效率和精准度。

 

权利要求书

1 .工业大麻子叶数关联的KASP分子标记，其特征在于，所述分子标记位于工业大麻的第9号染色体上，为CanS900003和/或CanS900004；所述CanS900003的序列如SEQ ID NO .1所示，从5’端起的201bp处呈现G/A多态性；所述CanS900004的序列如SEQ ID NO .2所示，从5’端起的201bp处呈现A/C多态性。

2.用于扩增权利要求1所述分子标记的引物，其特征在于，扩增CanS900003分子标记的引物如SEQ ID NO .3～5所示；扩增CanS900004分子标记的引物如SEQ ID NO .6～8所示。

3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含用于扩增权利要求1所述分子标记的引物。

4.权利要求1所述的分子标记，或权利要求2所述引物，或权利要求3所述的试剂盒在工业大麻分子标记辅助育种中的应用。

5.权利要求1所述的分子标记，或权利要求2所述引物，或权利要求3所述的试剂盒在区分2子叶和3子叶工业大麻品种中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，当KASP标记检测结果CanS900003从5’端起的201bp处为单倍型AA，CanS900004为单倍型CC时，待检工业大麻为3子叶工业大麻；当KASP标记检测结果CanS900003从5’端起的201bp处为单倍型GG，CanS900004单倍型AA时，工业大麻为2子叶工业大麻。

7 .一种使用权利要求1所述分子标记选育3子叶工业大麻的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获得待测样品基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的引物进行竞争性等位基因特异性PCR反应扩增；

(3)PCR反应结束后，收集每个反应孔产生的荧光信号，根据荧光信号的类型判断分子标记的基因型，当KASP标记检测结果CanS900003从5’端起的201bp处为单倍型AA，CanS900004为单倍型CC时，待检样品为3子叶工业大麻。

8.一种分子标记筛选3子叶工业大麻的方法，其特征在于，包括以下步骤：检测样品,分子标记位点CanS900006和 CanS900004的单倍型，当检测结果CanS900006从5’端起的201bp处单倍型为GG和 CanS900004从5’端起的201bp处为单倍型为CC时，判断为工业大麻为3子叶工业大麻，所述CanS900004的序列如SEQ ID NO .2所示，所述CanS900006的序列如SEQ IDNO .9所示。

9.一种生物材料YMT，其特征在于，所述生物材料分类命名为工业大麻突变体材料，保藏号CGMCC No.33028。

 

技术领域

本申请涉及工业大麻分子标记辅助育种技术领域，特别是一种与工业大麻子叶数关联的KASP标记及其应用。

 

背景技术

大麻(Cannabis sativaL .)为大麻科（Cannabinaceace）大麻属（Cannabis）一年生草本植物。在我国，大麻的种植与利用具有悠久的历史，其别名包括汉麻、火麻、线麻、魁麻、寒麻等。作为一个古老、传统且重要的经济植物资源，大麻在我国的纤维或食用种植与利用历史已逾五千年。工业大麻（Industrial Hemp）是指大麻植株干物质中四氢大麻酚（THC）含量低于0 .3％的大麻品种类型。工业大麻其在在纺织、造纸、建筑、医药以及土壤生态修复等多个领域的广泛的应用前景而备受瞩目，其多用途正逐步被人们认识、开发及利用。

在植物界中，植物的多子叶变异现象在多种植物中已被报道，其中一些变异现象属于自然发生的突变，而另一些则是通过人工诱导产生的。在双子叶植物的种子内，子叶作为重要的营养器官，在胚胎发育的初期阶段形成，并为幼苗的早期生长提供必要的营养支持。此外，子叶的发育过程对于胚胎极性发育的至关重要，因此，对子叶的发育机制的研究有助于揭示整个胚胎发育的调控原理。具有显著表型突变且能够稳定遗传的多子叶突变株的发现，无疑将推动该研究领域的快速发展。本项发明通过对双胚工业大麻材料大量的3子叶纯化筛选，获得高世代的稳定3子叶工业大麻群体，与传统的2子叶工业大麻相比，3子叶工业大麻表现出更优越的生长势，且叶片数量显著超过正常的双子叶工业大麻群体。这一发现可能暗示着工业大麻的子叶数和叶片数量之间存在一定的相关性。鉴于工业大麻叶片的数量直接关联到工业大麻的产量，因此筛选并培育3子叶工业大麻新品种，对于提高工业大麻花叶产量具有重要的实践意义。

KASP（Kompetitive Allele?Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR）技术利用荧光探针的特异性识别能力，精确地对基因位点进行分型，从而实现对SNP（单核苷酸多态性）位点的快速检测。相较于SSR、RFLP、InDel等分子标记技术，KASP标记技术以其检测速度快、成本低以及易于规模化应用等优势。KASP标记技术无需根据DNA片段大小进行分型，从而摆脱传统凝胶电泳等步骤繁琐、通量较低的检测方法束缚，更加契合当前飞速发展的高通量分子检测平台的需求。因此，开发低成本、适合于高通量分子检测平台的3子叶工业大麻相关基因KASP分子标记，对于推广和普及分子标记技术的应用，提高我国优良性状工业大麻相关育种工作的效率和水平，具有重要意义。

 

发明内容

本发明的主要目的是开发一种与工业大麻子叶数关联的KASP标记及其应用技术。该技术以开发低成本、适合于高通量分子检测平台的3子叶工业大麻相关基因KASP分子标记技术体系。通过推广这一分子标记技术的应用，本发明预期将显著提升我国在优良性状工业大麻品种培育方面的效率和水平，进而推动该领域的科技进步与产业的健康发展。

具体的，本发明提供以下技术方案：

工业大麻子叶数关联的KASP分子标记，所述分子标记位于大麻的第9号染色体上，为CanS900003和/或CanS900004；所述CanS900003的序列如SEQ ID NO .1所示，从5’端起的201bp处呈现G/A多态性；所述CanS900004的序列如SEQ ID NO .2所示，从5’端起的201bp处呈现A/C多态性。

进一步的，提供一种用于扩增所述分子标记的引物，其特征在于，扩增CanS900003分子标记的引物如SEQ ID NO .3～5所示；扩增CanS900004分子标记的引物如SEQ ID NO .6～8所示。

进一步的，提供一种一种试剂盒，所述试剂盒含用于扩增所述分子标记的引物。

进一步的，提供一种所述的分子标记，或所述引物，或所述的试剂盒在工业大麻分子标记辅助育种中的应用。

进一步的，提供一种所述的分子标记，或所述引物，或所述的试剂盒在区分2子叶和3子叶工业大麻品种中的应用。

进一步的，所述的应用，当KASP标记检测结果CanS900003从5’端起的201bp处为单倍型AA，CanS900004为单倍型CC时，待检大麻为3子叶工业大麻；当KASP标记检测结果CanS900003从5’端起的201bp处为单倍型GG，CanS900004单倍型AA时，大麻为2子叶工业大麻。

进一步的，提供一种使用所述分子标记选育3子叶工业大麻品种的方法，包括以下步骤：

(1)获得待测样品基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的引物进行竞争性等位基因特异性PCR反应扩增；

(3)PCR反应结束后，收集每个反应孔产生的荧光信号，根据荧光信号的类型判断分子标记的基因型，当KASP标记检测结果CanS900003从5’端起的201bp处为单倍型AA，CanS900004为单倍型CC时，待检样品为3子叶工业大麻。

一种分子标记筛选3子叶工业大麻的方法，包括以下步骤：检测样品,分子标记位点CanS900006和 CanS900004的单倍型，当检测结果CanS900006从5’端起的201bp处单倍型为GG和 CanS900004从5’端起的201bp处为单倍型为CC时，判断为工业大麻为3子叶工业大麻，所述CanS900004的序列如SEQ ID NO .2所示，所述CanS900006的序列如SEQ ID NO .9所示。

一种生物材料YMT，所述生物材料分类命名为工业大麻突变体材料，保藏号CGMCCNo.33028。

本发明所实现的技术效果在于：

本发明成功开发了与工业大麻子叶数量关联的KASP分子标记技术。通过挖掘与3子叶工业大麻相关优异等位变异SNP分子标记位点，开发KASP分子标记。本技术不仅为工业大麻的3子叶分子育种提供了有力工具，而且为大麻种质资源分析带来了新的检测技术。此外，该技术在辅助工业大麻性状改良，可有效避免传统育种筛选的繁杂耗时问题，从而缩短育种周期，显著提升工业大麻分子育种的效率。

与传统的2子叶工业大麻相比，3子叶工业大麻表现出更优越的生长势，且叶片数量显著超过2子叶工业大麻群体。鉴于工业大麻叶片的数量直接关系到工业大麻的产量，筛选并培育3子叶工业大麻新品种，可显著提高工业大麻花叶产量，提升经济效益。

 

附图说明

图1 杂交F1代2子叶、3子叶和4子叶的分离现象表型图；

  

图1

图2  2子叶工业大麻和3子叶工业大麻群体苗期长势对比图；

  

图2

图3 标记位点CanS900003 KASP分型示意图；

 

 

图3

其中AA类分型表示样品在这个KASP标记位点为纯合AA基因型（分型图中标为红色，位于图形左上角），GG类分型表示样品在这个KASP标记位点为纯合GG等位基因型（分型图中标为蓝色，位于图形右下角），GA类型表示样品在这个KASP标记位点为杂合基因型（分型图中标为紫色）；

图4 标记位点CanS900004 KASP分型示意图；

  

图4

其中CC类分型表示样品在这个KASP标记位点为纯合CC基因型（分型图中标为红色，位于图形左上角），AA类分型表示样品在这个KASP标记位点为纯合AA基因型（分型图中标为蓝色，位于图形右下角），AC类型表示样品在这个KASP标记位点为杂合基因型（分型图中标为紫色）；

图5 工业大麻样品群体CanS900003位点KASP检测统计结果图；

  

图5

图6 工业大麻样品群体CanS900004位点KASP检测统计结果图；

  

图6

图7 工业大麻样品群体CanS900003和CanS900004双标记位点KASP检测统计结果图；

  

图7

AC表示标记CanS900003为AA基因型，CanS900004为CC基因型；GA表示标记CanS900003为GG基因型，CanS900004为AA基因型。

图8 工业大麻样品群体CanS900006位点KASP检测统计结果图；

  

图8

图9 工业大麻样品群体CanS900006和CanS900004双标记位点KASP检测统计结果图；

  

图9

GC表示标记CanS900006为GG基因型，CanS900004为CC基因型；TA表示标记CanS900006为TT基因型，CanS900004为AA基因型，HH表示杂合群体。

 

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

工业大麻子叶数关联的KASP分子标记位点

双胚的突变体植株生物材料YMT，生物材料分类命名为工业大麻突变体材料，保藏号CGMCC No .33028，保藏日期2025年09月02日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，该生物材料于2025年09月02日由保藏中心收到，并登记入册，该生物材料的存活性由保藏中心于2025年09月02日检测，结果为存活。

筛选种质资源获得工业大麻双胚材料（云麻11号），利用双胚的突变体植株（编号为YMT）作为母本，与正常的二倍体工业大麻品种（云麻10号）杂交，F1代出现2子叶、3子叶和4子叶的分离群体，选择F1代的具有3子叶群体进行自交，观察并统计2子叶和3子叶比例，及时剔除具有2子叶的植株，通过5?6代自交的纯化选择后，对高世代分离群体进行构建2子叶（30株）和3子叶（30株）的极端混池（BSA）进行测序。由图2可以看出，3子叶工业大麻的真叶数量显著高于2子叶工业大麻。

以GCF_029168945 .1_ASM2916894v1为参考基因组进行基于ED法的BSA（BulkedSegregant Analysis）分析(Hill J T , Demarest B L , Bisgrove B W , 2013)，在第9染色体定位到与子叶数相关的基因区间，并筛选目标区间显著性高的SNP位点，SNP位点CanS900003（Chr9：SNP_1318994）、CanS900004（Chr9：SNP_1350788）和CanS900006（Chr2：SNP_75387599），提取SNP位点上下游至少150bp侧翼序列，对待开发位点进行序列拷贝数、序列GC含量等分析，序列都只能比对到基因组上唯一的物理位置，是非重复序列，序列信息如表1所示：

表1 目标SNP位点及侧翼序列信息

   

实施例2

KASP分子标记试剂盒和检测方法

利用Bacthprimer 3软件对SNP位点和侧翼序列设计引物，每组KASP标记由2条特异性引物和1条通用引物组成，引物序列信息如表2所示，在特异性引物的5’端连上了荧光接头序列（GAAGGTGACCAAGTTCATGCT为FAM荧光接头序列；GAAGGTCGGAGTCAAC GGATT为HEX荧光接头序列）。

表2 根据目标SNP位点侧翼序列设计的KASP标记引物序列

  

KASP标记验证用96份样品在Douglas Scientific 的Array Tape系统进行。DNA

样品提取与质控：利用磁珠法对样品组织进行 DNA 提取，用 Qubit 荧光定量仪检测 DNA样品的浓度；用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 样品的完整性，质控合格的DNA样品用于标记检测。用NEXAR进行PCR体系组装，PCR反应体系如下表3所示：

表3. KASP反应体系

  

用SOELLEX进行PCR扩增，Touch down PCR扩增条件如下：

 

PCR 反应完成后用ARAYA进行反应体系荧光信号扫描；然后用INTELLICS进行数据分析和基因型分型。标记CanS900003的分型示意图如图3所示，标记CanS900004的分型示意图如图4所示。

实施例3

针对子叶的叶片数为2叶和3叶的3 4 8份工业大麻材料，采用实施例2中对CanS900003和CanS900004设计的KASP引物试剂盒对348份材料进行基因型检测，检测结果显示这两个标记物在348份材料中检出的基因型与对应的大麻子叶型一致，如图5、6所示，采用这两个标记物分别检测和结合检测均可以极显著区分2子叶工业大麻和3子叶工业大麻，当KASP标记CanS900003为AA基因型时子叶数较GG基因型多，当标记CanS900004基因型为CC基因型时子叶数较AA基因型多。如图7所示，利用标记CanS900003和CanS900004同时进行筛选时，标记CanS900003为AA和CanS900004为CC（简称AC）基因型的大麻多为3子叶工业大麻；反之，标记CanS900003为GG和CanS900004为AA（简称GA）基因型的大麻多为2子叶大麻，差异达极显著水平。

将检测群体材料扩增至635个样本，如图8所示，当标记CanS900006基因型为GG基因型时子叶数较TT基因型多，标记效果差异显著，可显著区分2子叶工业大麻和3子叶工业大麻。如图9所示，利用位于不同染色体的标记CanS900006和CanS900004同时进行筛选时，CanS900006标记位点为GG和CanS900004标记位点为CC（简称GC）基因型的大麻多为3子叶工业大麻，效果差异显著，经统计，3子叶工业大麻检出率达到67 .3%，标记位点少，成本低廉，检测便捷。

综上，本发明挖掘出与大麻子叶数相关的SNP分子标记位点，开发KASP分子标记，以辅助工业大麻子叶性状改良，可避免繁杂耗时的筛选过程、缩短育种年限，提高大麻分子育种的效率。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

 

文章摘自国家发明专利,一种与工业大麻子叶数关联的KASP标记及其应用,发明人:许艳萍，吕品，黄琳，杨明，陈璇，张园，字雪靖，郭孟璧，张庆滢，郭蓉,申请号:202511936015.3,申请日:2025.12.22。