标准类别： NY-行业标准（农业）
关键词： 固氮菌肥料
标准号： NY 411—2000
标准名称： 固氮菌肥料*
标准分类： 农业土壤化肥标准
颁布部门：
颁布日期：
实施日期：
1 范围
本标准规定了固氮菌肥料产品的分类、技术要求、检验方法、检验规则、包装、标识、运输、贮存等。
本标准适用于含有益的固氮菌、能在土壤和多种作物根际中固定空气中的氮气，供作物氮素营养，又能分泌激素刺激作物生长的活体制品。本标准也适用于以固氮菌为主的含有能促进固氮、生长的植物促生根际细菌（PGPR）的复合固氮菌肥料。
2 引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
GB/T625—1989 化学试剂 硫酸
GB/T629—1997 化学试剂 氢氧化钠
GB/T1250—1989 极限数值的表示方法和判定方法
GB/T6543—1986 瓦楞纸箱
GB/T6682—1992 分析实验室用水规格和试验方法
3 定义
本标准采用下列定义。
3 1 自生固氮菌
在土壤里能固定空气中的氮，供作物氮素营养，又能分泌激素刺激作物生长的微生物。
3 2 根际联合固氮菌
既依赖根际环境生长，又在根际中固定空气中的氮气，对作物的生长发育产生积极作用的微生物。
3 3 固氮效能
固氮菌每消耗
4 产品分类
4 1 按剂型不同分为 液体固氮菌肥料、固体固氮菌肥料和冻干固氮菌肥料。
4 2 按菌种及特性分为 自生固氮菌肥料、根际联合固氮菌肥料、复合固氮菌肥料。
5 技术要求
5 1 菌种
在含一种有机碳源的无氮培养基中能固定分子氮，并具有一定的固氮效能。菌体一般为短杆状（固氮螺菌属菌体呈螺旋状），革兰氏染色阴性。
5 1 1 自生固氮菌
用固氮菌属（ Azotobacter）、氮单胞菌属（ Azomonas）的菌种，也可用茎瘤根瘤菌（ Azorhizo biumcaulinodans）和固氮芽胞杆菌（ Paenibacillusazotofixans）菌株。
5 1 2 根际联合固氮菌
可用下列菌种 固氮螺旋菌（ Azospirillum）；阴沟肠杆菌（ Enterobactercloacae）经鉴定为非致病菌的菌株；粪产碱菌（ Alcaligenesfaecalis）经鉴定为非致病菌的菌株；肺炎克氏杆菌（ Klebsiellapneumoniae）经鉴定为非致病菌的菌株。
使用本准则规定之外的菌种生产固氮菌肥料时，菌种必须经过鉴定，并符合 5 1要求。
生产固氮微生物肥料所使用的菌种，必要时还要进行菌种染色鉴别（见附录 B）和菌种固氮效能测定（见附录 C）。
5 2 成品技术指标（见表 1）
表 1 成品技术指标
指标 剂型
液 体 固 体 冻 干
项目
乳白或淡褐色液体， 黑褐色或褐色粉状，
外观、气味 混浊，稍 有 沉 淀，无 湿润、松 散，无 异 臭 乳白色结晶，无味
水分，% — 25 0! 35 0 3 0
pH值 5 5! 7 0 6 0! 7 5 6 0! 7 5
细度，过孔径 0
的筛余物，% #
有效活菌数，个 /mL（个 /g、个 / 5 0 108 1 0 108 5 0 108
瓶） $
杂菌率1），% $ 5 0 15 0 2 0
有效期，2），月 # 3 6 12
1）其中包括 10-6马丁培养基平板上无霉菌。
2）此项仅在监督部门或仲裁检验双方认为有必要时才检测。
6 抽样
按每一发酵罐菌液制成的产品为一批，逐批抽样检验。抽样过程要严格避免杂菌污染。
6 1 抽样工具及用品
抽样前预先准备好无菌塑料袋（或塑料瓶）、金属勺、剪刀、封口机、牛皮纸封样袋、标签、抽样封条和胶水。
6 2 抽样数量及抽样方法
在成品库抽样，可按“ ”形分层设点抽取，抽样以件为单位，小包装产品以一包装箱为一件。大包装（30!
400件者，按超过部分的 2%增加抽样件数，但总件数不要超过 40件。
每件包装产品抽取一小袋，在无菌条件下每袋取样
液体产品每件吸取 10mL，一同放入无菌的三角瓶中，混匀后分成两份，每份 250mL。冻干产品，每件取一支放入无菌的三角瓶中，加无菌液体培养液，溶解混匀后分成两份，每 份 50mL。贴上标签和封条（一份被抽样单位留存，一份交检测中心检测）。
7 检验方法
7 1 仪器设备及试剂
7 1 1 仪器设备
生物显微镜（10 100）；
菌落计数器；
恒温培养箱；
恒温干燥箱，
恒温摇床；
灭菌锅；
无菌室或超净工作台；
酸度计；
试管 %
培养皿 直径
三角瓶 500mL；
无菌吸管 0 5、1、5、10mL；
玻璃刮刀；
滤纸；
酒精灯；
标准筛 孔径 0
1号羊毛画笔；
无菌水；
无离子水。
7 1 2 试剂
选择培养基（见附录 A）；
刚果红染液（0 5%）。
7 2 成品检验
7 2 1 气味检验
取固氮菌肥料样品打开包装，进行感观检验。
7 2 2 外观检验
将固体固氮菌肥料包装打开，装在白色搪瓷盘中，将液体固氮菌肥料摇匀，在明亮光线下进行感观检验。
7 2 3 pH值测定
液体固氮菌肥料的 pH值测定：取供检菌液直接测定 pH值，取三次测定结果的平均数。固体固氮菌肥料的 pH值测定：取 50mL烧杯一个，加入菌肥
7 2 4 含水量测定
称取固体固氮菌肥三份，每份 20
含水量（ m
%）= 0-m1
m 100 …………………………（1）
0
式中 m0———烘干前样品质量，g；
m1———烘干后样品质量，g。
7 2 5 吸附剂颗粒细度测定
称样 10
（精确至 0
样品质量 100 …………（2）
7 2 6 有效活菌数和杂菌含量测定
采用平板计数法测定有效活菌数及杂菌率。
7 2 6 1 测定步骤
采样应不少于
30min，即成母液的菌悬液。
用无菌吸管吸取 5mL上述母液的菌悬液加入 45mL无菌水中，混匀成 1 10稀释的菌悬液，这样依次稀释，分别得到 1 1 102，1 1 103，1 1 104，1 1 105等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。
用 0 5mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液 0 1mL，加至直径为
杂菌数是指在选择培养基上，除有效活菌外的其他菌的菌落数与马丁培养基上霉菌数之和。马丁培养基 10-4稀释度菌悬液加样，操作步骤同样品有效活菌数检测操作。
7 2 6 2 允许差
平行样品误差按式（3）计算，并应符合表 2的规定。
*= %（x--x）
( n-1 …………………………………（3）
式中 *———单一标准差；
x———同一个稀释度任一个平板测定值；
-x———同一个稀释度平板测定的平均值；
n———重复次数。
表 2 平板上菌落数对应的单—标准差
平板上菌落数，个 /皿 30! 50 51! 99 100! 300
单一标准差， 10 0 20 0 50 0
7 2 6 3 测定结果的计算
按式（4）、式（5）计算样品的有效活菌数及杂菌率
有效 活 菌 数（ 个 /g）=菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 母液菌悬液的体积（mL）
菌剂克数或毫升数
1
加样量（mL） ……………………………………………………………………………（4）
杂菌率（%）= 杂菌数
有效菌数 +杂菌数 100 ……………………（5）
7 2 7 有效期检验在产品说明书标明的有效期到达前 10d测定扰品各项指标，方法同7 2 1! 7 2 6。
8 检验规则
8 1 检验分类
8 1 1 产品出厂检验
产品交货时进行的检验。
8 1 2 产品型式检验
新产品鉴定或国家质检机构质量监督检验。
8 2 检验项目
型式检验的检验项目按 5 2要求进行。出厂检验不检有效期。
8 3 判定规则
8 3 1 合格产品：
a）检验结果符合 5 2所规定的技术指标的产品为合格产品；
b）产品有效活菌数符合指标，杂菌率不符合指标，但小于本标准规定的两倍时（液体10%、固体 30%、冻干瓶 4%），而且在马丁培养基平板上霉菌数小于 30 105，其他指标有一项不符合，也可判为合格产品；
C产品有效活菌数及杂菌率符合指标，在水分、外观、pH值、细度等次要检测项目中，有 3项不符合技术指标，也判为合格产品。
8 3 2 不合格产品
a）产品有效活菌数不符合技术指标或投入菌种没有完全相应的检验出，判为不合格产品；
b）产品杂菌率超过本标准规定的两倍（液体 10%、固体 30%、冻干瓶 4%），判为不合格产品；
c）产品有效活菌数符合指标，杂菌率不符合指标，但小于本标准规定的两倍时 C液体10%、固体 30%、冻干瓶 4%），其他指标有两项不符合指标，判为不合格产品；
d）产品检验在马丁培养基平板上霉菌数#30 105，判为不合格产品；
e）产品水分、pH值、细度、外观等次要检测项目中，有 4项不符合技术指标，判为不合格产品。
8 3 3 含有植物促生根际细菌（PGPR）的固氮菌肥料产品检测时，只测固氮菌数量，不测
植物促生根际细菌的数量，也不视其为杂菌。
8 3 4 本标准中质量指标合格判断，采用 GB/T1250中修约值比较。
9 包装、标识、运输和贮存
9 1 包装
9 1 1 内包装
液体肥料小包装用塑料瓶或玻璃瓶，大包装用塑料桶。固体肥料用不透明聚乙烯塑料袋包装。冻干菌剂用玻璃指形管真空干燥。
9 1 2 外包装
外包装采用纸箱，纸箱质量应符合 GB/T6543的要求。箱外用尼龙打包带加固。
9 1 3 每箱（袋）产品中附有产品合格证和使用说明书，在使用说明中标明使用方法、用
量及注意事项。
9 2 标识
在包装箱（袋）上印有产品名称、商标、标准编号、肥料登记证号、生产单位、厂址、生产
日期、批号和净重，并印有防晒、防潮、防冻等标记，若有必要还要加印易碎、防倒置等标
记。内包装上有产品名称、商标、标准编号、肥料登记证号、有效菌含量、生产日期、有效
期、产品性能、使用说明书及生产单位、厂址等。
9 3 运输
适用于常用运输工具，运输过程中有遮盖物，防止雨淋、日晒及 35 以上高温。气温低于 0 时采取保温措施，防止菌肥冻冰。运输过程中轻装轻卸，避免包装破损。
9 4 贮存
产品贮存在阴凉、干燥、通风的库房内，最适温度为 10 ! 25 ，不得露天堆放，以防雨淋和日晒，避免冻冰及长时间 35 以上高温。
以上高温。
附 录 A
（标准的附录）
有效活菌数和杂菌（霉菌）测定的选择培养基
A1 固氮菌用阿须贝氏（Ashby）培养基
磷酸二氢钾（KH2PO4） 0
硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0
氯化钠（NaCl） 0
碳酸钙（CaCO3） 5
甘露醇（CsH14O6） 10
硫酸钙（CaSO4·2H2O） 0
pH 7 0
A2 固氮（茎瘤）根瘤菌培养基
乳酸钠（C3H3O3Na） 10
磷酸氢二钾（K2HPO4） 1
磷酸二氢钾（KH2PO4） 0
氯化钠（NaCl） 0
氯化钙（CaCl2） 0
氯化铁（FeCl3） 0
硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0
酵母膏 1
（或酵母粉 0
pH 6 8
A3 联合固氮菌培养基
D-葡萄糖酸钠（C6H11O7Na） 5
磷酸二氢钾（KH2PO4） 0
磷酸氢二钾（K2HPO4） 0
硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0
酵母膏 1
（或酵母粉 0
氯化钠（NaCl） 0
氯化钙（CaCl2） 0
氯化铁（FeCl3） 0
钼酸钠（Na2MoO4） 0
pH 6 8! 7 0
A4 马丁培养基（测霉菌数）
磷酸氢二钾（K2HPO4） 1
硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0
葡萄糖（C6H12O6·H2O） 10
蛋白胨 5
1%孟加拉红水溶液〔四氯四碘荧光素
（C20H4ClI
44O5）〕 3 3mL
每升培养基中加入 0
注 以上各培养基需蒸馏水 1000mL，琼脂 18!
附 录 B
（标准的附录）
染色剂和染色方法
B1 荚膜染色法
B1 1 染色剂
石碳酸复红染色液
甲液：碱性复红（Basicfuchsin）
（C20H20ClN3） 0
95%酒精（CH3CH2OH） 10 0mL
乙液：石碳酸（C6H5OH） 5
蒸馏水 95 0mL
a）将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入 95%酒精，继续研磨使之溶解，配成甲液。
b）将石碳酸溶解在蒸馏水中配成乙液。
c）把甲液和乙液混合摇匀，成为石碳酸复红，通常可将混合液稀释 5! 10倍使用。
稀释液易变质失效，一次不宜多配。
B1 2 染色方法
B1 2 1 取少量培养菌涂于载玻片水滴中，涂成薄层。
B1 2 2 自然干燥或稍加热。
B1 2 3 在石碳酸复红染 1min后，水洗，干后镜检。
B1 3 染色结果
菌体为红色，菌体周围有一层透明圈即为荚膜。
B2 芽胞染色法
B2 1 染色剂
B2 1 1 5%孔雀绿
孔雀绿（C23H25ClN2） 5
蒸馏水 100mL
B2 1 2 0 05%碱性复红
碱性复红（C20H20ClN3） 0
95%酒精 100mL
B2 2 染色方法
B2 2 1 制片。
B2 2 2 加孔雀绿染液3! 5滴于涂片处，酒精灯火焰加热至冒汽，但不沸腾，并随时补加
染液，维持涂片处不干，染色约 5! 10min。
B2 2 3 自来水冲洗 30s。
B2 2 4 用 0 05%碱性复红染色1min，水洗，镜检（若 0 05%碱性复红浓度太高，可根据
具体情况适当稀释）。
B2 3 染色结果
芽胞绿色，菌体红色。
B3 革兰氏染色法
B3 1 染色剂
B3 1 1 结晶紫染色液
甲液 结晶紫（C25H30ClN3·9H2O） 2
乙醇（95%）
（CH3CH2OH） 20mL
乙液：草酸铵〔（NH4）2C2O4·H2O〕 0
蒸馏水 80mL
甲、乙液相混，静置 48h后使用。
B3 1 2 卢哥（Lugol）氏碘液
碘（I2）片 1
碘化钾（KI） 2
蒸馏水 300mL
先用少量（3! 5mL）蒸馏水溶解碘化钾，再投入碘片，待碘全溶后，加水 100mL，配成母
液，使用时加两倍水，稀释成卢哥氏碘液。
B3 1 3 脱色液：95%乙醇。
B3 1 4 复染液：0 5%的番红水溶液
2 5%番红酒精溶液 10mL
蒸馏水 100mL
B3 2 染色方法
B3 2 1 制片。
B3 2 2 滴加结晶紫液，覆盖 1min。
B3 2 3 用水冲净结晶紫液。
B3 2 4 滴加碘液冲去残水，并覆盖 1min。
B3 2 5 用水冲去碘液，用吸水纸吸去水分。
B3 2 6 加 95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30s后水洗，吸去水分。
B3 2 7 番红染色液染 10s后，自来水冲洗。干燥，镜检。
B3 3 染色结果
革兰氏正反应菌体呈紫色，负反应菌体呈红色。
B4 鞭毛染色
B4 1 染色剂
甲液：丹宁酸（C76H52O46） 5
氯化铁（FeCl3） 1
甲醛（15%）
（HCHO） 2 0mL
氢氧化钠（NaOH）
（1%） 1 0mL
蒸馏水 100mL
乙液：硝酸银（AgNO3）
蒸馏水 100mL
待硝酸银溶解后，取出 10mL备用，其余的 90mL硝酸银液中滴加浓氢氧化铵，则形成很浓厚的沉淀，再继续滴加氢氧化铵到刚刚溶解沉淀成为澄清溶液为止。再将备用的硝酸银慢慢滴人，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，再滴入硝酸银，直到摇动后，仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止（如雾重，则银盐沉淀出，不宜使用）。
B4 2 染色方法
4 2 1 涂片：在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，用接种环挑取斜面上少许菌苔，在载玻片的水滴中轻蘸几下。将玻片稍倾斜，使菌液随水滴缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥B4 2 2涂片干燥后，滴加甲液染3! 5min，用蒸馏水冲洗。加乙液染30! 60s，并在酒精灯上加热，使其稍冒蒸气而染液不干，然后用蒸馏水冲洗，干后镜检。
B4 3 染色结果
菌体为深褐色，鞭毛为褐色。
附 录 C
（标准的附录）
菌种固氮效能测定方法
在 500mL三角瓶中加入 100mL无氮培养基（含糖 1%即
30 培养 5! 7d后，取出定糖测氮。
定糖采用蒽酮光电比色法。
测氮采用半微量光电比色法。
C1 蒽酮光电比色法
C1 1 测定原理
糖类遇硫酸即脱水成为醛类，再变成呋喃衍生物，后者与蒽酮缩合，生成蓝绿色化合物。于 580! 650nm处进行比色测定（蒽酮可与单糖、双糖、淀粉、糊精等反应），该方法适
合于含糖量 0 003%以上的样品。
C1 2 试剂和仪器
分析中除有说明外，限用分析纯试剂和 GB/T6682中规定的三级水。
C1 2 1 硫酸。
C1 2 2 0 2%（m/V）蒽酮溶液：称取 0
该溶液不稳定，应当天配用。
C1 2 3 葡 萄 糖 标 准 液：准 确 称 取 葡 萄 糖 1
1 000mg/mL标准液。
C1 2 4 分光光度计。
C1 3 分析步骤
C1 3 1 试样处理
取发酵培养的菌液 1 00! 4 00mL（取决于含糖量），稀释至 100 00ml，取此稀释液1 00mL于比色管中，加水至 2 00mL，每管加入蒽酮试剂 4 00mL，摇匀，水浴加热 15min，使之充分显色，冷却后，于 580! 650nm处进行比色测定，记录吸光度，同时进行空白试验。
C1 3 2 标准曲线绘制
吸取葡萄糖标准溶液 1 00、2 00、4 00、6 00、8 00、10 00、20 00mL。于 100mL容量瓶
中，加水至刻度，该液分别含糖 10、20、40、60、80、100、200%g/mL。
吸取 1.00mL放入比色管中，加水至 2.00mL，按 C
C1 4 分析结果的计算
100mL溶液的含糖量（ X）按式（C1）计算：
X=（m1-m2） 100
m 100 10-6…………………………（1）
式中：m1———标准曲线上查出的试验含糖量，%g/mL；
m2———标准曲线上查出的空白试验的含糖量，%g/mL；
m———吸取发酵溶液体积，mL。
C1 5 允许差
a）取平行测定的算术平均值为测定结果；
b）平行测定结果的允许差不大于 0
C2 固氮菌液全氮比色测定法
C2 1 测定原理
在硫酸铜或硫酸钾存在下，浓硫酸中加入菌液，并加热使试样全部有机氮转化为氨态氮，与奈氏试剂反应，于波长 420nm处进行比色测定。
C2 2 试剂和仪器
分析中除非另有说明，限用分析纯试剂和 GB/T6682中规定的三级水。
C2 2 1 硫酸（GB/T625）。
C2 2 2 双氧水
C2 2 3 氢氧化钠（GB/T629）2mol/L溶液：称量
C2 2 4 40%（m/V）氢氧化钠（GB/T629）溶液：称取
C2 2 5 50%（m/V）酒石酸钾钠溶液：
C2 2 6 奈氏试剂：7
70mL水中，冷却后将前一溶液缓缓倒入氢氧化钠溶液中，边加边搅拌，最后用水稀释至100mL，静置过夜，取清液储于棕色瓶中。
C2 2 7 催化剂：100
C2 2 8 分光光度计。
C2 3 分析步骤
C2 3 1 试样制备和测试
吸取固氮菌液 1 00mL于 30mL消化管中，加硫酸（C2 2 1）3mL，加 0
C2 3 2 标准曲线的绘制
准确称取在（105 5） 烘 1h直至恒重的优级纯试剂硫酸铵 0
100mL，该液含氮 1mg/mL，取此液 0 05、0 10、0 25、0 50、1 00、2 00mL。放入 100mL容量瓶，用水稀释至刻度，其含氮分别为 0 50、1 00、2 50、5 00、10 00、20 00/%g/mL，取标准液各 1mL放入比色管中，加水至 2mL，按 C1 3 1方法测定，记录吸光度。
用标准液的氮含量为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制工作曲线。
C2 4 分析结果的计算
氮（ X）含量以 g/100mL表示，按式（C2）计算
X=（m1-m2） 1000
m 100 10-6………………………（ C2）
式中 m1———标准曲线上查出的试验含氮量，%g/mL；
m2———标准曲线上查出的空白试验氮含量，%g/mL；
m———吸取发酵溶液体积，mL。
C2 5 允许差
a）取平行测定和算术平均值为测定结果；
b）平行测定结果的允许差不大于 0
